細胞穿膜肽hPP10及其用途的製作方法

2023-11-10 07:36:07

專利名稱：細胞穿膜肽hPP10及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體講，涉及一種新型人源性細胞穿膜肽及其用途。
背景技術：
隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質組學的興起，人們發現越來越多的生物分子比如蛋白質、多肽、核酸等均有可能成為治療藥物。但是與傳統藥物不同的是，這些治療分子在體內穩定性低、需要在胞內發揮功能的分子難以進入細胞，因而會限制其作為藥物的推廣應用。故開發能有效攜帶這些治療性生物大分子進入靶細胞、經濟、安全的載體系統是亟需解決的問題。近年來，非病毒藥物運輸載體以其安全性、低毒性、低免疫反應等優點被寄予厚望。迄今比較常用的生物大分子細胞內導入方式有如電穿孔、脂質體轉染和有機高分子納米顆粒等可能存在著安全隱患如對細胞的毒性作用、胞內釋放困難、難於組裝及操作，難於應用到個體等這樣那樣的缺點。因此尋找新型的、理想的非病毒藥物輸送系統引起了學者們的廣泛興趣(圖21)。在過去的20多年間，將核酸、多肽、蛋白等具有治療作用的生物活性大分子跨膜轉運至細胞內技術的基礎研究取得了突破性進展。國內外學者在對一些病毒感染特性的研究中相繼發現了一類蛋白結構域，如=HIV-ITat (48 60)、VP22(267 300)，以及果蠅蛋白ANTP(43 58)等具有介導異源蛋白、寡聚核酸、金屬螯合物等生物活性大分子直接跨過細胞膜進入胞漿和核內的功能，這一類富含陽離子、具有穿膜功能的短肽被稱之為細胞膜穿透妝(cell-penetrating peptides,CPP)、穿膜妝或蛋白轉導域(protein transduction
domains, PTDs)。1988年Green和Frankel等首次發現TAT-人免疫缺陷病毒(HIV)
的轉錄調節蛋白可以穿透細胞膜/核膜進入細胞漿/細胞核，隨後的研究發現，該蛋白第48-60位胺基酸殘基(YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全發揮其穿膜功能。以後又相繼發現了多個源自病毒或其他生物的CPP,如I型單純皰疫病毒(herpes simplex virustype 1，HSV-1)蛋白的VP22、果妮同源觸角蛋白(drosophila hemeoprotein antennapediatranscription protein, ANTP)、B型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的前 S 抗原等。依據其來源不同可將已經發現的CPP大致分為兩類一類為如上面提及的TAT、VP22、ANTP 和前S抗原來源於病毒的短肽等；另一類為根據天然CPP的特點人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-U MAP、transportan和各種基於不同信號序列合成的肽段等。CPP能在體外或體內作為載藥多肽，介導一系列生物活性分子如DNA、SiRNA、多肽、蛋白質甚至納米顆粒等進入細胞，發揮各自的生物學效應。這些CPP因其本身具有低毒副作用、不幹擾所攜帶生物大分子活性等，而被廣泛用於體外或/和體內向細胞內運送生物活性分子，尤其是在抗腫瘤治療的應用研究方面更是引人注目。CPP研究在基礎生物學和應用研究上都具有極大意義，作為一種有效的胞內運載工具，有著廣泛的應用前景(圖22)。然而來源於病毒或其他種屬生物蛋白結構域的CPP，在臨床應用上可能仍然存在一定的安全隱患，比如可能的細胞毒性和免疫原性問題。人們對TAT作為CPP進行了大量研究，腹腔注射Tat- β -半乳糖苷酶，能進入小鼠各種臟器組織，甚至可以透過血腦屏障進入腦組織。但由於TAT源於HIV病毒蛋白而恐存有安全憂患，一直未能用於臨床研究。另有報導稱，應用TAT攜帶藥物的上呼吸道噴霧引發了嚴重的肺部病理反應。可見，針對不同治療需要，開發更為安全的、新型穿膜肽一一人源性穿膜肽(hCPP)是非常必要的。2002年，Beck-Sickinger AG小組開創性地發現了第一個人源性穿膜肽--來源
於人降血鈣素(hCT)的第9-32的殘基。隨後相繼報導的人源性穿膜肽還有來自於hCLOCK蛋白(一種與生物節律調節有關的蛋白，2004年)、Hph-l ( 一種人源轉錄因子，2006年)、Bag_l蛋白(一種可與Bcl-2相互作用的激活糖皮質激素受體的蛋白，2006年)、pl4ARF蛋白(一種人抑癌基因蛋白，2008年)、人乳鐵蛋白(2009年)、人Cytc77-101及Cytc86_101 (2010年)和TCTP蛋白(來源於人翻譯控制腫瘤蛋白氨基末端10個胺基酸殘基，2011年)的CPP等。與其他物種蛋白來源的CPP相比，人源性CPP弓丨起人體的免疫反應的可能性小，潛在的不安 全因素相對少，作為人類疾病治療的藥物載體，具有絕對優勢，有著更廣闊的開發、應用前
旦
-5^ OFutaki S等發現穿膜肽的穿膜能力與多肽序列中精氨酸殘基的數量和位置有很大的相關性。我們在從事細胞穿膜肽研究中，通過對蛋白資料庫中一級結構的檢索、分析發現人源性的賴氨酸特異性去甲基化轉移酶4A內的一段長為20個胺基酸的短肽的一級結構富含屬於鹼性胺基酸的精氨酸和賴氨酸，分布著很強的正電荷，這與大多數已知CPP的結構特點很相似，繼而分析其二級結構，發現它可形成經典的α-螺旋構象。推測這段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性穿膜肽。我們繼而合成了這段短肽並命名為hPPIO，觀察了其對培養細胞的穿膜效率，細胞毒性及穿膜機制，同時還觀察、評估了其向細胞內遞送綠色螢光蛋白(GFP)和質粒DNA的效果，為hPPIO作為一種新型人源性藥物運輸載體的開發提供了科學依據。

發明內容
本發明的目的在於提供一種新型人源性細胞穿膜肽hPPIO以及將其用作細胞內藥物運輸載體的用途。一方面，本發明提供了一種新型人源性細胞穿膜肽hPPIO。hPPIO是源於人類細胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A (lysine-specific demethylase 4A)的一段多肽序列，hPPIO的多肽序列如下Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg (賴氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-半胱氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-賴氨酸-精氨酸)。另一方面，本發明提供了將所述新型人源性細胞穿膜肽hPPIO用作細胞內藥物運輸載體的的用途。我們首次發現這一肽段具有穿透細胞膜的功能，並可攜帶蛋白、核酸(DNA質粒)等跨膜進入多種細胞(包括貼壁培養細胞、懸浮培養細胞以及原代培養細胞等)內，是一種極具開發前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜運輸載體。本發明的優點在於，與其他生物蛋白來源的CPP相比，人源性CPP — hPPIO引起人體的免疫反應的可能性小，潛在的不安全因素相對少。因此，作為臨床應用的藥物分子載體有著更為廣闊的應用前景。


圖I是本發明新型人源性穿膜肽hPPIO的二級輪狀結構示意圖。圖2是本發明新型人源性穿膜肽hPPIO的二級結構中存在的螺旋及疊折分析示意圖。圖3是本發明新型人源性穿膜肽hPPIO的原核表達及純化結果的電泳照片。其中M :蛋白分子量標誌I pET15b-hPP10質粒轉化細菌IPTG誘導前裂解液2 pET15b-hPP10質粒轉化細菌IPTG誘導後裂解液3 :純化後的 hPP10_6xHis圖4是螢光標記的hPPIO ChPPlO-FITC)穿膜進入不同腫瘤細胞後胞內螢光分布情況。圖5是hPP10-FITC穿膜進入原代人外周血淋巴細胞後胞內螢光分布情況。圖6不同濃度hPP10-FITC的穿膜效率。A :ECV_304胞內螢光鏡下觀；B :ECV_304胞內螢光定量。圖7表示孵育時間對hPP10-FITC入胞的影響。A hPP10-FITC短時間孵育後的螢光定量；B =TAT-FITC短時間孵育後的螢光定量；C hPP10-FITC長時間孵育後的螢光定量； D =TAT-FITC長時間孵育後的螢光定量。圖8表示血清對hPP10-FITC穿膜效率的影響。圖9表示不同細胞經DMSO預處理對hPP10_FITC穿膜效率的影響。A =DMSO預處理各種不同類型細胞後胞內螢光分布情況DMS0預處理不同培養細胞後的胞內螢光定量。圖10表示原代淋巴細胞經5%DMS0預處理對hPP10-FITC穿膜效率的影響。A :DMS0預處理原代培養小鼠脾淋巴細胞後胞內螢光分布情況；B :DMS0預處理原代培養人外周血淋巴細胞後胞內螢光分布情況。圖11表示hPPIO介導質粒pDsRed轉染的效果。圖12表示pcDNA3. I-Gluc重組質粒構建提取和BamH I/Xbal I的雙酶切鑑定。泳道I :pcDNA3. I-Gluc ;泳道 2 pcDNA3. I-Gluc 的 Nco I/BamH I 的雙酶切。圖13表示hPPIO介導質粒pcDNA3. I-Gluc轉染的效果。圖14表示pET15b-hPP10_GFP重組質粒構建和Nde I/BamH I的雙酶切鑑定。泳道I :pET15b-hPP10-GFP ;泳道 2 :pET15b-hPP10_GFP 的 Nde I/BamH I 的雙酶切。圖 15 表示 SDS-PAGE 分析 IPTG 誘導 pET15b_GFP、pET15b_hPP10_GFP 在 Rosetta細菌中的表達及純化。泳道3和4分別為純化的GFP和hPP10_GFP融合蛋白；泳道2和5分別為GFP和hPP10_GFP質粒轉化細菌經IPTG誘導；泳道I和6分別為GFP和hPP10_GFP質粒轉化細菌未經IPTG誘導。
圖16表示hPP10-GFP融合蛋白穿膜進入L929細胞的分布情況。圖17表示hPP10-GFP融合蛋白穿膜進入原代人外周血淋巴細胞的分布情況。圖18表示MTT檢測hPP10-FITC處理後對細胞活力的影響。圖19表示不同溫度下DMSO預處理後螢光短肽在胞內的含量。

圖20表示不同內吞抑制劑對hPPIO穿膜效率影響。A :肝素處理各種不同類型細胞後胞內螢光強度；B :氯喹預處理不同培養細胞後胞內螢光強度；C :氯丙嗪處理不同培養細胞後的胞內螢光強度。 圖21是新型治療分子胞內遞送策略示意圖。圖22是細胞穿膜肽(CPP)及其可攜帶入胞的生物藥物的工作原理示意圖。
具體實施例方式下面將結合具體實施方式
對本發明的方案做更詳細的說明。實施例I、CPP —級結構、二級結構分析，預測、鑑定新型人源性CPP 二級結構分析採用了 emboss的在線分析程序(其分析程序請參見網頁http://emboss, bioinformatics, nl/cgi-bin/emboss/pepwheel 在線分析多妝的輪狀結構;http://emboss, bioinformatics, nl/cgi-bin/emboss/ 在線分析二級結構的螺旋、疊折等)。hPPIO的輪狀結構示意圖，螺旋、疊折結構示意圖分別如圖I和圖2所示。化學合成綠色螢光標記的hPPIO :FITC-Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg (hPP10-FITC)和無綠色螢光標記hPPIO Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(hPPIO)純化定量、冷凍保存備用。2. hPPIO的合成途徑有兩種I)化學合成；2)基因工程表達。hPPIO源於自然蛋白，可以在實驗室水平或工業水平進行合成。2. I化學合成方法此種方法是選擇羧基樹脂(Fmoc-Tyr (tBu)-Wang resin),採用固相Fmoc法合成。具體合成步驟如下(I)用Fmoc基團對α -氨基進行保護的賴氨酸通過一個支臂連結到不溶性載體王氏樹脂(Wang resin)上；(2)用TFA(三氟乙酸)溶液洗滌賴氨酸一支臂一樹脂，使α-氨基脫保護；(3)將第二個預先用適當的縮合劑DCC活化的α -氨基保護的異亮氨酸通過耦聯反應與賴氨酸形成共酯連接上去；(4)用TFA(三氟乙酸)溶液洗滌異亮氨酸一支臂一樹脂，使α-氨基脫保護；(5)將第三個預先用適當的縮合劑DCC活化的α -氨基保護的脯氨酸通過耦聯反應與異亮氨酸形成共酯連接上去。重複進行上述脫保護、耦聯，直到耦合上最後一個胺基酸——精氨酸，脫去Fmoc保護基團，合成完成。
(6)將切割試劑加入到肽——樹脂中，把肽鏈從樹脂上切割下來，同時也將各個胺基酸上的側鏈保護基團從肽鏈上切割下來，加入乙醚，沉澱多肽，獲得多肽粗品。運用HPLC/MS進行多肽的鑑定和純化，最終得到所需多肽。2. 2基因工程表達法採用原核表達方法，具體操作如下(I)設計編碼hPPIO的兩條單鏈cDNA，兩側帶有NdeI和XhoI酶切位點，交由上海生工公司合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經95°C 5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補的雙鏈DNA片段(hPPIO)；(2)利用Ndel/Xhol兩種限制性內切酶進行雙酶切，37°C溫育兩小時，將表達質粒pET15b (購自 Novagen)線性化； (3)進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長波紫外光照射下，切膠回收含線性化質粒pET15b的條帶。瞬時離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內的操作說明完成切膠回收；(4)將回收、純化的線性化質粒DNA片段和退火後的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)分別進行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，置於16°C水浴箱中溫育過夜連接；(5)用CaCl2法製備DH5 a感受態細胞，用熱休克法以上述連接產物pET15b_hPP10轉化感受態細胞，經O. lg/L氨苄青黴素瓊脂平板37°C過夜篩選後，挑取單菌落接種於含氨苄青黴素LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜；(6)離心沉澱收集擴增轉化細菌，用鹼裂解法提取重組質粒，篩選成功構建的陽性克隆pET15b-hPP10，酶切並測序驗證；(7)將驗證正確的重組原核質粒pET15b_hPP10轉化Rosetta感受態細菌。經O. Ig/L氨苄青黴素瓊脂平板37°C過夜；(8)挑取單克隆菌落接種於含氨苄青黴素LB培養基，37°C振蕩培養過夜；(9)用15ml無菌離心管裝3. 8ml Amp (+)LB液體培養基，接種O. 2ml對數生長期的菌懸液(I: 20)。37°C，250rpm繼續培養3h ；(10)於對數生長期細菌培養物中加入40μ I O. IM IPTG至終濃度I. OmM，37°C，250rpm繼續培養；(11)在加入IPTG後6h取樣200 μ I菌懸液；(12)離心收集沉澱,用等體積IXSample Buffer重懸,沸水浴5min。製備的菌體全蛋白上樣樣品；(13) SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況，如圖3。確認的表達及純化。3. hPPIO具有很強穿膜效能3. IhPPlO-FITC具有顯著穿膜特徵並在胞內分布均勻；3. I. IhPPlO-FITC可以穿膜進入體外培養的腫瘤等細胞並在細胞內均勻分布，具有顯著穿膜特徵；取對數生長期的四種培養細胞疋(^-304、抱1^、!1印62、？03，依1\105個細胞/孔的密度接種於12孔板常規培養，設實驗組及對照組；至對數生長期(80%密度)時，換成無血清的RPMI-1640培養液繼續培養I小時；加入終濃度10 μ M hPP10-FITC,常規培養I小時；棄去培養液，PBS洗滌3次；
螢光顯微鏡下觀察培養細胞內螢光及其胞內定位情況。結果見圖4，螢光顯微鏡觀察發現，未經hPP10-FITC處理的各種細胞內無綠色螢光。在經hPP10-FITC溫育後，可在胞內見到明顯綠色螢光，且這四種不同細胞系均有明顯胞內螢光，提示hPP 10穿膜進入細胞沒有明顯細胞嗜向性。3. I. 2hPP10-FITC對人外周血淋巴細胞有穿膜特徵新鮮採取、分離的健康人外周血淋巴細胞，依IX IO5個細胞/孔的密度接種於12孔板，設實驗組及對照組；在培養箱中常規培養2小時後，換成無血清的RPMI-1640培養液繼續培養I小時；加入終濃度10 μ M hPP10-FITC,常規培養I小時；棄去孵育液，PBS洗滌3次；螢光顯微鏡下觀察培養細胞內螢光及其胞內定位情況。結果見圖5，螢光顯微鏡觀察發現，未經hPP10-FITC處理的人外周血淋巴細胞內不見綠色螢光。在經hPP10-FITC溫育後，可見到明顯的胞內綠色螢光，提示hPPIO可高效穿膜進入新鮮製備的人外周血淋巴細胞。3. 2hPP10-FITC穿膜進入細胞具有濃度依賴性ECV-304細胞在經無血清的RPMI-1640處理Ih後，加入濃度梯度的hPP10_FITC(2. 5 μ Μ、5. O μ Μ、7. 5 μ Μ、10. O μ Μ)孵育Ih後，PBS清洗3次，觀察培養細胞內螢光情況。並採用螢光酶標儀檢測細胞內螢光密度數值，具體方法如下細胞在經不同濃度hPP10-FITC孵育結束後，PBS清洗3次，按300 μ I/孔加入0. IM NaOH，室溫裂解細胞lOmin，IOOOrpm離心3min。取細胞裂解液上清50μ I於96孔板在螢光酶標儀中，激發光/吸收光為490nm/520nm下測定螢光密度值。實驗重複3次取平均值。在實驗中，採用經典的穿膜肽TAT-FITC作為陽性對照。圖6A顯示，胞內螢光強度隨hPP10-FITC濃度升高而增強，並且可見相同濃度下，胞內hPP10-FITC螢光比TAT-FITC強。圖6B可見，隨著hPP10_FITC濃度的升高，胞內熒 光強度隨之增強，提示hPP10-FITC穿膜進入細胞具有濃度依賴性。當hPP10-FITC濃度為5 μ M時，螢光強度已經比較高，在後續實驗中均選用了 5 μ M的hPP10-FITC作為終濃度進行實驗。3. 3hPP10胞內持續時間顯著長於TATC0S7、ECV-304、PC3、HeLa在經無血清的RPMI-1640培養處理Ih後，加入終濃度為5 μ M 的 hPP10-FITC 分別孵育 0. 5h、I. Oh,2. Oh,4. Oh、10h、20h 及 30h 後。PBS 洗滌三次，裂
解細胞，依前述方法用螢光酶標儀檢測490nm/520nm檢測細胞裂解液上清螢光值。實驗均重複3次取平均值。不同的培養細胞隨著hPP10-FITC孵育時間的延長，其螢光值均有所增強，至4h其螢光值為最高(圖7A)。而TAT-FITC在孵育Ih時，胞內螢光強度為最大，隨著孵育時間的進一步延長，螢光值逐漸減弱(圖7B)。為了進一步確定hPP10-FITC在胞內維持時間，將孵育時間延長至30h。發現hPP10-FITC在ECV_304、PC3和HeLa三種細胞中可以維持至至少30小時(7C );而TAT-FI TC在細胞內螢光隨著時間推移急劇下降，於IO小時時已經基本不能檢測到螢光存在(7D)。本研究顯示新型人源性穿膜肽hPPIO在胞內維持時間至少可達30小時,而TAT僅能維持短短幾小時時間，顯著短於hPPIO。
3. 4血清降低hPP10-FITC穿膜效率培養細胞H印G2、ECV-304及B16分別在經有血清和無血清的RPMI-1640培養Ih後，加入終濃度為5μΜ的hPP10-FITC繼續孵育Ih後，PBS清洗3次，裂解細胞，取其上清液用螢光酶標儀檢測490nm/520nm波長處螢光吸光值。實驗重複3次取平均值。結果見圖8，一般情況下血清的存在會影響細胞對穿膜肽的內吞攝取。通過螢光定量檢測發現，血清的存在對hPP10-FITC穿膜入胞有很大影響。無血清組hPPIO穿膜效率明顯高於有血清組(P < O. 05)。結果顯示血清的存在影響hPPIO的穿膜效率。3. 5DMS0預處理促進hPPIO穿膜進入培養細胞取對數生長期貼壁培養細胞HSC-T6、Caski, ECV-304、懸浮培養細胞THPl及原代培養纖維細胞，按照I X IO5個細胞/孔的接種密度接種於12孔板進行常規培養。每種細胞均分設實驗組及對照組；

至對數生長期(80%密度)時，換為無血清的RPMI-1640培養液，再培養I小時；每孔加入終濃度為5%的DMS0，繼續培養I小時。加入終濃度為5 μ M的hPP10_FITC或TAT-FITC後，孵育I小時;棄去培養液，PBS洗滌3次；螢光顯微鏡下觀察HSC-T6、Caski, ECV-304、懸浮培養細胞THPl及原代培養纖維細胞胞內螢光及其胞內定位情況，或按每孔加入300μ I 0. IM NaOH，室溫裂解ECV-304，Caski或B16細胞10分鐘，IOOOrpm離心3分鐘。取細胞裂解液上清50 μ I到96孔板於螢光酶標儀，於490nm/520nm下測定螢光吸光值。實驗重複3次取平均值。本發明人前期研究發現DMSO可以明顯增強TAT穿膜效率，在此，也觀察了 DMSO對新型人源性穿膜肽膜hPPIO的穿膜影響。通過螢光顯微鏡觀察發現，DMSO對hPP10-FITC穿膜具有明顯增強效果。與經過DMSO預處理後TAT-FITC穿膜效率相比，DMSO預處理細胞後hPP10-FITC穿膜效率與TAT相當或略強於TAT-FITC(圖9A)。經DMSO預處理後，hPP10_FITC在胞內顯示搞密度綠色螢光，且均勻分布於胞漿和胞核，即使是對普通轉染或轉導非常困難的懸浮細胞或原代細胞，hPP10-FITC也具有非常理想的穿膜效果。螢光定量檢測發現，5%DMS0預處理後，hPP10-FITC和TAT-FITC的胞內螢光強度較未經DMSO預處理細胞強(圖9B)，hPP10-FITC的胞內螢光強度明顯強於TAT-FITC。提示5%DMS0預處理細胞明顯存進了hPPIO和TAT的穿膜效率，DMSO能夠顯著增強CPP的穿膜效率且無細胞特異性(圖9)。3. 6DMS0預處理促進hPPIO穿膜進入新鮮製備的淋巴細胞新鮮採取、製備人外周血淋巴細胞，或小鼠脾淋巴哦細胞，按照IXlO5個細胞/孔的接種密度接種於12孔板；在培養箱中常規培養2小時後，換成無血清的RPMI-1640培養液繼續培養I小時；加入終濃度10 μ M hPP10-FITC，常規培養I小時；棄去培養液，PBS洗滌3次；螢光顯微鏡下觀察培養細胞內螢光強度及胞內螢光定位情況。結果發現，經DMSO預處理後，hPP10-FITC也可以高效穿膜進入新鮮製備的人外周血或小鼠脾淋巴細胞，並均勻分布於胞漿和胞核，圖10A為小鼠脾淋巴細胞內hPP10-FITC密度和分布；圖10B為人外周血淋巴細胞內hPP10-FITC密度及分布。提示hPPIO不僅可以穿膜進入貼壁培養細胞，懸浮培養細胞內，還可以穿膜進入新鮮製備的人外周血淋巴細胞、或小鼠脾淋巴細胞，顯示了極其廣泛的應用前景。實施例2、hPP10介導質粒DNA轉染hPPIO介導質粒DNA轉染的方法包括以下步驟(1)取對數生長期培養細胞ECV-304,以I X IO5個細胞/孔的接種密度接種於12孔板常規培養，同時設置相應的陽性和陰性孔；(2)置37°C 5%C02培養箱中，培養20 24h，至細胞密度達到70%_80%時，將培養液換成無血清的RPMI-1640培養液，繼續培養I小時；(3)與此同時準備轉染樣品a.取終濃度為ΙΟμΜ hPPIO加入含50μ I Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻後在室溫下孵育5min ；b.取O. 8 μ g的質粒加入含50 μ I Opti-MEM的另外一個離心管中，輕輕混 勻後在室溫下孵育5min。將b緩慢地加入到a中，混勻後室溫靜置30min ；(4)將上述hPPIO+質粒DNA混合溶液均勻地加入到相應的培養細胞中，輕搖混勻。以市售脂質體Lipofectamine 2000作為轉染實驗陽性對照；(5)置細胞於二氧化碳培養箱中繼續溫育4_6h後，換成含小牛血清培養液，繼續培養 24-48h ；(6)觀察hPPIO介導的轉染效果，以脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑和陽性對照肽TAT作為轉染陽性對照。2. IhPPlO介導紅色螢光蛋白表達質粒pDsRed轉染轉染後4-6小時更換成正常培養液繼續培養48h後，螢光顯微鏡下觀察ECV-304細胞經hPPIO介導轉染質粒pDsRed (購自Clontech公司)的效果。由圖11可見,hPPIO能介導轉染質粒pDsRed，一些培養細胞中有紅色螢光蛋白表達。2. 2質粒pcDNA3. I-Gluc的構建及hPPIO介導其轉染的效果2. 2. I真核重組質粒pcDNA3. I-Gluc構建和酶切鑑定(I)利用BamHI/Xball兩種酶進行雙酶切真核表達質粒pcDNA3. I ( + )(購自invitrogen公司)和質粒pGLuc-Basic Vector (真核表達分泌型突光素酶載體,購自NEB公司)，37°C，溫育2h ；(2)分別進行瓊脂糖凝膠電泳，分別切膠回收線性化的表達質粒pcDNA3. I ( + )和分泌型突光素酶(Gaussia Luciferase)的cDNA片段至離心管中，離心,依切膠回收試劑盒操作說明回收DNA片段；(3)將回收到的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接用DNA比例，配連結反應體系，置於16°C水浴箱中過夜連接；(4)取DH5 a感受態細胞，用熱休克法以連接產物pcDNA3. I-Gluc轉化感受態細胞，經0. lg/L氨苄青黴素瓊脂平板37°C過夜篩選後，挑取單個菌落接種於含氨苄青黴素LB液體培養基，37°C過夜振蕩培養；(5)用鹼裂解法提取重組質粒，篩選成功構建的陽性克隆，限制性內切酶鑑定用BamHI/Xball雙酶切重組質粒，得到酶切產物，pcDNA3. Ihe理論值為590bp的插入片段DNA帶(圖12)，電泳結果顯示與預期大小一致；並經測序確認插入片段無突變。表明成功構建了真核重組質粒pcDNA3. I-Gluc02. 2. 2hPP10 介導質粒 pcDNA3. I-Gluc 轉染的效果
(I)取對數生長期培養細胞ECV-304，以I X IO5個細胞/孔的接種密度接種於12孔板常規培養，同時設置相應的陽性和陰性孔；(2)置37°C 5%C02培養箱中，培養20 24h，至細胞密度達到70%_80%時，將培養液換成無血清的RPMI-1640培養液，繼續培養I小時；(3)與此同時準備轉染樣品a.取終濃度為ΙΟμΜ證？10加入含5(^1 Opti-MEM的離心管中，輕輕混勻後在室溫下孵育5min ；b.取O. 8 μ g的質粒加入含50 μ IOpti-MEM的另外一個離心管中，輕輕混勻後在室溫下孵育5min。將b緩慢地加入到a中，混勻後室溫靜置 30min ；(4)將hPPIO+質粒混合物均勻的加入到相應的培養細胞孔中，輕搖混勻。以市售脂質體Lipofectamine 2000作為轉染實驗陽性對照；(5)在5%C02培養箱中，37°C繼續溫育4_6h後，置換成含小牛血清正常培養液，繼續培養24-48h ；(6)取200 μ I培養液上清(含有分泌型螢光素酶)置於I. 5ml離心管中，5000rpm離心3min，依分泌型螢光素酶試劑盒使用說明，運用螢光微孔測定儀，檢測培養上清螢光素酶活性，以脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑作為轉染陽性對照，TAT和無意義肽NCO作為陽性和陰性肽對照，各處理樣品中螢光素酶活性結果見圖13。圖13可見，hPPIO成功介導了分泌型螢光素酶質粒pcDNA3. I-Gluc轉染，細胞表達了較高水平的螢光素酶蛋白，且其活性隨著hPPIO濃度的增高而逐步增強。本研究成功利用hPPIO介導了質粒DNA (pDsRed和pcDNA3. 1-Gluc)的轉染，但是其轉染效率與商用試劑Lipofectamin 2000相比顯得較低，我們將繼續優化hPPIO介導的轉染實驗條件條件，以期提高轉染效率。hPPIO成功介導DNA質粒的轉染將為體外和體內的基因轉染提供強有力工具，將來可應用到科學研究和臨床上的基因治療。實施例3、pET15b-hPP10-GFP質粒構建，融合蛋白的表達及純化和其穿膜功效的研究3. lpET15b-hPP10_GFP重組質粒的構建和酶切鑑定
(I)設計編碼hPPIO的兩條單鏈cDNA，兩側帶有NdeI和XhoI酶切位點，交由上海生工公司合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經95°C，5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補的雙鏈DNA片段(hPPIO);同時設計一對引物以pEGFP (購自Clontech公司)為模板，PCR獲得GFP蛋白基因片段，兩側分別有XhoI和BamHI酶切位點，純化PCR產物備用；(2)利用BamHI/Ndel兩種限制性內切酶進行雙酶切，37°C溫育兩小時，將表達質粒pET15b (購自Novagen)線性化；(3)進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長波紫外光照射下，切膠回收含線性化質粒pET15b的條帶；瞬時離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內的操作說明完成切膠回收；(4)將回收、純化的線性化質粒DNA片段和退火後的穿膜肽cDNA片段(hPPIO)、以及GFP基因片段分別進行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，置於16°C水浴箱中溫育過夜連接；(5)用CaCl2法製備DH5 a感受態細胞，用熱休克法以上述連接產物pET15b_hPP10轉化感受態細胞，經O. lg/L氨苄青黴素瓊脂平板37°C過夜篩選後，挑取單菌落接種於含氨苄青黴素LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜；(6)離心沉澱收集擴增轉化細菌，用鹼裂解法提取重組質粒，篩選成功構建的陽性克隆pET15b-hPP10-GFP，酶切並測序驗證；利用Nde I/BamHI雙酶切鑑定重組質粒pET15b-hPP10_GFP得到酶切產物理論值為795bp(圖14)，片段與預期大小一致；經測序確認無突變。說明原核表達質粒pET15b-hPP10-GFP 構建成功。相同方法構建得到 pET15b_GFP 和 pET15b_TAT_GFP3. 2融合蛋白的表達及純化3. 2. I融合蛋白的原核表達

(I)將成功構建的重組質粒pET15b_GFP和pET15b_hPP10_GFP分別轉化Rosetta感受態細胞。經O. lg/L氨苄青黴素瓊脂平板37°C過夜；(2)挑取單克隆菌落接種於含氨苄青黴素LB培養基，37°C振蕩培養過夜；(3)用15ml無菌離心管裝3. 8ml LB(+)^液體培養基，接種O. 2ml對數生長期的菌懸液(I: 20)。37°C，250rpm繼續培養3h ；(4)於對數生長期細菌培養物中加入40μ I O. IM IPTG至終濃度I. OmM，37 °C，250rpm繼續培養；(5)在加入IPTG後6h取樣200 μ I菌懸液；(6)離心收集沉澱,用等體積IXSample Buffer重懸,沸水浴5min。製備的菌體全蛋白上樣樣品；(7) SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況。3. 2. 2融合蛋白的純化3. 2. 2. I大量誘導用IL培養瓶中盛300ml LB (+)Amp液體培養基，誘導表達可溶性的重組蛋白(I. OmM IPTG，30°C，250rpm，9h)。4°C 6500rpmX lOmin，收集沉澱並稱重，_40°C保存備用。3. 2. 2. 2 咪唑純化(I)超聲裂解平均 IOOml 菌液用 15ml Lysis/Binding Buffer (300mM NaCl,50mMNaH2P04, IOmM咪唑，pH 8. 0)重懸，冰浴。超聲功率30(T600W，超聲2sec，間隔2sec，工作90次。如此循環12 20次，至均勻破碎細菌於懸浮溶液；(2) 12000rpmX20min,4°C,轉移上清至 15ml 離心管中；(3)結合用3 5倍體積的Lysis/Binding Buffer在15ml離心管中平衡Ni-NTA,離心收集Ni-NTA,再用與沉澱等體積的Lysis/Binding Buffer重懸，即已平衡的50%Ni-NTA。取I 4ml 50%Ni-NTA與裂解上清混合，在分子雜交爐中37°C轉動結合I 2h ；(4)洗滌脫除雜蛋白用至少1/2菌液體積的Wash Buffer (300mMNaCl,50mMNaH2P04，2(T30mM咪唑，pH 8. 0)洗脫雜蛋白。收集前3 5ml穿柱液，取樣備做檢測；(5)洗脫靶蛋白共用 5 IOml Elution Buffer (300mM NaCl,50mM NaH2PO4, 250mM咪唑，pH 8. 0)，每次加0. 5ml，用I. 5ml離心管收集；(6)保存在96孔板中，各取5μ I樣品與195 μ I考馬斯亮藍G-250溶液混合，比較顏色深淺。留存顏色最深的數管，分別添加10(Γ200μ I無菌甘油，混勻後於_40°C保存，並取樣備做檢測。
GFP和hPP10-GFP融合蛋白相對分子質量分別為27KD和30KD。陽性克隆在I. OmMIPTG誘導6小時後，經SDS-PAGE分析所表達的融合蛋白，在35KD和27KD附近出現一條強表達帶，符合預期分子質量大小(圖15)。基因工程表達蛋白的純化是利用6XHis標籤，通過Ni-NTA親和層析得到有效純化，融合蛋白的純度大於80%。圖15顯示得到了純化的GFP和 hPP10-GFP 蛋白。3. 3hPP10-GFP融合蛋白穿膜功效的研究3. 3. IhPPlO-GFP融合蛋白跨膜進入貼壁培養細胞內的能力研究(I)取對數生長期培養細胞L929，按照I X IO5個細胞/孔的接種密度接種於12孔板常規培養。每種細胞均分設實驗組及對照組；(2)待細胞生長至80%融合時，換為無血清的培養液，繼續培養I小時； (3)每孔加入終濃度為5%DMS0，繼續常規培養I小時；(4)實驗組加入終濃度為5 μ M的融合蛋白hPP10-GFP，陽性對照組加入相同濃度的蛋白TAT-GFP，同時設陰性對照。37°C培養箱孵育I小時；(5)棄去以上清培養液，PBS洗滌三次；(6)置於螢光顯微鏡下觀察hPP10-GFP融合蛋白穿膜及胞內定位情況。L929細胞中加入hPP10-GFP融合蛋白孵育Ih後，螢光顯微鏡下觀察到細胞內清晰明亮的綠色螢光，胞內螢光分布均勻(圖16) j55%DMS0預處理L929細胞後胞內hPP10-GFP螢光明顯增強。顯示hPPIO可攜帶大分子(綠色螢光蛋白)高效穿膜進入細胞，5%DMS0預處理可顯著增強hPPIO攜帶綠色螢光蛋白跨膜進入細胞。3. 3. 2hPP10-GFP融合蛋白跨膜進入人外周血淋巴細胞的穿膜能力研究(I)新鮮採取、分離製備人外周血淋巴細胞，按照I X IO5個細胞/孔的接種密度接種於12孔板，設實驗組及對照組；(2)將12孔板在培養箱中靜置2小時後，換成無血清的RPMI-1640培養液繼續培養I小時；(3)每孔加入終濃度為5%DMS0，繼續常規培養I小時；(4)實驗組加入終濃度為5 μ M的融合蛋白hPP10-GFP，陰性對照組加入相同濃度的GFP蛋白，37°C培養箱孵育I小時；(5)棄去以培養液，PBS洗滌三次；(6)置於螢光顯微鏡下觀察hPP10-GFP融合蛋白穿膜及胞內定位情況。新鮮採取、分離製備的人外周血淋巴細胞經5%DMS0預處理後，加入hPP10-GFP融合蛋白，螢光顯微鏡下觀察到明顯的綠色螢光，胞內螢光分布均勻(圖17);而未經DMSO預處理細胞胞內hPP10-GFP螢光比較微弱。本研究提示hPPIO不僅自身可以穿膜進入細胞，也可通過融合蛋白形式攜帶大分子蛋白(GFP)跨膜進入貼壁培養細胞和人外周血淋巴細胞。這一研究結果為將來開發由hPPIO作為載體向細胞內遞送大分子蛋白藥物提供了基礎。實施例4、hPPIO對細胞活力影響甚微(I)取對數生長期培養細胞ECV-304和H印G2，以I X IO4個細胞/孔的接種密度接種於96孔板常規培養，每孔100 μ 1，每種細胞設3個復孔，37°C培養；(2)至對數生長期，培養液換成無血清的RPMI-1640培養液，繼續培養I小時；
(3)分別換成 hPPIO 濃度梯度為 1(^] 、2(^]\1、3(^]\1、4(^]\1及5(^]\1無血清的RPMI-1640培養液，繼續培養24小時；(4)孵育時間結束後按每孔100 μ I加入PBS洗滌，2minX 3次；(5)每孔加入80μ I含血清的正常培養液及20μ I MTT (母液濃度5mg/ml，即O. 5%MTT)溶液，於37°C繼續培養4h，終止培養後吸去培養液。以200 μ I/孔加入二甲基亞碸，振蕩IOmin至結晶物充分溶解後用全波長酶標儀上檢測波長為570nm的吸光值A，每組取3個復孔的平均值。測定0D490。重複3次，計算細胞存活率。(6)細胞生存率的計算如下細胞生存率=(實驗孔OD值一對照孔OD值一空白孔OD值)/ (對照孔OD值一空白孔OD值)X 100%ο 為明確hPPIO處理細胞是否會影響其活力，本實驗採用MTT法測定不同濃度hPPIO處理24h後對細胞活力的影響情況。ECV-304和!fepG2細胞經不同濃度hPPIO處理後MTT 分析數據顯示，濃度高於20 μ M的hPPIO長時間處理細胞後細胞依然保持在75%以上，對細胞的活力影響甚微(圖18)。提示有效濃度(小於5μΜ)範圍內hPP10-FITC並不影響細胞活力。實施例5、hPPIO穿膜機制5. I低溫輕度抑制hPP10-FITC穿膜使用不同的培養細胞，如ECV_304、Caski及HeLa在經無血清的RPMI-1640處理Ih後，加入終濃度為5 μ M的hPP10-FITC分別在4°C和37°C兩個條件下孵育Ih後，PBS清洗3次，依前述方法裂解細胞取其上清檢測490nm/520nm波長處的螢光吸光值。實驗重複3次取平均值。一般認為細胞內吞途徑是能量依賴的，低溫時細胞的能量代謝幾乎停滯，也即低溫能夠阻斷細胞內吞途徑。ShPPio穿膜方式是通過內吞途徑實現，那麼溫度的變化必然會影響胞內螢光含量。本實驗選用在4°c和37°C兩個條件探索溫度是否影響其穿膜方式。圖19表明，低溫對hPPIO穿膜影響甚微，與迄今大多數報導結果一致。提示hPPIO短肽本身穿膜可能與內吞機制無關。5. 2肝素顯著降低hPPIO穿膜效率觀察三種內吞抑制劑對hPP10-FITC的穿膜影響，肝素鈉(PBS溶解，終濃度ΙΟμΜ)、氯喹(PBS溶解，終濃度ΙΟμΜ)、氯丙嗪(PBS溶解，終濃度30 μ Μ)配成母液，
0.22 um濾膜過濾滅菌。四種不同的培養細胞C0S7、ECV-304、PC3和HeLa在用無血清的RPMI-1640培養Ih後，細胞中分別加入終濃度的三種內吞抑制劑，繼續孵育30min，加入終濃度為5 μ M的hPP10-FITC孵育lh，移除培養基，PBS清洗3次，依前述方法置於螢光酶標儀中，檢測490nm/520nm的螢光吸光值。實驗重複3次取平均值。實驗通過培養細胞與不同的內吞抑制劑孵育，考察內吞抑制劑對hPPIO入胞情況的影響。其中肝素為細胞膜表面硫酸蛋白聚糖的競爭抑制劑；氯喹為抑制內含體酸化的內吞調節劑；氣丙嚷為籠型蛋白依賴的內吞抑制劑。從圖20A中看出，在加入肝素後，細胞對hPPIO的攝取大幅度降低。提示肝素能顯著抑制hPPIO被攝取進入細胞，細胞膜表面的硫酸蛋白聚糖對hPPIO穿膜進入細胞發揮著重要作用。圖20B和20C顯示，氯喹和氯丙嗪對hPPIO穿膜進入細胞的影響均不明顯。提示hPPIO穿膜進入細胞的過程中需要與細胞膜表面硫酸蛋白聚糖等負電荷分子相互作用，可能不依賴籠型蛋白介導的內吞和內含體酸化機制。結論我們在對現有CPP結構進行系統分析的基礎上，通過對蛋白質資料庫進行檢索，預測和二級結構分析等方法，發現一全新的人源性細胞膜穿透肽(hCPP)，命名為hPPIO。人工合成hPPIO以及原核表達其與綠色螢光蛋白的融合蛋白(hPP10-GFP)進行了一系列體外實驗研究。發現hPPIO具有很強的穿膜能力，並可攜帶大分子GFP，質粒DNA跨膜進入包括腫瘤細胞等貼壁培養細胞，原代細胞，懸浮細胞等多種培養細胞和人外周血淋巴細胞，而不影響所攜帶生物活性分子的功能，對細胞基本無毒副作用。顯示hPPIO作為一種新的人源性細胞穿膜肽，能用於體外和體內向細胞內運送生物活性分子(如蛋白質、多肽，基因等藥物)。hPPIO的開發將為科研(體外培養細胞的蛋白轉導和基因轉染)、臨床治療 (向細胞內遞送蛋白或基因藥物)提供又一新型胞內運輸工具。
權利要求
1.一種新型人源性細胞穿膜肽hPPIO，其特徵在於hPPIO是源於人類細胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A的一段多肽序列，具有細胞膜穿透能力。
2.如權利要求I所述的人源性細胞穿膜肽hPPIO，其特徵在於所述穿膜肽的多肽序列如下Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-LyS-Argο
3.將權利要求I或2所述新型人源性細胞穿膜肽hPPIO用作藥物運輸載體的用途。
4.如權利要求3所述的用途，其特徵在於所述新型人源性細胞穿膜肽hPPIO可攜帶蛋白或核酸跨膜進入多種細胞。
5.如權利要求4所述的用途，其特徵在於所述核酸是DNA質粒。
6.如權利要求4所述的用途，其特徵在於所述新型人源性細胞穿膜肽hPPIO可攜帶大分子蛋白(GFP)進入的細胞包括貼壁培養細胞、懸浮培養細胞以及原代培養細胞。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，尤其是涉及一種新型人源性細胞穿膜肽hPP10及利用其作為細胞內藥物運輸載體的用途。hPP10是源於人類細胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A的一段多肽序列，具有穿透細胞膜功能，並可攜帶蛋白，核酸(DNA質粒)跨膜進入多種細胞，是一種極具開發前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜運輸載體。
文檔編號C07K7/08GK102827254SQ201210267050
公開日2012年12月19日 申請日期2012年7月30日 優先權日2012年7月30日
發明者柳長柏, 馬節蘭, 蔡三金, 吳江鋒, 張潔, 賀曉敏, 楊英桂 申請人:三峽大學