香豆素標記雷公藤內酯醇及其製備方法和應用的製作方法
2023-12-05 17:57:41
專利名稱：香豆素標記雷公藤內酯醇及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥技術領域，具體涉及一種香豆素標記雷公藤內酯醇及其制
備方法和應用。
二.
背景技術：
衛矛科雷公藤屬雷公藤的根部提取物作為傳統中藥，用於治療免疫性疾病，比 如風溼性關節炎、腎炎、全身性紅斑狼瘡等已經有了幾千年的歷史。其中一種二萜類的 化合物雷公藤內酯醇，英文triptolide。是該提取物的主要活性成分。雷公藤內酯醇的化 學分子式為C2。H2406，分子量為360。目前，它的全合成已經獲得成功。作為一種免疫 抑制藥物，雷公藤內酯醇具有很好的抗炎、抗腫瘤及抗生育作用，可應用於許多自身免 疫性疾病的治療，最近又顯示其在器官移植抗排斥反應方面具有廣闊的應用前景。
雷公藤內酯醇作為一種藥物，目前採用同位素標記的方法來研究其分子的細胞
定位，但是同位素標記方法需要特殊實驗條件，同時具有同位素汙染產生，對實驗人員 也有傷害。由於目前實驗手段的局限性，雷公藤內酯醇的細胞定位和分子靶點尚未明 確。4-溴甲基-7-甲氧基香豆素與酸容易形成相應的酯，此類酯有很強的螢光而且相當 穩定。這些衍生物的螢光光譜表明，激發光譜和螢光光譜的峰值分別位於320-340nm和 390-420nm處。香豆素標記的雷公藤內酯醇產生的螢光，不僅為其體內示蹤提供更加直 觀的證據，也可為其藥代動力學研究提供新的參考。
三.
發明內容
本發明需要解決的問題是提供一種用香豆素標記雷公藤內酯醇的製備及其應用 的方法。
本發明所述香豆素標記的雷公藤內酯醇是一種具有如下特徵的分子 l)分子量648; 2)最大激發波長320nm; 3)最大發射波長398nm; 4)在全
波長光 的照射下可發出黃色光；5)生物特性對於鼠源巨噬細胞株ana-l的IC50為 104ng/ml。 具有免疫抑制活性。 本發明所述香豆素標記的雷公藤內酯醇的製備方法是 l)雷公藤內酯醇的活化將其14位的羥基進行衍生化活化，在pH9-10條件下， 與丁二酸酐進行醯化反應，反應式如圖3所示，得到triptolide 14-succinate，以下稱mtp。
2)4-溴甲基-7-甲氧基香豆素標記mtp與4-溴甲基-7-甲氧基香豆素，以下稱 Br-Mmc， 按照l : 3的摩爾比在50mg/ml濃度的碳酸鉀、丙酮溶劑中反應，37°C，反應1 小時。 反應方程式見圖4。用大量熱水洗滌產物，冷凍乾燥即可。
香豆素標記的雷公藤內酯醇的鑑定方法 1)電噴霧質譜鑑定標記產物產物分子量為648，見圖1。 2)香豆素標記的雷公藤內酯醇，具有明顯螢光最大激發波長320nm，最大發 射波長398nm。且對照組雷公藤內酯醇與標記物Br-Mmc在此波長處無明顯螢光。
3)香豆素標記的雷公藤內酯醇具有細胞毒性，可抑制免疫細胞生長。其IC50為 160nM ; mtp同條件下的IC50為28nM ;雷公藤內酯醇同條件下的IC50為13.9nM。
本發明與現有技術方法相比其有益效果是本發明用香豆素標記雷公藤內酯 醇，作為指示劑，產生的螢光效率高，不易淬滅，相當穩定，使得雷公藤內酯醇體內示 蹤變得直觀可行。標記後雷公藤毒性的降低也為其體內示蹤提供了有利的條件。本發明 的主要用途為1)雷公藤內酯醇及其衍生物mtp的細胞定位；2)雷公藤內酯醇及其衍生物 mtp分子靶點的確定3)雷公藤內酯醇及其衍生物mtp的藥代動力學研究。
四.
圖1.香豆素標記的雷公藤內酯醇ESI譜圖
圖2.雷公藤內酯醇細胞內螢光示蹤圖
圖3.雷公藤內酯醇的活化反應式
圖4.雷公藤內酯醇的香豆素標記反應式
五.
具體實施例方式
以下給出用香豆素標記雷公藤內酯醇製備及示蹤的方法的實例。
試劑雷公藤內酯醇採購自深圳牌牌科技有限公司。4-溴甲基-7-甲氧基香豆
素採購自sigma公司。 香豆素標記雷公藤內酯醇製備 1)取10mg雷公藤內酯醇，丁二酸酐15mg， 4-二甲氨基吡啶0.33mg，溶解在lml
的二氯甲烷中。 2)用三乙胺調pH值在9-10左右。 3)在磁力攪拌器的攪拌下，室溫反應24小時。 4)用大量溫水洗滌反應物，將其中有機相烘乾得到淡黃色晶體 triptolide 14-succinate 。 5)取上述反應產物triptolide 14-succinate 5mg， 4-溴甲基-7-甲氧基香豆素 8.8mg，碳酸鉀50mg。 6)加入1000ul的丙酮溶劑中，在磁力攪拌器的攪拌下，37°C，反應1小時。
7)用大量熱水洗滌產物，取有機相，烘乾即得黃色的香豆素標記雷公藤內酯 醇。 香豆素標記雷公藤內酯醇細胞內示蹤 1)Hepal-6細胞株培養條件37°C， 5%二氧化碳，在含有3%小牛血清的 DMEM培養基中，置於細胞培養箱中培養。 2)將細胞製成1 X 105個/ml密度鋪6孔板，每孔中放置一個邊長2.2cm的蓋玻 片，每孔加入2ml的含有2X的小牛血清DMEM，培養過夜，製成細胞爬片。
3)用DMSO溶解Dil( —種商品化的細胞膜紅色螢光染料)，濃度為ImM ;用 DMSO溶解香豆素標記的雷公藤內酯醇，濃度為lmM。 4)將3)步驟中的兩種溶液分別加入2)步驟中的含有細胞爬片的6孔板中，使得 Dil溶液的終濃度為5iiM，香豆素標記的雷公藤內酯醇的終濃度為4iiM， 37°C，培養 30min。 5)將細胞爬片置於螢光顯微鏡中觀察，可見Dil在細胞膜部位發出紅色螢光，雷 公藤發出的藍色螢光主要位於胞質部位，見圖2。
權利要求
一種香豆素標記的雷公藤內酯醇，其特徵是分子量為648，最大激發波長320nm，最大發射波長398nm，在全波長光的照射下可發出黃色光，對於鼠源巨噬細胞株ana-1的IC50為104ng/ml。
2. 根據權利要求1所述香豆素標記的雷公藤內酯醇的製備方法，其特徵是由以下步驟構成l)將雷公藤內酯醇14位的羥基進行衍生化活化，在pH9-10條件下與丁二酸酐進行醯 化反應，得到triptolide 14-succinate，以下稱mtp ;2>^ 與4-溴甲基-7-甲氧基香豆素按照1 : 3的摩爾比，在50mg/ml碳酸鉀、丙酮 溶劑中反應，37°C，反應1小時，用大量熱水洗滌產物，冷凍乾燥。
3. 根據權利要求1所述香豆素標記的雷公藤內酯醇的細胞示蹤方法，其特徵是Dil溶 液的終濃度為5iiM，香豆素標記的雷公藤內酯醇的終濃度為4iiM， 37°C，細胞爬片染 色時間為30分鐘。
4. 根據權利要求1所述香豆素標記的雷公藤內酯醇在生物技術領域中的應用1) 雷公藤內酯醇及其衍生物mtp的細胞定位；2) 雷公藤內酯醇及其衍生物mtp分子靶點的確定；3) 雷公藤內酯醇及其衍生物mtp的藥代動力學研究。
全文摘要
本發明屬於生物製藥技術領域，具體涉及一種香豆素標記雷公藤內酯醇及其製備方法和應用。用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素標記雷公藤內酯醇，其分子量為648，最大激發波長320nm，最大發射波長398nm，全波長光的照射下可發出黃色光，具有免疫抑制活性。製備時，先將雷公藤內酯醇14位羥基活化，後在丙酮溶劑中與4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和碳酸鉀反應，生成具有螢光特性的雷公藤內酯醇衍生物。將其加入活細胞中，可見細胞質有藍色螢光，為雷公藤內酯醇的細胞定位於示蹤提供了直觀的證據。
文檔編號G01N21/64GK101691393SQ200910035979
公開日2010年4月7日 申請日期2009年10月15日 優先權日2009年10月15日
發明者盧彥, 徐加發, 沈萍萍 申請人:南京大學