豬13號染色體上一個與產仔數相關的分子標記及其引物的製作方法

2023-12-03 03:04:06

豬13號染色體上一個與產仔數相關的分子標記及其引物的製作方法
【專利摘要】本發明涉及與豬產仔數性狀相關的分子標記，具體涉及豬13號染色體上一個與產仔數相關的分子標記及其引物，屬生物【技術領域】。該分子標記位點為基因組版本NCBI?Build?Sscrofa10.2的Chr13:199018050；該位點的等位基因為T和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型，該位點及其側翼序列如SEQ?ID?NO:1所示。擴增該分子標記位點的引物及延伸引物為：Chr13-PCRU：5』-AAG?CTG?GTG?ATG?TTG?CTA?TCA-3』；Chr13-PCRL：5』-TAG?TGA?TGT?GGG?AGT?GGA?ACA-3』；Chr13-SNPU：5』-GAC?TGA?CTG?ACT?GAC?TGA?CTG?TTA?CAA?TAG?ATG?TGA?AGA?CTG?ACA-3』。帶有T/T基因型的豬產仔數高於T/C和C/C基因型。本發明的有益效果在於：運用全基因組重測序方法，能夠快速、批量地篩選與性狀相關的分子標記或候選基因，Chr13:199018050這個位點能夠作為遺傳標記用於豬的遺傳育種提高母豬的產仔數。
【專利說明】豬13號染色體上一個與產仔數相關的分子標記及其引物
【技術領域】:
[0001]本發明涉及與豬產仔數性狀相關的分子標記，具體涉及豬13號染色體上一個與產仔數相關的分子標記及其引物，屬生物【技術領域】。
【背景技術】:
[0002]豬的產仔數性狀是豬繁殖性狀的主要組成部分，提高豬產仔數對提高養豬業的總體經濟效益意義重大。但產仔數屬於遺傳力很低的數量性狀，難以用常規育種技術進行遺傳改良。我國的太湖豬以高產而聞名，窩產仔數比大多數其它中國地方豬種以及國外豬種的窩產仔數多4-5頭(《中國豬品種志》張仲葛主編，上海科技出版社，1986)。二花臉豬是太湖豬的一種，是世界上繁殖力最高的豬種。太湖豬中與高產仔數相關的多態位點，能夠作為遺傳標記用於提高母豬的產仔數。
[0003]國內外研究人員採用全基因組掃描和候選基因的方法對產仔數性狀進行QTL定位及候選基因的研究。Li 等人(Li, K., J.Ren, et al.Anim Genet.2009.40(6): 963-966)利用覆蓋了豬19條染色體的183個微衛星標記對與豬產仔數相關的總產仔數，產活仔數，產死仔數進行QTL (Quantitative Trait Locus,數量性狀基因座)定位。他們研究了 299個杜洛克豬與中國二花臉豬雜交的F2代，在6，7，8和15號染色體上定位了與總產仔數，產活仔數和產死仔數相關的QTL。
[0004]Rothschild 等(Rothischild, M.，Jacobson, D.et al.Proc Natl Acad Sci U SA.1996.93(1):201-205)通過候選基因法，利用包括中國梅山系太湖豬在內的兩個極端品種雜交，發現I號染色體上雌激素受體座位的一個基因(ESR)與高產仔數主效基因連鎖。通過雌激素受體基因座位的RFLPs分析，認為具有3.7kb條帶的純合型母豬(BB型)比具有4.3kb條帶的純合型母豬(AA型)初產時要多2.3頭(P〈0.01)，每胎平均多產1.5頭(Ρ〈0.01)。目前已報導與產仔數相關的基因還有0PN(US6410227B1)，PRLR(Tomas, A.，J.Casellas, et al.J Anim Sc1.2006.84 (8): 1991-199`8), FSHβ (Zhao, Y.Li N, et al.SciChina C Life Sc1.1998.41(6):664-668)和 RBP4(Spotter, A.，S.Muller, et al.ReprodDomest Anim.2009.44(1):100-105)等。
[0005]應用QTL定位方法可以定位與性狀緊密連鎖的區域，但是需要研究幾代家系的很多個體，周期長，費時費力，在一般的實驗室無法完成，而且有些QTL定位很寬泛。利用候選基因法對性狀進行研究，相對來說簡單直接，但是利用候選基因法主要研究的是外顯子區域的突變，而很多發揮重要功能的突變很可能在內含子或者其它功能區域；有些複雜性狀是受到多基因調控的；不能檢出所有的QTL，而且有些用候選基因法研究的基因並沒有找到QTL的定位。
[0006]隨著技術的發展和成熟，基因組及基因注釋越來越完善。由於測序技術的快速發展，測序成本的降低，能夠利用全基因組測序或者轉錄組測序對性狀相關基因或突變位點進行批量篩選。本發明選擇二花臉豬(太湖豬的一種)，藏豬，巴馬香豬，萊蕪豬，滇南小耳豬等5個中國地方豬種以及野豬進行了全基因組重測序。希望從中篩選出與高產仔數相關的SNPs (single nucleotide polymorphisms,單核苷酸多態性)位點作為遺傳標記用於豬的遺傳育種，以提高母豬的產仔數。

【發明內容】
:
[0007]本發明的目的是提供豬13號染色體上一個與產仔數相關的分子標記及其引物。
[0008]本發明選擇了二花臉豬(太湖豬的一種)，藏豬，巴馬香豬，萊蕪豬，及滇南小耳豬5個中國地方豬種以及野豬進行了全基因組重測序。6個豬種的重測序個體數分別為11個，
11個，9個，10個，10個和10個。重測序數據跟參考基因組(NCBI Build Sscrofal0.2)進行比對，利用SAMTools軟體進行SNPs位點的提取。發明人比較了二花臉豬與其它5個豬種，在13號染色體上發現一個SNP位點(基因組版本NCBI Build Sscrofal0.2的Chrl3:199018050)與豬的產仔數相關。該位點的等位基因為T和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型。該位點及其側翼序列(SEQ ID NO:1)為:
[0009]
Iagilciicc iclgaillai glaaaaicai caaaacggia lccigallca Itacltacgc60
alggcacaac iaiaaggagi Igaaalgiii iiailcalca cgaagacagi gccagggica120
gltticccaa cgtgUtaae iicaatclic icagiccggg gagliaagga Iagcigcctg180
WtttClCtt Igttaaagag atcattctgc atctctatca gttcggtcgg tgacagctga240
gaagctggtg atgttgctat `caatcctggg cagaagttac aatagatgtg aagactgaca300
[0010]
laacagiaac ttaaaaatga atatgacaaa ataaataacc tactaaccta ccctgttcca360
clcccacatc actaccctcc lacaacaaga gcaagaggca agggaaltll BmcgcccU420
latcaaaalg agctcatcgg taaacllaca ccctttccaa Iactaatcal taaaacgccg480
acagaagaaa aclgcagccl gcccagatcc gcaccllcal ttcaaclgtg clclclcacc540
alcgagctcc acttcccagt ttcclcggcc glalcccgai clgtgcttta caglaagggc600
a601
[0011]篩選到該位點後，發明人以豬的DNA為模板擴增包含該位點在內的核苷酸序列片段並進行測序，對該位點進行驗證和相關性分析。其中發明人選擇的個體是白色杜洛克X二花臉豬(太湖豬的一種)的F2後代。結果發現該位點與豬產仔數有顯著相關性。
[0012]本發明的有益效果在於:運用全基因組重測序方法，能夠快速、批量地篩選與性狀相關的分子標記或候選基因，基因組版本NCBI Build Sscrofal0.2的Chrl3:199018050這個位點能夠作為遺傳標記用於豬的遺傳育種提高母豬的產仔數。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0013]圖1為白色杜洛克X 二花臉豬F2代母豬資源群中Chrl3:199018050位點3種基因型的產仔數比較(圖中*表示兩種基因型產仔數比較時，0.01 ^ P ^ 0.05 表示P
<0.01)。具體實施方案:
[0014](I) SNP位點的群體分布特徵
[0015]本發明選擇了二花臉豬(太湖豬的一種)，藏豬，巴馬香豬，萊蕪豬，及滇南小耳豬5個中國地方豬種以及野豬進行了全基因組重測序。6個豬種的重測序個體數分別為11個，11個，9個，10個，10個和10個。重測序數據跟參考基因組(NCBI Build Sscrofal0.2)進行比對，利用SAMTools軟體進行SNPs位點的提取。發明人比較了二花臉豬與其它5個豬種，在13號染色體上發現一個SNP位點(基因組版本NCBI Build Sscrofal0.2的Chrl3:199018050)與豬的產仔數相關。從重測序的分析結果來看，其它4個中國地方豬種和野豬中該位點等位基因C的頻率平均為60%以上，而在二花臉豬中等位基因T的頻率為80%以上。
[0016](2) SNP位點的鑑定
[0017]在引物設計網站設計SNAPSHOT引物，包括一對PCR擴增引物(Chr13-PCRU:5 』 -AAGCTG GTG ATG TTG CTA TCA-3』 ；Chrl3_PCRL:5』 -TAG TGA TGT GGG AGT GGA ACA-3』)和延伸引物(Chrl3-SNPU:5』 -GAC TGA CTG ACT GAC TGA CTG TTA CAA TAG ATG TGA AGA CTGACA-3』)。該位點與其它11個位點共24條(12對)引物各取Iy I混合為新的多重PCR引物池。首先進行12重PCR反應，反應體系所用試劑為:多重PCR引物池(6.25 μ M each) 8 μ 1、dNTP(10mM each)8 μ 1、10XPCR Buffer II116μ l、MgC12(25mM Stock)234 μ l.Fast StartTaq (5U/ μ I) 24 μ I 和 ddH20460 μ I，將以上試劑混合液 8.5 μ I 和 1.5 μ IDNA (50ng/ μ I)混合成10 μ I體系進行12重PCR擴增反應。擴增反應條件為:94°C 4min ；94V 30s, 55°C 30s，72°C lmin，共40個循環。下一步進行PCR反應純化，所需試劑為:Exo I (10U/μ I) 60 μ 1、SAP(lU/y I) 130 μ 1、10XSAP Buffer35 μ I 和 ddH20125 y I，在每個樣品的 PCR 產物中加入
3.5μ I上述純化混合液離心後按以下程序進行反應:37°C 40min,96°C IOmin0然後進行單鹼基延伸反應，所需試劑為:SNAPSH0T Multiplex ready reaction MixlOO μ 1、延伸引物池(6.25 μ M each, 12 條延伸引物各取 I μ I 混合)8μ 1、5XSequencing Buffer200 μ I 和ddH20300 μ I，將以上試劑混合液6 μ I和4 μ I的純化產物混合成10 μ I體系進行延伸反應。延伸反應條件為:96°C 10s, 50°C 5s, 60°C 30s，共25個循環。接著進行延伸反應產物的純化，所需試劑為:SAP(lU/y I) 120 μ 1U0XSAP Buf f er70 μ I 和 ddH20140 μ 1，在每個樣品的延伸反應產物中加入上述3.3μ I純化混合液離心後按以下程序進行反應:37°C 40min,75°C 20min, 4°C保存備用。每個樣品取5_4 μ I上述純化後的SNAPSHOT反應產物和5_6 μ I的高純甲醯胺(H1-Di Formamide)混合成10 μ I體系離心後上樣於ABI3730XL測序儀進行基因分型，使用GeneMarker軟體分析分型結果。
[0018](注:以上4個步驟的反應試劑混合液用量均為100個樣品所需試劑量，從單鹼基延伸反應開始，需要避光進行。)
[0019](3)白色杜洛克X 二花臉繁殖性能雜交資源群構建
[0020]後續的驗證實驗所用資源群個體樣品及其性狀數據由江西農業大學動物生物技術國家重點實驗室培育基地提供。
[0021 ] 1998年12月，在江西農業大學科研豬場將從江蘇省3個二花臉豬保種場購買的二花臉母豬進行場間血緣的交叉配種。2001年I月根據親本產仔性能，從3頭公豬和11頭母豬的純繁後代中選擇了 17頭二花臉母豬作為資源群體的祖代母本。把Sygen PIC公司惠贈的2頭優質白色杜洛克公豬作為資源家系的祖代父本。將這2頭白色杜洛克和17頭二花臉豬雜交產生的F1代個體進行配種，避免全同胞交配，且每頭公豬通常與同一頭母豬配種，以獲得大樣本的F2半同胞家系。2003年I月、3月和6月，項目組分別將第I批和第2批F2母豬送往江西省宜春市畜牧良種場(59頭)、江西省國營紅星種豬場(52頭)和江西上猶縣四元雜交豬場(118頭)用於母豬繁殖性狀的測定。
[0022](4) SNP位點在雜交資源群F2代母豬群體的基因分型
[0023]按照上述步驟(2)所述的方法，以192個白色杜洛克X 二花臉豬雜交資源群&代母豬個體DNA為模板檢測該SNP位點的基因型。192個F2代資源群個體中有181個個體成功分型，3種基因型C/C，T/C和T/T的個體數分別是35，88和58。
[0024](5) SNP位點對產仔數性狀的調控效應
[0025]在F2代資源群個體中，帶有C/C基因型個體的平均產仔數為10.5355，標準差為
0.9556 ;帶有T/C基因型個體的平均產仔數為10.5797，標準差為0.8858 ;帶有T/T基因型個體的平均產仔數為11.5227，標準差為0.9228。
[0026]本發明採用一般線性模型(GLM)分析了 SNP位點對豬總產仔數、產活仔數的影響。全部統計分析採用SAS軟體進行。模型如下:
[0027]Yijkim_u+^i+Gj+Bk+P1+eijklm
[0028]其中Yijklm為豬總產仔數或產活仔數，U為群體均值，Ai為第i個個體的加性效應，Gj為第j個SNP位點基因型的固定效應，Bk為批次效應(k=l，2，3，4)，P1為隨機效應(1=1，2，3)。
[0029]分析結果發現Chrl3:199018050這個SNP位點跟產仔數有顯著相關性(如圖1所示)。雖然帶有T/T基因型的F2代母豬的產仔數與帶有C/C基因型的母豬之間沒有顯著性差異(P=0.0835)，但是帶有T/T基因型的F2代母豬的產仔數比帶有C/C基因型的母豬平均多0.98，帶有T/T基因型的F2代母豬的產仔數比帶有T/C基因型的母豬平均多0.94(P=0.0393)，從圖1看出，帶有C/C基因型的母豬產仔數最低。T為提高豬產仔數的有益等位基因。
[0030]從SNP位點與 產仔數相關性分析看出，Chrl3:199018050這個SNP位點能夠作為分子標記應用於分子標記輔助選擇(MAS)來提高母豬的產仔數。
【權利要求】
1.豬13號染色體上一個與產仔數相關的分子標記，其特徵在於:該分子標記位點為基因組版本NCBI Build Sscrofal0.2的Chrl3:199018050，該位點的等位基因為T和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型。
2.權利要求1的分子標記，其中所述三種基因型特徵在於:帶有T/T基因型的豬產仔數高於帶有T/C和C/C基因型的豬。
3.權利要求1的分子標記，其中所述等位基因T為提高豬產仔數的有益等位基因。
4.權利要求1的分子標記，其特徵在於:該分子標記位點及其側翼序列如SEQID NO:1所示。
5.權利要求1-4的分子標記，其中所述豬為太湖豬的後代。
6.以豬的DNA為模板擴增包含權利要求1-5所述分子標記在內的核苷酸序列片段。
7.以豬的DNA為模板對包含權利要求1-5所述分子標記在內的核苷酸序列片段進行測序。
8.擴增權利要求1所述分子標記位點的引物及延伸引物為:
Chrl3-PCRU:5』 -AAG CTG GTG ATG TTG CTA TCA-3』 ；
Chrl3-PCRL:5』 -TAG TGA TGT GGG AGT GGA ACA-3』 ；
Chrl3-SNPU:5』 -GAC TGA CTG ACT GAC TGA CTG TTA CAA TAG ATG TGA AGA CTGACA-3，。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757009SQ201310729478
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年12月26日
【發明者】張亞平, 黃路生, 謝海兵, 任軍, 艾華水, 徐丹 申請人:中國科學院昆明動物研究所, 江西農業大學