凝膠電泳分離血清脂蛋白及其量化檢測的新方法
2023-12-05 17:56:31
專利名稱：凝膠電泳分離血清脂蛋白及其量化檢測的新方法
技術領域：
本發明凝膠電泳分離血清脂蛋白及其量化檢測的新方法，涉及有效表達血清脂蛋白代謝平衡狀態的實用方法，廣泛用於醫學檢測及研究。
背景技術：
血清脂蛋白具有特殊的顆粒結構，其組成複雜而不均一，在代謝過程中不斷按序演變和物質交換，通常處於協調的動態平衡狀態。異常脂蛋白血症與心腦血管病的關係密切，臨床上非常重視。多年來檢測血清脂蛋白的方法不斷改進，如梯度凝膠電泳，但臨床上一直缺乏有效表達血清脂蛋白代謝平衡狀態的實用方法。主要存在三個問題一、由於不同種類血清脂蛋白的顆粒特性差異懸殊，使單一方法的實驗條件難以兼顧，同步表達它們的能力弱，通常採用相互分立的方法分別進行檢測。二、由於分析過程的參比系不統一，使分別測定的結果不能放在統一的血清脂蛋白整體中比較其相互聯繫。三、由於實驗條件要求較高，如穩定的線性濃度梯度，難以適應臨床檢驗工作的需要。
目前國內外研究現狀
第一、血脂因素的孤立分析冠心病的病理基礎是動脈粥樣硬化，血脂異常是其關鍵的危險因素。表達血脂狀態的指標很多，臨床常用的有甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，以及載脂蛋白(Apo)和脂蛋白(a)[Lp(a)]等。從孤立的血脂因素進行分析，臨床現狀不容樂觀。人們的平均血脂水平隨生活水平的提高而有明顯升高趨勢。2001年調查發現我國94.9％冠心病伴高脂血症患者未能得到理想的血脂控制。部分患者的血脂水平始終不高，或者即使將血脂控制在合適範圍，也難以阻止其冠脈病變發展進程。因此，理論上難以從孤立的血脂因素來解釋患者的發病機制。存在如下一些問題(一)忽視了血清脂蛋白顆粒結構的完整性，血清脂蛋白在保持完整顆粒結構的前提下發揮其生理功能。不同種類脂蛋白的構成有明顯差異。臨床常用血脂指標只是籠統的表達，並不能反映它們在各種脂蛋白中的具體含量。孤立因素如膽固醇(Chol)並不能反映脂蛋白顆粒的全貌。同樣是Chol卻有好壞之分，其實質為攜帶之脂蛋白(如HDL和LDL)的顆粒特性有別。若脂蛋白顆粒發生異常，將Chol運輸和堆積到不應該的部位(如巨噬細胞內和血管壁)，從而導致病理改變。(二)忽視了血清脂蛋白代謝的整體性，血清脂蛋白的組成複雜而不均一，其代謝通常處於協調的平衡狀態。因缺乏量化表達的有效指標，調脂治療尚未從調節血清脂蛋白代謝的整體角度著手，而局限於降低TG、TC、LDL-C和升高HDL-C等分立指標上。(三)忽視了血清游離脂肪酸(FFA)，由於脂肪酸不溶於水，整個細胞外游離脂肪酸(FFA)的運輸過程主要靠非酯化脂肪酸清蛋白(AL-NEFA)來完成。AL-NEFA參與血脂代謝，具有重要的生物學意義，直接影響血小板、粒性白細胞的功能以及某些酶促活性。但臨床血脂檢驗基本忽視了本屬於血脂範疇的FFA或AL-NEFA成分。(四)針對HDL的認識和措施有限，HDL通過膽固醇逆轉運(RCT)途徑將外周細胞內多餘的Chol轉運至肝臟或固醇代謝器官，對防治動脈粥樣硬化有意義。但對HDL亞組分顆粒特性的認識有限，臨床上尚缺乏有顯效升高HDL的措施，亟待解決。研究HDL亞組分，尋找調節RCT的新藥物，是臨床血脂研究發展的一大趨勢。
第二、血脂因素的組合分析，由於以往孤立分析有局限性，臨床血脂研究逐漸往橫向發展，出現多個因素的組合分析，如「脂譜」和「脂蛋白譜」，試圖從多因素的角度綜合評價血脂代謝狀態。其中倍受關注的是「致動脈粥樣硬化性脂蛋白譜」(ALP)，它是指有一定遺傳基礎的幾種代謝異常的綜合，主要表現sLDL增多，高TG血症及低HDL-C，常伴有胰島素抵抗為基礎的代謝症候群。這些「譜」是多指標的組合，各項指標之間來源不同，單位有別，不具備「光譜」、「電泳譜」等有嚴謹科學含義的「譜」的特徵。孤立指標組合所表達的仍然是血脂代謝的某些因素，並不能表達血清脂蛋白平衡狀態的整體概貌。(一)理論認識方面(1)血液中散布的有形成分有紅白細胞、血小板、脂蛋白和更細微的物質。它們在形態上逐漸由大到小，由細胞向非細胞過渡。血清脂蛋白具有特殊的顆粒結構，組成複雜而不均一，發揮著重要的生理功能。我們認為，血清脂蛋白是一組非細胞形態的結構和功能單位。臨床分析應重視它們顆粒結構的完整性，而非局限於局部組成因素。(2)血清中不同種類脂蛋白顆粒的結構和功能存在明顯差異，相互之間時刻進行著脂質和Apo的轉移或交換。血清各種脂蛋白顆粒都有各自生成、發展和消亡的過程，其代謝受多種功能蛋白的調節而處於複雜而有序的平衡狀態，維持著各自質與量的相對穩定，並隨時間變化而動態改變，稱為血清脂蛋白動態平衡。這種動態平衡失調是血脂異常的一種表現形式，可能是導致疾病發生和發展的一個重要環節。調脂治療應注重整體，試以調節血清脂蛋白動態平衡為關鍵，而非局限於降低或升高局部因素。(二)以往方法學存在的主要問題有(1)分離方法相互分立式，難以進行同步分離。由於不同種類血清脂蛋白的顆粒特性差異懸殊，使電泳條件的設置難以兼顧，同步表達能力差。(2)分析方法無統一參比，不能進行統一比較。由於忽略了「參比系惟一性」的實驗原則，使測定結果缺乏相互可比性，對血清脂蛋白代謝平衡狀態無法統一地進行總體評估。我們從整體的角度探索改良方法的途徑，為此，提出新的技術方案。
發明內容
本發明目的在於，提供一種凝膠電泳分離血清脂蛋白的方法，並對其進行量化檢測的分析，以同步和量化表達血清脂蛋白整體的平衡關係，而非局限於某些組分或亞組分。
本發明的目的通過下述方案實現一種凝膠電泳分離血清脂蛋白方法，以三種不同濃度的分段聚丙烯醯胺凝膠作為電泳載體，在電泳槽中形成溫度梯度，對血清脂蛋白及其亞組分做同步電泳分離，其中，所述的聚丙烯醯胺凝膠作為分離膠濃度分別為分離膠1為3.0％；分離膠2為3.6％；分離膠3為7.0％。本發明建立了分段濃度聚丙烯醯胺凝膠電泳(sd-PAGE)的新方法，該法以三種不同濃度的分段聚丙烯醯胺凝膠作為電泳載體，利用非線性濃度梯度來調控不同分離膠的分子篩大小，使之分別與不同顆粒大小的脂蛋白相匹配。
電泳方法的結果是將蘇丹黑B預染的血清同步分離出11-12條清晰區帶，按序先後為前清蛋白(pre-AL)、非酯化脂肪酸清蛋白(AL-NEFA)、高密度脂蛋白1-5(HDL1-5)、低密度脂蛋白(LDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、極低密度脂蛋白1-2(VLDL1-2)以及在原點區內可能滯留的乳糜微粒(CM)。
在上述方案基礎上，對凝膠電泳分離血清脂蛋白方法進行量化檢測，即電泳結束立即取下凝膠管，用雙波段飛點掃描儀和光學掃描儀分別對凝膠管進行掃描和成像，飛點掃描單色光波長為604nm，以空白凝膠為統一參比，掃描時沿凝膠管的中央軸線，從空白區向原點的方向進行，分析時以相鄰電泳峰之間的拐點作為分段標誌，儀器自動算出各電泳峰下面積佔血清脂蛋白整體的百分含量，血清脂蛋白及其亞組分的掃描圖譜和量化結果製成血清脂蛋白譜。其掃描圖譜和定量數據稱之為血清脂蛋白譜(SLPG)，直觀而具體地表達各種血清脂蛋白的相對含量，理想地表達了它們在血清代謝中的相互平衡關係。SLPG各項指標的檢測穩定性好，批內變異係數(CV)為1.20％-6.54％。
本發明優越性在於操作簡便，性能優越，應用前景良好，在技術和性能上克服以往技術難題，達到了以往方法所不能達到的效果。本發明成功建立了sd-PAGE新方法和SLPG新指標，效果理想。就「譜」的特徵，SLPG與目前孤立指標組合的「譜」有本質區別。通過建立本發明方法，實現了血脂脂蛋白的整體分析--血清脂蛋白代謝動態平衡。
圖1.sd-PAGE分離血清脂蛋白及其亞組分圖例圖2.性能比較SLPG與其它同類研究的檢測圖例圖3.基礎驗證SLPG電泳峰對應各種脂蛋白的顆粒大小和Apo/Cho圖4.不同血脂狀態下的SLPG有規律表現具體實施方式
一、試劑1、貯存液A丙烯醯胺(Acr)9.60g和甲叉雙丙烯醯胺(Bis)0.25g，溶於去離子蒸餾水(DDI H2O)至100ml，過濾後用棕色瓶存於4℃，使用3個月。
2、貯存液B三羥甲基氨基甲烷(Tris)18.3g和1.0M鹽酸24ml，溶於DDI H2O至100ml，pH8.8，過濾後用棕色瓶存於4℃。
3、貯存液CAcr 19.6g和Bis 0.4g，溶於DDI H2O至100ml，過濾後用棕色瓶存於4℃，使用3個月。
4、貯存液DTris 6.06g和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)1.17g，溶於DDI H2O至100ml，pH8.8，過濾後用棕色瓶存於4℃。
5、引發劑過硫酸銨(APS)1.0g溶於DDI H2O至10ml，使用即時配製。
6、染色液蘇丹黑(SB-B)0.25g溶於異丙醇25ml，37℃水浴過夜，趁熱過濾，室溫下保存在密封的棕色瓶內。使用前37℃水浴45分鐘。
7、電泳緩衝液Tris 6.0g和甘氨酸28.8g溶於DDI H2O至1000ml，貯存於4℃，使用時用DDI H2O稀釋10倍。
二、方法1、血清預染 人血清來自上海市中山醫院檢驗科。採集隔夜空腹靜脈全血，3小時內離心分離出血清。取血清100μl加染色劑1％SB-B液10μl，振蕩混勻後置37℃水浴45min，離心後待測。離心條件為3000rpm，10分鐘。
2、分段凝膠電泳 準備潔淨的12支管狀玻璃管，規格為內徑6mm，外徑8mm，長度10cm。用封口膜密封玻璃管一端開口，並將其垂直固定在制膠支架上。按照表1逐步製備高度分別為4.5cm、4.0cm和0.6cm的三層不同濃度的凝膠，每層凝膠在灌膠後立即輕輕注入100μl DDIH2O覆蓋其表面，使膠面凝聚平整。靜置30分鐘後去掉水層，再灌注下一層凝膠液。將製備好的凝膠管垂直置入圓盤電泳槽(DYY-III27A，北京六一電泳儀器廠)，使分離凝膠1的下界與負極槽底面平齊。分別向正負極電泳槽內注入電泳緩衝液(正極槽600ml，負極槽400ml)。接著，將預染血清(50μl/管)緩慢地加入凝膠管內，覆蓋在分離凝膠3的表面。最後，接通穩壓電源(Model 1000/500，Bio-Rad)，100V電泳2.5h。
表1.分段濃度凝膠的製備分離膠3分離膠2分離膠1試劑(T7.0％，C3.0％) (T3.6％，C2.0％) (T3.0％，C2.0％)貯存液(ml) A13.70 C3.00C0.75貯存液(ml) B2.40D2.00D0.60DDI H2O(ml) 3.10 11.50 3.60TEMED(μl) 10.00 10.00 5.0010％APS(μl) 100.00 100.00 50.00總量(ml) 19.31 16.61 5.005其中四甲基乙二胺(TEMED)去離子蒸餾水(DDI H2O)過硫酸銨(APS)3、電泳區帶的掃描與量化 電泳結束立即取下凝膠管，用雙波段飛點掃描儀(CS-9000，Shimadzu)和光學掃描儀(PowerLook III，UMAX)分別對凝膠管進行掃描和成像。飛點掃描單色光波長為604nm，以空白凝膠為統一參比。掃描時沿凝膠管的中央軸線，從空白區向原點的方向進行。分析時以相鄰電泳峰之間的拐點作為分段標誌，儀器自動算出各電泳峰下面積佔血清脂蛋白整體的百分含量。血清脂蛋白及其亞組分的掃描圖譜和量化結果稱為血清脂蛋白譜(SLPG)。
三、結果1、血清脂蛋白電泳區帶的命名和表現見圖1.sd-PAGE分離血清脂蛋白及其亞組分圖例和圖2.性能比較SLPG與其它同類研究的檢測圖例所示
sd-PAGE法將SB-B預染血清同步電泳分離出11-12條區帶。按先後次序分別命名為血清前清蛋白(pre-AL)、非酯化脂肪酸清蛋白(AL-NEFA)、高密度脂蛋白1-5(HDL1-5)、低密度脂蛋白(LDL)、中間低密度脂蛋白(IDL)、極低密度脂蛋白1-2(VLDL1-2)。原點區出現類似的電泳峰，若界面凹陷，峰頂出現平臺，寬度＞3mm，則認為存在乳麋微粒(CM)。在分離膠2、3的界面位置出現先負後正的小波，是界面折射而成的偽帶，不納入血清脂蛋白的範疇。
在分離膠3中，pre-AL和AL-NEFA泳動最快，有明顯的SB-B著色。HDL1呈獨立的圓弧小峰，HDL2-5呈基部相連的指狀峰，通常HDL3或HDL4為主峰，HDL2和HDL5峰較低。在分離膠2中，LDL呈高大的鐘形峰。根據電泳峰的特點，LDL通常有3種表現型①慢遷移型，後支出現明顯脫尾；②快遷移型，區帶明顯前移；③中間型，分帶較窄，前後對稱。IDL電泳遷移在LDL和VLDL之間，呈孤立峰，其含量個體差異明顯。VLDL有2種亞組分，VLDL1泳動較快，進入分離膠2，峰形高尖。在分離1中，VLDL2區帶著色分布較均勻，峰形平坦。
圖1中，電泳方向由上至下。泳道#1，2、#3，4和#5，6為重複實驗。左側為示意圖。HDL有5種亞組分，HDL1呈孤立分帶。VLDL有2種亞組分。LDL有3種電泳表現型①分帶明顯拖尾，②分帶明顯前移，③分帶較窄。
2、定量檢測血清脂蛋白及其亞組分的重複性sd-PAGE法分離血清蛋白及其亞組分後量化分析SLPG各指標的的批內變異(CV)分別為AL-NEFA2.79％，HDL16.54％，HDL25.14％，HDL34.06％，HDL45.89％，HDL56.03％，Total HDL2.36％，LDL1.20％，IDL4.81％，VLDL13.74％，VLDL25.58％。
在圖2性能比較SLPG與其它同類研究的檢測圖例中，圖2(a)對應圖1中#1泳道的SLPG圖例，各電泳區帶在對應遷移位置出現電泳峰，HDL1電泳峰相對孤立。SLPG可統一量化出各種血清脂蛋白的相對含量，直觀而具體地表達了它們之間的平衡關係。(b)美國Quantimetrix公司開發的Lipoprint系統檢測圖例(http//www.4qc.com)，示LDL被分離出7種亞組分，但未見電泳峰分別與之對應。解析圖譜時各亞組分的分段位置並未按電泳峰谷來界定，且忽略了HDL和AL-NEFA。其中彩色和虛線分別表示異常和正常情況。其應用研究已發表於專業雜誌，受到關注，但售價高。相比之下，SLPG檢測新法具有明顯的性能優勢和應用前景。
本發明的技術特點一、分段的非線性濃度梯度由於聚丙烯胺凝膠濃度大小決定凝膠的交聯程度，直接決定凝膠分子篩孔徑的大小，從而影響電泳分離血清脂蛋白的解析度，因此，合適的濃度設置是提高分離效果的重要條件之一。本發明一改以往單一濃度和連續濃度梯度的做法，設置3段不同濃度3.0％、3.6％和7.0％的凝膠組合，構成大落差的非連續的濃度梯度。一方面讓顆粒特性差異不大的脂蛋白，如HDL亞組分，在同一濃度膠中分離。另一方面，可為顆粒特性差異懸殊的脂蛋白，如HDL、LDL和VLDL2等，在各自合適的濃度膠中分離。結果sd-PAGE將血清脂蛋白在同一時間、同一載體中同步分離開，AL-NEFA和HDL在分離膠3，LDL、IDL和VLDL1在分離膠2，VLDL2在分離膠1中分離成清晰的區帶，CM留在原點內。
目前分離血清脂蛋白亞組分的電泳方法常採用連續濃度梯度凝膠為載體，濃度高達16％或30％，要求電壓增至數千伏，電泳時間長達數十小時，結果對血清各種脂蛋白的同步分離效果並不理想。相比之下，sd-PAGE技術要求電壓低(100V)，分離時間短(2.5h)，達到較滿意的同步分離效果，滿足臨床檢驗工作的需要。
二、統一參比的量化分析方法國內外臨床血脂研究大多通過分項檢測後進行綜合分析和診斷。sd-PAGE法以電泳後脂蛋白未到達的空白區作為參比，與所有泳動峰下面積的總和進行統一比較，算出各電泳區帶的相對含量，使它們之間具有科學的可比性，符合現代實驗學參比系唯一性的原則。通過掃描圖譜和量化數據，可以直觀而具體地觀察血清脂蛋白整體的代謝平衡狀態。
三、操作技巧1、管狀玻璃管的規格要求內徑6mm，外徑8mm，長度10cm，透光好，可見光掃描不發生折射。
2、製備凝膠前用封口膜密封玻璃管一端開口，並將其垂直固定在制膠支架上。
3、逐步製備三層不同濃度的凝膠，分離膠的高度分別為4.5cm、4.0cm和0.6cm。
4、每層凝膠在灌膠後立即輕輕注入100μl DDI H2O覆蓋其表面，一圖(a，b)橫坐標和圖(c)中的序號1～10表示按電泳遷移快慢的順序，依次編號的各種血清脂蛋白及其亞組分，分別對應圖(c)中SLPG相應的電泳峰。1AL-NEFA；2HDL1；3HDL2；4HDL3；5HDL4；6HDL5；7LDL；8IDL；9VLDL1；10VLDL2.
SLPG能同步表達①AL-NEFA中游離脂肪酸(FFA)佔整體血脂的相對含量，正常者大於3.0％。②HDL及其亞組分相對含量的關係，以及3種類型的HDL異常HDL1含量降低；HDL總量降低；HDL各亞組分相對含量大小的序列紊亂，包括HDL2或HDL5含量增高。③3種LDL不同表現型及其含量，反映其組成的異質性。④IDL的相對位置和含量，能夠鑑別診斷高脂蛋白血症的IIb型和III型，以及是否合併IV型或I型。⑤SLPG表達VLDL亞組分的相對含量。⑥SLPG表達CM存在與否，並將其包括在內進行統一量化表達。
SLPG表達高脂血症患者的血清脂蛋白代謝狀態。高Chol血症(TC＞220mg/dl)的SLPG表現LDL和/或IDL含量增高。高TG血症(TG＞150mg/dl)的SLPG主要表現VLDL含量增高。若血清TG明顯增高(＞300mg/dl)，則原點增寬(＞3mm)，常出現CM。混合性高脂血症的SLPG主要表現IDL和/或VLDL含量增高，或出現CM。
SLPG表達異常脂蛋白血症患者的的血清脂蛋白代謝狀態。I型高脂蛋白血症的血清電泳後在原點內可出現大量染色物質滯留，水平界面變成弧形凹陷，SLPG原點區出現平臺樣峰，提示存在CM。IIa型高脂蛋白血症的SLPG表現LDL含量增高；IIb型高脂蛋白血症的SLPG則以LDL和VLDL增高為特徵，IDL含量正常。III型高脂蛋白血圖(a，b)橫坐標和圖(c)中的序號1～10表示按電泳遷移快慢的順序，依次編號的各種血清脂蛋白及其亞組分，分別對應圖(c)中SLPG相應的電泳峰。1AL-NEFA；2HDL1；3HDL2；4HDL3；5HDL4；6HDL5；7LDL；8IDL；9VLDL1；10VLDL2.
SLPG能同步表達①AL-NEFA中游離脂肪酸(FFA)佔整體血脂的相對含量，正常者大於3.0％。②HDL及其亞組分相對含量的關係，以及3種類型的HDL異常HDL1含量降低；HDL總量降低；HDL各亞組分相對含量大小的序列紊亂，包括HDL2或HDL5含量增高。③3種LDL不同表現型及其含量，反映其組成的異質性。④IDL的相對位置和含量，能夠鑑別診斷高脂蛋白血症的IIb型和III型，以及是否合併IV型或I型。⑤SLPG表達VLDL亞組分的相對含量。⑥SLPG表達CM存在與否，並將其包括在內進行統一量化表達。
SLPG表達高脂血症患者的血清脂蛋白代謝狀態。高Chol血症(TC＞220mg/dl)的SLPG表現LDL和/或IDL含量增高。高TG血症(TG＞150mg/dl)的SLPG主要表現VLDL含量增高。若血清TG明顯增高(＞300mg/dl)，則原點增寬(＞3mm)，常出現CM。混合性高脂血症的SLPG主要表現IDL和/或VLDL含量增高，或出現CM。
SLPG表達異常脂蛋白血症患者的的血清脂蛋白代謝狀態。I型高脂蛋白血症的血清電泳後在原點內可出現大量染色物質滯留，水平界面變成弧形凹陷，SLPG原點區出現平臺樣峰，提示存在CM。IIa型高脂蛋白血症的SLPG表現LDL含量增高；IIb型高脂蛋白血症的SLPG則以LDL和VLDL增高為特徵，IDL含量正常。III型高脂蛋白血症的血清電泳在以往闊β帶的位置出現中間帶，SLPG表現IDL含量明顯增高。IV型高脂蛋白血症的SLPG特徵是VLDL明顯增高，表現3種類型①VLDL1含量增高；②VLDL2含量增高；③VLDL1和VLDL2含量均增高。V型高脂蛋白血症的SLPG表現VLDL含量增高，並出現CM。
圖4.不同血脂狀態下的SLPG有規律表現，圖中異常情況用不同顏色標記，紅色表示含量，增高，藍色表示含量降低。1AL-NEFA；2HDL1；3HDL2；4HDL3；5HDL4；6HDL5；7LDL；8IDL；9VLDL1；10VLDL2；11CM。
表2.圖4中不同血脂狀態的SLPG檢測結果SLPG A B C D E FGHAL-NEFA(％) 5.05 4.20 3.80 3.16 1.22 2.00 1.57 1.76HDL1(％)1.24 0.91+1.20 0.51+0.55+1.68 1.97 1.72HDL2(％)8.60 1.62 6.96 0.86 0.93 3.31 4.61 3.20HDL3(％)15.10 2.15 15.02 2.17 2.41 6.75 3.87 10.15HDL4(％)21.86 7.43 6.15 2.48 6.72 3.50 2.78 8.11HDL5(％)2.31 8.66 4.25 7.05 14.03 2.92 4.36 2.61HDL總量(％) 49.11 20.77 33.58 13.07 24.64 18.1617.5925.79HDL亞組分序列- + - + + -+-LDL(％) 36.91 39.96 50.55+50.16+35.37 39.8227.7336.27IDL(％) 1.73 3.82 2.94 2.99 18.27+7.09 10.00+5.95VLDL1(％) 7.17 20.40 8.26 25.60+17.86 27.05+31.31+16.80VLDL2(％) 0 1.47 0.85 4.71+2.64 5.88+11.78+3.58+CM(％) 0 9.36+0 0 0 0 09.82++異常；-正常.
權利要求
1.一種凝膠電泳分離血清脂蛋白方法，以三種不同濃度的分段聚丙烯醯胺凝膠作為電泳載體，在電泳槽中形成溫度梯度，對血清脂蛋白及其亞組分做同步電泳分離，其中，所述的聚丙烯醯胺凝膠作為分離膠濃度分別為分離膠1為3.0％；分離膠2為3.6％；分離膠3為7.0％。
2.根據權利要求1所述的凝膠電泳分離血清脂蛋白方法，其特徵在於所述的對血清脂蛋白及其亞組分做同步電泳分離方法，是先將血清預染，系用蘇丹黑B預染的血清同步分離出11-12條清晰區帶，按序先後為前清蛋白、非酯化脂肪酸清蛋白、高密度脂蛋白1-5、低密度脂蛋白、中間密度脂蛋白、極低密度脂蛋白1-2以及在原點區內可能滯留的乳糜微粒。
3.根據權利要求1或2所述的凝膠電泳分離血清脂蛋白方法，其特徵在於對血清脂蛋白及其亞組分做同步電泳分離的步驟，第一，先作血清預染，採集隔夜空腹靜脈全血，3小時內離心分離出血清，取血清100μl加染色劑1％SB-B液10μl，振蕩混勻後置37℃水浴45min，離心條件為3000rpm，10分鐘，後待測；第二，分段凝膠電泳，準備潔淨的管狀玻璃管，用封口膜密封玻璃管一端開口，並將其垂直固定在制膠支架上，逐步製備高度分別為4.5cm、4.0cm和0.6cm的三層不同濃度的凝膠，每層凝膠在灌膠後立即輕輕注入蒸餾水覆蓋其表面，使膠面凝聚平整，靜置30分鐘後去掉水層，再灌注下一層凝膠液，將製備好的凝膠管垂直置入電泳槽，使分離凝膠的下界與負極槽底面平齊，分別向正負極電泳槽內注入電泳緩衝液，其中，正極槽600ml，負極槽400ml，接著，將預染血清緩慢地加入凝膠管內，覆蓋在分離凝膠3的表面，最後，接通穩壓電源100V電泳2.5h。
4.根據權利要求1所述的凝膠電泳分離血清脂蛋白方法，其特徵在於所述的分離膠1中貯藏液C0.75ml、D0.60ml、蒸餾水3.60ml、四甲基乙二胺5.00μl、10％過硫酸銨50.00μl；分離膠2中貯藏液C3.00ml、D2.00ml、蒸餾水11.50ml、四甲基乙二胺10.00μl、10％過硫酸銨100.00μl；分離膠3中貯藏液A13.70ml、B2.40ml、蒸餾水3.10ml、四甲基乙二胺10.00μl、10％過硫酸銨100.00μl，其中，所述的貯存液A為丙烯醯胺9.60g和甲叉雙丙烯醯胺0.25g，溶於去離子蒸餾水至100ml，過濾後用棕色瓶存於4℃，使用3個月；貯存液B為三羥甲基氨基甲烷18.3g和1.0M鹽酸24ml，溶離子蒸餾水至100ml，pH8.8，過濾後用棕色瓶存於4℃；貯存液C丙烯醯胺19.6g和甲叉雙丙烯醯胺0.4g，溶於去離子蒸餾水至100ml，過濾後用棕色瓶存於4℃，使用3個月；貯存液D三羥甲基氨基甲烷6.06g和乙二胺四乙酸二鈉1.17g，溶於去離子蒸餾水至100ml，pH8.8，過濾後用棕色瓶存於4℃；引發劑過硫酸銨1.0g溶於去離子蒸餾水至10ml，使用即時配製；染色液蘇丹黑0.25g溶於異丙醇25ml，37℃水浴過夜，趁熱過濾，室溫下保存在密封的棕色瓶內，使用前37℃水浴45分鐘；電泳緩衝液三羥甲基氨基甲烷6.0g和甘氨酸28.8g溶於去離子蒸餾水至1000ml，貯存於4℃，使用時用去離子蒸餾水稀釋10倍。
5.利用權利要求1凝膠電泳分離血清脂蛋白方法進行量化檢測方法，電泳結束立即取下凝膠管，用雙波段飛點掃描儀和光學掃描儀分別對凝膠管進行掃描和成像，飛點掃描單色光波長為604nm，以空白凝膠為統一參比，掃描時沿凝膠管的中央軸線，從空白區向原點的方向進行，分析時以相鄰電泳峰之間的拐點作為分段標誌，儀器自動算出各電泳峰下面積佔血清脂蛋白整體的百分含量，血清脂蛋白及其亞組分的掃描圖譜和量化結果製成血清脂蛋白譜。
全文摘要
本發明凝膠電泳分離血清脂蛋白及其量化檢測的新方法，涉及有效表達血清脂蛋白代謝平衡狀態的實用方法，廣泛用於醫學檢測及研究。本發明一種凝膠電泳分離血清脂蛋白方法，以三種不同濃度的分段聚丙烯醯胺凝膠作為電泳載體，在電泳槽中形成溫度梯度，對血清脂蛋白及其亞組分做同步電泳分離，其中，所述的聚丙烯醯胺凝膠作為分離膠濃度分別為分離膠1為3.0％；分離膠2為3.6％；分離膠3為7.0％。本發明達到了以往方法所不能達到的效果，具有操作簡便、性能優越、應用前景良好的特點，在技術和性能上克服以往技術難題，成功建立了sd－PAGE新方法和SLPG新指標，效果理想。實現了血脂脂蛋白的整體分析－血清脂蛋白代謝動態平衡。
文檔編號C07K1/26GK1699406SQ200510026460
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月3日 優先權日2005年6月3日
發明者陳允欽, 尹恝 申請人:陳允欽, 尹恝