一種檢測Notch信號通路的試劑、PCR檢測方法及其應用的製作方法

2023-12-03 01:49:11

一種檢測Notch信號通路的試劑、PCR檢測方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測細胞內Notch信號通路的試劑、PCR檢測方法及其應用，本發明所述檢測試劑包括檢測ADAM10基因、ADAM17基因、AES基因、CBL基因、CCND1基因、CD44基因等PCR反應引物以及相應的內參調控基因GAPDH、ACTB、B2M的引物。本發明提供了檢測NOTCH信號通路核心分子變化的試劑，藉助於所述檢測試劑可以通過實時螢光定量PCR在轉錄水平快速檢測出與NOTCH通路相關的基因，在此基礎上分析研究腫瘤NOTCH信號通路的核心分子及作用機理，從而快速準確的找到腫瘤相關藥物的NOTCH調節信號通路，為抗癌藥物篩選、新靶向藥物的機制探討等提供了有力的工具。
【專利說明】—種檢測Notch信號通路的試劑、PCR檢測方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學領域，尤其涉及一種檢測Notch信號通路的試劑、PCR檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002]Notch信號是一種遺傳進化上高度保守，反映相鄰細胞間通信作用的一種信號通路，其不僅在細胞正常發育、分化增殖和凋亡中起著重要的作用，而且與多種腫瘤的發生和發展具有相關性。
[0003]Notch信號通路由跨膜的受體、配體和核內結合蛋白及靶基因組成，Notch受體包括Notch細胞外結構域和跨膜區/Notch細胞內結構域，是具有細胞表面受體和核內轉錄調控雙重功能的單鏈跨膜蛋白。目前發現在哺育動物有4種Notch受體，即Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4,它們通常由相鄰細胞的Notch配體相互觸發而活化。Notch配體也是表達於細胞表面的單鏈跨膜蛋白，在果蠅中被命名為Delta和Serrate，在線蟲中被命名為Lag-2,因此Notch配體又名DSL (Delta/Serrate/Lag-2)蛋白。DSL高度保守，哺乳動物中與Delta高度同源的配體被稱為Delta或Delta樣(Delta-like, DLL),與Serrate高度同源的被稱為 Serrate 或 Jagged,即 5 種配體分別為 Delta-l、Delta_3、Delta_4、Jagged-Ι 和Jagged-2,在與相鄰細胞Notch受體的結合及活化過程中具有關鍵性作用。當Notch受體被相應的配體觸發並與其DSL結構域結合，經過Y -分泌酶等介導的2次蛋白酶切後，Notch受體的活化形式一具有核定位信號的NICD被釋放入細胞質中，並易位轉移入細胞核，通過與轉錄因子結合，發揮對靶基因的調控作用。
[0004]腫瘤的發生 和發展是許多因素共同作用的結果。近年來越來越多的證據顯示，Notch信號通路除了與多種實體瘤的發生和發展有關外，在腸道中激活的Notch信號通路可能通過促進腫瘤幹細胞增殖而形成腸腫瘤，表明Notch信號在消化系統腫瘤的形成中也起到十分關鍵的作用，並在同一種腫瘤的不同類型或不同發展階段中扮演著不同的角色，既可表現為致瘤性，又可表現為抑癌性。
[0005]儘管Notch信號在生命起源的過程中發揮著重要的作用，在少數腫瘤中也表現出抑癌性，但是異常的Notch信號與腫瘤的發生和發展有著千絲萬縷的聯繫，對Notch信號與相關疾病，特別是與腫瘤之間的分子機制，有待進一步加以說明。最大限度地發揮Notch信號通路抑癌基因的作用和開發以Notch信號通路為靶點的新藥具有廣闊的應用前景，也將為腫瘤治療開闢新的途徑。

【發明內容】

[0006]本發明針對現有技術中如何確定NOTCH核心信號分子的調控，如何解釋核心分子在腫瘤細胞中的變化的困難，提供了一種檢測Notch信號通路的試劑和PCR檢測方法，本發明將涉及細胞凋亡的信號分子集中在一個平板上，通過做一次實時螢光定量PCR反應，反應細胞的生存狀態，探討在乳腺癌細胞系中引起NOTCH信號通路變化的可能靶分子與靶途徑，為研究核心NOTCH信號蛋白的調節提供最直接的證據。
[0007]為實現上述發明目的，本發明採用下述技術方案予以實現:
[0008]一種檢測Notch信號通路的試劑，它包括以下引物:
[0009](I)檢測ADAMlO基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0010]5』-ATGGGAGGTCAGTATGGGAAT-3』 ；
[0011]5』-ACTGCTCTTTTGGCACGC-3』 ；
[0012](2)檢測ADAM17基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0013]5』-ATGTTTCACGTTTGCAGTCTC-3』 ；
[0014]5』-AGAAGCGATGATCTGCTACC-3』 ；
[0015](3)檢測AES基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0016]5，-ACCCCAGCAACTCAAATTCA-3，；
[0017]5』-AAGCCGTAGGACATCTCGTA-3』 ；
[0018](4)檢測CBL基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0019]5』-TGGTGCGGTTGTGTCAGA-3』 ；
[0020]5』-GGTAGGTATCTGGTAGCAGG-3』 ；
[0021](5)檢測CCNDl基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0022]5，-GCTGCGAAGTGGAAACCAT-3，；
[0023]5』-CCTCCTTCTGCACACATTTGA-3』 ；
[0024](6)檢測⑶44基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0025]5』-CCCATCCCAGACGAAGACA-3』 ；
[0026]5』-GCCATTTGTGTTGTTGTGTGA-3』 ；
[0027](7)檢測⑶KNlA基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0028]5』-TGTCCGTCAGAACCCATG-3』 ；
[0029]5』-AAAGTCGAAGTTCCATCGCT-3』 ；
[0030](8)檢測CFLAR基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0031]5』-AGAGTGAGGCGATTTGACCT-3』 ；
[0032]5』-GTCCGAAACAAGGTGAGGGT-3』 ；
[0033](9)檢測CHUK基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0034]5』-ATGAAGAAGTTGAACCATGCC-3』 ；
[0035]5』-CCTCCAGAACAGTATTCCATTG-3』 ；
[0036](10)檢測CTNNBl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0037]5』-ATGTCCAGCGTTTGGCTGA-3』 ；
[0038]5』-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGT-3』 ；
[0039](11)檢測DLLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0040]5』-TGTGACGAACACTACTACGG-3』 ；
[0041]5』-AGCCAGGGTTGCACACTT-3』 。
[0042](12)檢測DLL3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0043]5』-GCCAGAGCTTTTCCACTGATT-3』 ；
[0044]5，-GCGTCAGGCCTAGAAACAAAA-3，；[0045](13)檢測DLL4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0046]5，-ACCTTCTCGCTCATCATCGA-3，；
[0047]5』-CCTGGATGGCGATCTTGC-3』 ；
[0048](14)檢測DTXl基因的PCR反應引物，其引物序列如下: [0049]5』-CAGTCCATGCACCAGTTTC-3』 ；
[0050]5』-TCCATATCGTAGGCCGTCCA-3』 ；
[0051](15)檢測ERBB2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0052]5，-GCTCATCGCTCACAACCAAG-3，；
[0053]5』-ACAGGGGTGGTATTGTTCAG-3』 ；
[0054](16)檢測FOSLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0055]5』-CAGGCGGAGACTGACAAACT-3』 ；
[0056]5』-TCCTTCCGGGATTTTGCAGA-3』 ；
[0057](17)檢測FZDl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0058]5』-ATCTTCTTGTCCGGCTGTTAC-3』 ；
[0059]5』-GTCCTCGGCGAACTTGTCAT-3』 ；
[0060](18)檢測FZD2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0061]5』-GTGCCATCCTATCTCAGCTAC-3』 ；
[0062]5』-CTGCATGTCTACCAAGTACGT-3』 ；
[0063](19)檢測FZD3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0064]5』-GGATTGTTCTCGGGATTTCC-3』 ；
[0065]5』-AGTGTGACACGTCCATATTCC-3』 ；
[0066](20)檢測FZD4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0067]5』-GTCTTTCAGTCAAGAGACGCT-3』 ；
[0068]5』-GTTGTGGTCGTTCTGTGGT-3』 ；
[0069](21)檢測FZD6基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0070]5』-GTGCAACTCTGTTCACATTCC-3』 ；
[0071]5』-GCTATCGCCTAGCAAAAATCC-3』 ；
[0072](22)檢測FZD7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0073]5』-GTGCCAACGGCCTGATGT-3』 ；
[0074]5，-AGGTGAGAACGGTAAAGAGC-3，；
[0075](23)檢測GBP2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0076]5』-TTTCCAGCATTTGTGTGGAC-3』 ；
[0077]5』-GGGAAGAACTTTCGGATGCA-3』 ；
[0078](24)檢測Glil基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0079]5，-TTCCTACCAGAGTCCCAAG-3，；
[0080]5』-CCCTATGTGAAGCCCTATT-3』 ；
[0081](25)檢測GSK3B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0082]5，-GGCAGCATGAAAGTTAGCAG-3，；
[0083]5』-GGCGACCAGTTCTCCTGAAT-3』 ；[0084](26)檢測HESl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0085]5，-ACACGACACCGGATAAACCA-3，；
[0086]5』-GCCGCGAGCTATCTTTCTTC-3』 ；
[0087](27)檢測HEYl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0088]5』-ATCTGCTAAGCTAGAAAAAGCC-3』 ；
[0089]5』-CGTCAAAGTAACCTTTCCCTCC-3』 ；
[0090](28)檢測HEYL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0091]5』-GGCTGCTTACGTGGCTGT-3』 ；
[0092]5，-GACCCAGGAGTGGTAGAGCA-3，；
[0093](29)檢測H0XB4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0094]5，-CGTGAGCACGGTAAACCC-3，；
[0095]5』-CGAGCGGATCTTGGTGTT-3』 ；
[0096](30)檢測HR基因 的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0097]5』-CCCAGAGCATCCATGTGACT-3』 ；
[0098]5』-TGCCCACCAGAGTTTAAGC-3』 ；
[0099](31)檢測IFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0100]5』-TCGGTAACTGACTTGAATGTCC-3』 ；
[0101]5』-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTG-3』 ；
[0102](32)檢測IL17B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0103]5，-GAGCCCCAAAAGCAAGAGGA-3，；
[0104]5』-TGCGGGCATACGGTTTCAT-3』 ；
[0105](33)檢測IL2RA基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0106]5』-GTGGGGACTGCTCACGTT-3』 ；
[0107]5，-GGATCTCTGGCGGGTCAT-3，；
[0108](34)檢測ITGAl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0109]5，-CTGGACATAGTCATAGTGCTGG-3，；
[0110]5』-ACCTGTGTCTGTTTAGGACC-3』 ；
[0111](35)檢測ITGA2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0112]5』-GGGAATCAGTATTACACAACGG-3』 ；
[0113]5』-CCACAACATCTATGAGGGAAGG-3』 ；
[0114](36)檢測ITGA3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0115]5』-TGTGGCTTGGAGTGACTGT-3』 ；
[0116]5，-TCATTGCCTCGCACGTAG-3，；
[0117](37)檢測ITGA4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0118]5，-GGTAGCCCTAATGGAGAACC-3，；
[0119]5』-TATGCCCACAAGTCACGATG-3』 ；
[0120](38)檢測ITGAV基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0121]5』-CCCCATTGTACCATTGGAGAA-3』 ；
[0122]5』-TGGAGCATACTCAACAGTCTTT-3』 ；[0123](39)檢測ITGBl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0124]5』-CAAGAGAGCTGAAGACTATCCC-3』 ；
[0125]5』-TGAAGTCCGAAGTAATCCTCC-3』 ；
[0126](40)檢測ITGB3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0127]5，-GTGACCTGAAGGAGAATCTG-3，；
[0128]5』-CCGGAGTGCAATCCTCTG-3』 ；
[0129](41)檢測ITGB5基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0130]5』-GGAAGTTCGGAAACAGAGGG-3』 ；
[0131]5』-CTTTCGCCAGCCAATCTTCT-3』 ；
[0132](42)檢測JAGl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0133]5』-GGGGCAACACCTTCAACCT-3』 ；
[0134]5』-CCAGGCGAAACTGAAAGG-3』 ；
[0135](43)檢測JAG2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0136]5』-TGGGCGGCAACTCCTTCT-3』 ；
`[0137]5』-GCCTCCACGATGAGGGTAA-3』 ；
[0138](44)檢測KAT2B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0139]5，-GAAAAACCCTAACCCCTCAC-3，；
[0140]5』-CCTTGTGGACACAGGTAAAGAG-3』 ；
[0141](45)檢測KRTl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0142]5』-GGTGCTTATATGACCAAGGTG-3』 ；
[0143]5』-ATGCTGTCCAGGTCGAGAC-3』 ；
[0144](46)檢測LFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0145]5，-GTCAGCGAGAACAAGGTG-3，；
[0146]5』-GATCCGCTCAGCCGTATTCA-3』 ；
[0147](47)檢測LM02基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0148]5』-GACAAGCGGATTCGTGCCTA-3』 ；
[0149]5』-AGTTGATGAGGAGGTATCTGTC-3』 ；
[0150](48)檢測MAP2K7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0151]5』-TGCTTTGGGACGTTCATCAC-3』 ；
[0152]5』-CCACTGTCATCTTGCCCAGA-3』 ；
[0153](49)檢測MFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0154]5』-TGCTGAGTTCGACACCTTCT-3』 ；
[0155]5，-GCCCTTGGGTTCACATAGTT-3，；
[0156](50)檢測MMP7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0157]5，-GAGTGAGCTACAGTGGGAAC-3，；
[0158]5』-CTATGACGCGGGAGTTTAACA-3』 ；
[0159](51)檢測MYCLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0160]5』-GCCACCCCAAACCTGTCA-3』 ；
[0161]5』-GGCCTTGCTTAGGATCACTACT-3』 ；[0162](52)檢測NC0R2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0163]5』-TGCAGATCATCTACGACGAG-3』 ；
[0164]5』-TCCGCATCGCCTGGTTTATT-3』 ；
[0165](53)檢測NESTIN基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0166]5』-AGCCCTGACCACTCCAGTTTA-3』 ；
[0167]5』-CCCTCTATGGCTGTTTCTTTCTC-3』 ；
[0168](54)檢測NEURL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0169]5』-GTGTCTTCCACCGCATCAA-3』 ；
[0170]5』-ACCAGCTCGCTATCAAGCA-3』 ；
[0171](55)檢測NFKBl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0172]5，-GAAGCACGAATGACAGAGG-3，；
[0173]5』-GCTTGGCGGATTAGCTCTTT-3』 ；
[0174](56)檢測NFKB2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0175]5』-ATGGAGA GTTGCTACAACCC-3』 ；
[0176]5』-CTGTTCCACGATCACCAGGT-3』 ；
[0177](57)檢測Notchl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0178]5』-ATCGACGATTGTCCAGGAAAC-3』 ；
[0179]5』-TACTGACCTGTCCACTCTGGC-3』 ；
[0180](58)檢測N0TCH2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0181]5』-AAGCAGAGTCCCAGTGCCT-3』 ；
[0182]5』-CAGGGGGCACTGACAGTAA-3』 ；
[0183](59)檢測N0TCH2NL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0184]5』-TGTGACAGCCTGTATGTGC-3』 ；
[0185]5』-TGAGCAGCTTAGGAAAGATTG-3』 ；
[0186](60)檢測N0TCH3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0187]5』-TGTGGACGAGTGCTCTATC-3』 ；
[0188]5』-AATGTCCACCTCGCAATAG-3』 ；
[0189](61)檢測N0TCH4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0190]5』-CTAGGGGCTCTTCTCGTCC-3』 ；
[0191]5』-CAACTTCTGCCTTTGGCTT-3』 ；
[0192](62)檢測NR4A2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0193]5』-GCCACCTTGCTTGTACCAAA-3』 ；
[0194]5』-GGCTTGTAGTAAACCGACCC-3』 ；
[0195](63)檢測NUMB基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0196]5，-TCAGCAGATGGACTCAGAGT-3，；
[0197]5』-AGGCTCTATCAAAGTTCCTGTC-3』 ；
[0198](64)檢測PAX5基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0199]5』-ACTTGCTCATCAAGGTGTCA-3』 ；
[0200]5』-TCCTCCAATTACCCCAGGCT-3』 ；[0201](65)檢測PDPKl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0202]5』-ACGGAGAAGTCCGCCTGTA-3』 ；
[0203]5』-CTCGTTTCCAGCTCGGAAT-3』 ；
[0204](66)檢測POFUTl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0205]5』-AACCAGGCCGATCACTTCTT-3』 ；
[0206]5』-GTTGGTGAAAGGAGGCTTGT-3』 ；
[0207](67)檢測PPARG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0208]5，-GGGATCAGCTCCGTGGATC-3，；
[0209]5』-TGCACTTTGGTACTCTTGAAGT-3』 ；
[0210](68)檢測PSENl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0211]5，-GACGACCCCAGGGTAACT-3，；
[0212]5，-ACTGACTTAATGGTAGCCACG-3，；
[0213](69)檢測PSEN2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0214]5』-ACCGC TATGTCTGTAGTG-3』 ；
[0215]5』-CGCTCCGTATTTGAGGGTCA-3』 ；
[0216](70)檢測PSENEN基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0217]5』-CTGGAGCGAGTGTCCAATGA-3』 ；
[0218]5』-GCGCCAGACATAGCCTTTGA-3』 ；
[0219](71)檢測RFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0220]5』-CGCCAGCAGACGTTTATCTT-3』 ；
[0221]5』-CCGAGCAGTTGGTGTTGAT-3』 ；
[0222](72)檢測RUNXl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0223]5』-CTGCCCATCGCTTTCAAGG-3』 ；
[0224]5』-GCCGAGTAGTTTTCATCATTGC-3』 ；
[0225](73)檢測SELlL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0226]5』-AAACCAGCTTTGACCGCCA-3』 ；
[0227]5，-GTCATAGGTTGTAGCACACCA-3，；
[0228](74)檢測SH2D1A基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0229]5』-GACAGCACCTGGGGTACATA-3』 ；
[0230]5』-TGCAGAGGTATTACAATGCCTT-3』 ；
[0231](75)檢測SHH基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0232]5』-CTCGCTGCTGGTATGCTC-3』 ；
[0233]5』-ATCGCTCGGAGTTTCTGGAG-3』 ；
[0234](76)檢測Smo基因的PCR反應引物,其引物序列如下:
[0235]5』-GTTCTCCATCAAGAGCAACCA-3』 ；
[0236]5』-CGATTCTTGATCTCACAGTCAG-3』 ；
[0237](77)檢測SNWl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0238]5』-GGATACCGGAAAGGCTGGAT-3』 ；
[0239]5』-TGACTGTCCTTGTCGAGCAA-3』 ；[0240](78)檢測STAT6基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0241]5』-GTTCCGCCACTTGCCAAT-3』 ；
[0242]5』-GTTCCGCCACTTGCCAAT-3』 ；
[0243](79)檢測SUFU基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0244]5』-CCAGGTTACCGCTATCGTCA-3』 ；
[0245]5』-CGAAGCTGATGTAGTGCCAG-3』 ；
[0246](80)檢測TEADl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0247]5』-ATGGAAAGGATGAGTGACTCTG-3』 ；
[0248]5，-TCCCACATGGTGGATAGATAG-3，；
[0249](81)檢測TLEl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0250]5』-GAGTCCCTGGACCGGATTAA-3』 ；
[0251]5』-AATACATCACATAGTGCCTCTG-3』 ；
[0252](82)檢測WISPl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0253]5』-TGCTGTAAG ATGTGCGCTCA-3』 ；
[0254]5』-ACACTCCTATTGCGTACCTC-3』 ；
[0255](83)檢測WNTlI基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0256]5』-GGAGTCGGCCTTCGTGTAT-3』 ；
[0257]5』-GCTGAGGTTGTCCGCACA-3』 ；
[0258](84)檢測ZIC2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0259]5』-CACCTCCGATAAGCCCTATC-3』 ；
[0260]5，-GGCGTGGACGACTCATAG-3，。
[0261]所述試劑還含有內參調控基因GAPDH、ACTB、B2M的PCR反應引物。
[0262]檢測GAPDH基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0263]5，-ACTGCCACCCAGAAGAC-3，；
[0264]5』-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3』 ；
[0265]檢測ACTB基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0266]5』-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3』 ；
[0267]5』-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3』 ；
[0268]檢測B2M基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0269]5』-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3』 ；
[0270]5』-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3』 。
[0271]本發明還提供了用所述檢測試劑檢測細胞NOTCH信號通路的PCR檢測方法，所述PCR檢測方法為實時螢光定量PCR方法。
[0272]對上述技術方案的進一步改進:所述實時螢光定量PCR的反應體系為:Taq聚合酶反應混合液10 μ I,上遊引物0.2 μ mol,下遊引物0.2 μ mol, cDNA模板50ng,滅菌蒸懼水補足到20 μ I。
[0273]對上述技術方案的進一步改進:所述Taq聚合酶為TaKaRa公司的2><SYBR?PremixEx Taq 聚合酶。
[0274]對上述技術方案的進一步改進:所述實時螢光定量PCR的反應程序為:95°C預變性，30秒；95°C變性，5 #,60°C，20秒，進行40個循環。
[0275]本發明還提供了所述的試劑在製備檢測癌細胞的檢測試劑中的應用，所述癌細胞為肺癌細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞和肝癌細胞。
[0276]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:本發明提供了檢測NOTCH信號通路核心分子變化的試劑，藉助於所述檢測試劑可以通過實時螢光定量PCR在轉錄水平快速檢測出與NOTCH相關的基因，在此基礎上分析研究腫瘤NOTCH信號通路的核心分子及作用機理，從而快速準確的找到腫瘤相關藥物的NOTCH調節信號通路，為抗癌藥物篩選、新靶向藥物的機制探討等提供了有力的工具。
[0277]同時本發明還提供了檢測的PCR方法，所述實驗體系可以在任何一臺實時螢光定量PCR儀器上進行，其PCR反應儀器為羅氏公司的LightCycler480。將上述引物置於96孔板中，進行實時螢光定量PCR檢測。可以通過一次反應獲得關於NOTCH信號通路核心分子的變化。實驗操作簡便，費用低廉，結果重複性好，有利於減少下遊不必要的檢測，是研究腫瘤相關藥物作用機理的一種重要手段。
[0278]結合附圖閱讀本發明的【具體實施方式】後，本發明的其他特點和優點將變得更加清楚。【專利附圖】

【附圖說明】
[0279]圖1表明了本發明利用NOTCH信號通路篩選出乳腺癌細胞系HS578T與正常乳腺細胞系HS578BST差異表達的基因，其中1:HS578T細胞；2:HS578BST細胞。
[0280]圖2實時螢光定量PCR檢測NOTCH信號通路基因的表達。
[0281]圖3溶解曲線分析NOTCH信號通路基因的表達。
[0282]圖4乳腺癌/正常乳腺細胞中NOTCH信號通路基因表達的差異。
【具體實施方式】
[0283]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。
[0284]實施例1
[0285]本發明通過乳腺癌細胞進行舉例說明，但是本發明並不限於乳腺癌，本發明所述檢測試劑可以應用於包括乳腺癌、肺癌、肝癌等常見癌症。
[0286]本發明通過培養兩種細胞系:人乳腺癌細胞系HS578T、人乳腺正常細胞系HS578BST，然後利用NOTCH信號通路檢測試劑檢測兩種細胞系中核心NOTCH分子的變化。
[0287]本發明中所用的人乳腺癌細胞系HS578T、人乳腺正常細胞系HS578BST購自美國ATCC公司，DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，用於提取總RNA的RNAiso，逆轉錄試劑盒，2XSYBR? Premix Ex Taq試劑盒購買自TaKaRa。
[0288]利用本發明所述試劑檢測細胞內NOTCH信號通路包括以下具體步驟:
[0289]一、人乳腺癌細胞系HS578T、人乳腺正常細胞系HS578BST的培養與傳代
[0290]以HS578T細胞為例，在60mm細胞培養板內加入ImL0.2%胰酶溶液，輕輕搖動以使胰酶與細胞充分接觸，37°C二氧化碳孵箱內孵育2min，鏡下觀察大部分細胞浮起後，加入4mL含10%FBS的DMEM培養基，吹勻後加入15mL離心管內，2000g離心6min，棄去上清，根據細胞種類加入相應的適當體積培養液，用IOmL移液管反覆吹打數次，使細胞游離。此過程中避免產生氣泡，以免影響細胞計數。取細胞懸液20 μ L,滴入細胞計數板內，按細胞計數法計量四角四大格內細胞總數。計數時僅計數細胞形態完整的細胞，堆積的細胞按I個細胞計算。計算公式如下:
[0291]細胞濃度(個/mL)= (4大格細胞總數)X IO4X稀釋倍數/4。
[0292]根據細胞種類用相應的培養液細胞懸液稀釋至5 X IO6個/mL，在60mm細胞培養皿內加入細胞，每板2mL此細胞稀釋液，置於37°C、5%C02細胞培養箱中培養，細胞一般在
0.5h-lh後貼壁，數小時後開始生長，24h-48h後成為單層細胞。
[0293]二、總RNA的提取
[0294]I)取CO2孵箱中處於對數生長期60mm平皿的細胞一盤，吸掉培養液後，用無菌IXPBS清洗2次後，在細胞表面加ImL RNAiso，用槍頭反覆抽吸均勻，轉入無菌管中。
[0295]2)室溫培育5min,以溶解核蛋白。加0.2mL酹/氯仿(1:1),劇烈振蕩15sec,室溫孵育2-3min。
[0296]3)4°C，12000g離心15min，細胞會產生分層。
[0297]4)將上層液體轉至無RNase的離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻3次，室溫培育IOmin。
[0298]5) 4°C, 12000g 離心 IOmin, RNA 形成底部沉澱。
[0299]6)棄上清，用無RNase的75%乙醇ImL洗滌沉澱。4°C，7000g離心5min。
`[0300]8)空氣中乾燥RNA約5-10min。不宜太幹。
[0301]9)用 30-50 μ L DEPC 水溶解 RNA。
[0302]實驗結果如圖1所示，圖1所示的是提取兩種細胞總RNA，然後進行電泳的結果，其中I泳道代表HS578BST細胞，2泳道為HS578T細胞。
[0303]三、cDNA的合成
[0304]I)在預冷的試管中加入下列反應混合物:
[0305]總RNA1-5 μ g
[0306]oligo (dT) (0.5 μ g/ μ I) IyL
[0307]用RNase-free 水定容至 12 μ L。
[0308]2)混勻，離心 3_5sec。
[0309]3) 70°C作用 5min 後冰浴 30sec,離心 3_5sec。
[0310]4)將試管冰浴，再加入如下組分:
[0311]5 X Reaction buffer4 μ L
[0312]Rnase Inhibiter (20U/ μ L) IuL
[0313]dNTP mix(IOmM)2μ L
[0314]5)輕輕混勻，離心3_5sec。
[0315]6) 37°C水浴 5min,加 I μ L 的 M-MuLV Reverse Transcriptase (20U/ μ L),混勻。
[0316]7) 37°C作用60min。70°C孵育IOmin結束反應，置冰上進行下遊試驗。
[0317]四、實時螢光定量PCR
[0318]取合成好的cDNA為模板，按照以下體系進行實時螢光定量PCR反應:
[0319]2xSYBR? Premix Ex Taq10 pL
上遊引物0.2μηιο1
下遊引物0.2μηιο1
cDNA 模板50ng
DW補足體積至20 pL
[0320]在羅氏的LightCycler480儀器上設置如下程序:95°C預變性，30秒；95°C變性，5秒，60°C，20秒，進行40個循環。溶解曲線分析95°C，15秒，至65°C，I分鐘，按照4.4°C /秒進行梯度降溫。
[0321](I)檢測ADAMlO基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0322]5』-ATGGGAGGTCAGTATGGGAAT-3』 ；(SEQ ID No:1)
[0323]5』-ACTGCTCTTTTGGCACGC-3』 ；(SEQ ID No:2)
[0324](2)檢測ADAM17基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0325]5』-ATGTTTCACGTTTGCAGTCTC-3』 ；(SEQ ID No:3)
[0326]5』-AGAAGCGATGATCTGCTACC-3』 ；(SEQ ID No:4)
[0327](3)檢測AES基因的的PCR反應引物，其引物序列如下: [0328]5』-ACCCCAGCAACTCAAATTCA-3』 ；(SEQ ID No:5)
[0329]5』-AAGCCGTAGGACATCTCGTA-3』 ；(SEQ ID No:6)
[0330](4)檢測CBL基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0331]5』-TGGTGCGGTTGTGTCAGA-3』 ；(SEQ ID No:7)
[0332]5』-GGTAGGTATCTGGTAGCAGG-3』 ；(SEQ ID No:8)
[0333](5)檢測CCNDl基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0334]5』-GCTGCGAAGTGGAAACCAT-3』 ；(SEQ ID No:9)
[0335]5』-CCTCCTTCTGCACACATTTGA-3』 ；(SEQ ID No:10)
[0336](6)檢測⑶44基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0337]5』-CCCATCCCAGACGAAGACA-3』 ；(SEQ ID No:11)
[0338]5』-GCCATTTGTGTTGTTGTGTGA-3』 ；(SEQ ID No:12)
[0339](7)檢測⑶KNlA基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0340]5』-TGTCCGTCAGAACCCATG-3』 ；(SEQ ID No:13)
[0341]5』-AAAGTCGAAGTTCCATCGCT-3』 ；(SEQ ID No:14)
[0342](8)檢測CFLAR基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0343]5』-AGAGTGAGGCGATTTGACCT-3』 ；(SEQ ID No:15)
[0344]5』-GTCCGAAACAAGGTGAGGGT-3』 ；(SEQ ID No:16)
[0345](9)檢測CHUK基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0346]5』-ATGAAGAAGTTGAACCATGCC-3』 ；(SEQ ID No:17)
[0347]5』-CCTCCAGAACAGTATTCCATTG-3』 ；(SEQ ID No:18)
[0348](10)檢測CTNNBl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0349]5』-ATGTCCAGCGTTTGGCTGA-3』 ；(SEQ ID No:19)
[0350]5』-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGT-3』 ；(SEQ ID No:20)[0351](11)檢測DLLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0352]5』-TGTGACGAACACTACTACGG-3』 ；(SEQ ID No:21)
[0353]5』-AGCCAGGGTTGCACACTT-3』 ; (SEQ ID No:22)
[0354](12)檢測DLL3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0355]5』-GCCAGAGCTTTTCCACTGATT-3』 ；(SEQ ID No:23)
[0356]5』-GCGTCAGGCCTAGAAACAAAA-3』 ；(SEQ ID No:24)
[0357](13)檢測DLL4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0358]5』-ACCTTCTCGCTCATCATCGA-3』 ；(SEQ ID No:25)
[0359]5』-CCTGGATGGCGATCTTGC-3』 ；(SEQ ID No:26)
[0360](14)檢測DTXl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0361]5』-CAGTCCATGCACCAGTTTC-3』 ；(SEQ ID No:27)
[0362]5』-TCCATATCGTAGGCCGTCCA-3』 ；(SEQ ID No:28)
[0363](15)檢測ERBB2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0364]5』-GCTCATCGCTCACAACCAAG-3』 ；(SEQ ID No:29)
[0365]5』-ACAGGGGTGGTATTGTTCAG-3』 ；(SEQ ID No:30)
[0366](16)檢測FOSLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0367]5』-CAGGCGGAGACTGACAAACT-3』 ；(SEQ ID No:31)
[0368]5』-TCCTTCCGGGATTTTGCAGA-3』 ；(SEQ ID No:32)
[0369](17)檢測FZDl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0370]5』-ATCTTCTTGTCCGGCTGTTAC-3』 ；(SEQ ID No:33)
[0371]5』-GTCCTCGGCGAACTTGTCAT-3』 ；(SEQ ID No:34)
[0372](18)檢測FZD2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0373]5』-GTGCCATCCTATCTCAGCTAC-3』 ；(SEQ ID No:35)
[0374]5』-CTGCATGTCTACCAAGTACGT-3』 ；(SEQ ID No:36)
[0375](19)檢測FZD3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0376]5』-GGATTGTTCTCGGGATTTCC-3』 ；(SEQ ID No:37)
[0377]5』-AGTGTGACACGTCCATATTCC-3』 ；(SEQ ID No:38)
[0378](20)檢測FZD4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0379]5』-GTCTTTCAGTCAAGAGACGCT-3』 ；(SEQ ID No:39)
[0380]5』-GTTGTGGTCGTTCTGTGGT-3』 ；(SEQ ID No:40)
[0381](21)檢測FZD6基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0382]5』-GTGCAACTCTGTTCACATTCC-3』 ；(SEQ ID `No:41)
[0383]5』-GCTATCGCCTAGCAAAAATCC-3』 ；(SEQ ID No:42)
[0384](22)檢測FZD7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0385]5』-GTGCCAACGGCCTGATGT-3』 ；(SEQ ID No:43)
[0386]5』-AGGTGAGAACGGTAAAGAGC-3』 ；(SEQ ID No:44)
[0387](23)檢測GBP2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0388]5』-TTTCCAGCATTTGTGTGGAC-3』 ；(SEQ ID No:45)
[0389]5』-GGGAAGAACTTTCGGATGCA-3』 ；(SEQ ID No:46)[0390](24)檢測Glil基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0391]5』-TTCCTACCAGAGTCCCAAG-3』 ；(SEQ ID No:47)
[0392]5』-CCCTATGTGAAGCCCTATT-3』 ；(SEQ ID No:48)
[0393](25)檢測GSK3B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0394]5』-GGCAGCATGAAAGTTAGCAG-3』 ；(SEQ ID No:49)
[0395]5』-GGCGACCAGTTCTCCTGAAT-3』 ；(SEQ ID No:50)
[0396](26)檢測HESl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0397]5』-ACACGACACCGGATAAACCA-3』 ；(SEQ ID No:51)
[0398]5』-GCCGCGAGCTATCTTTCTTC-3』 ；(SEQ ID No:52)
[0399](27)檢測HEYl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0400]5』-ATCTGCTAAGCTAGAAAAAGCC-3』 ；(SEQ ID No:53)
[0401]5』-CGTCAAAGTAACCTTTCCCTCC-3』 ；(SEQ ID No:54)
[0402](28)檢測HEYL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0403]5』-GGCTGCTTACGTG`GCTGT-3』 ；(SEQ ID No:55)
[0404]5，-GACCCAGGAGTGGTAGAGCA-3，；(SEQ ID No:56)
[0405](29)檢測H0XB4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0406]5，-CGTGAGCACGGTAAACCC-3， ；(SEQ ID No:57)
[0407]5』-CGAGCGGATCTTGGTGTT-3』 ；(SEQ ID No:58)
[0408](30)檢測HR基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0409]5』-CCCAGAGCATCCATGTGACT-3』 ；(SEQ ID No:59)
[0410]5，-TGCCCACCAGAGTTTAAGC-3，；(SEQ ID No:60)
[0411](31)檢測IFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0412]5』-TCGGTAACTGACTTGAATGTCC-3』 ；(SEQ ID No:61)
[0413]5』-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTG-3』 ；(SEQ ID No:62)
[0414](32)檢測IL17B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0415]5』-GAGCCCCAAAAGCAAGAGGA-3』 ；(SEQ ID No:63)
[0416]5』-TGCGGGCATACGGTTTCAT-3』 ；(SEQ ID No:64)
[0417](33)檢測IL2RA基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0418]5』-GTGGGGACTGCTCACGTT-3』 ；(SEQ ID No:65)
[0419]5，-GGATCTCTGGCGGGTCAT-3，；(SEQ ID No:66)
[0420](34)檢測ITGAl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0421]5』-CTGGACATAGTCATAGTGCTGG-3』 ；(SEQ ID No:67)
[0422]5』-ACCTGTGTCTGTTTAGGACC-3』 ；(SEQ ID No:68)
[0423](35)檢測ITGA2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0424]5』-GGGAATCAGTATTACACAACGG-3』 ；(SEQ ID No:69)
[0425]5』-CCACAACATCTATGAGGGAAGG-3』 ；(SEQ ID No:70)
[0426](36)檢測ITGA3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0427]5』-TGTGGCTTGGAGTGACTGT-3』 ；(SEQ ID No:71)
[0428]5』-TCATTGCCTCGCACGTAG-3』 ；(SEQ ID No:72)[0429](37)檢測ITGA4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0430]5，-GGTAGCCCTAATGGAGAACC-3， ；(SEQ ID No:73)
[0431]5』-TATGCCCACAAGTCACGATG-3』 ；(SEQ ID No:74)
[0432](38)檢測ITGAV基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0433]5』-CCCCATTGTACCATTGGAGAA-3』 ；(SEQ ID No:75) [0434]5』-TGGAGCATACTCAACAGTCTTT-3』 ；(SEQ ID No:76)
[0435](39)檢測ITGBl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0436]5』-CAAGAGAGCTGAAGACTATCCC-3』 ；(SEQ ID No:77)
[0437]5』-TGAAGTCCGAAGTAATCCTCC-3』 ；(SEQ ID No:78)
[0438](40)檢測ITGB3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0439]5』-GTGACCTGAAGGAGAATCTG-3』 ；(SEQ ID No:79)
[0440]5』-CCGGAGTGCAATCCTCTG-3』 ；(SEQ ID No:80)
[0441](41)檢測ITGB5基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0442]5』-GGAAGTTCGGAAACAGAGGG-3』 ；(SEQ ID No:81)
[0443]5』-CTTTCGCCAGCCAATCTTCT-3』 ；(SEQ ID No:82)
[0444](42)檢測JAGl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0445]5』-GGGGCAACACCTTCAACCT-3』 ；(SEQ ID No:83)
[0446]5』-CCAGGCGAAACTGAAAGG-3』 ；(SEQ ID No:84)
[0447](43)檢測JAG2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0448]5』-TGGGCGGCAACTCCTTCT-3』 ；(SEQ ID No:85)
[0449]5』-GCCTCCACGATGAGGGTAA-3』 ；(SEQ ID No:86)
[0450](44)檢測KAT2B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0451]5，-GAAAAACCCTAACCCCTCAC-3， ；(SEQ ID No:87)
[0452]5』-CCTTGTGGACACAGGTAAAGAG-3』 ；(SEQ ID No:88)
[0453](45)檢測KRTl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0454]5』-GGTGCTTATATGACCAAGGTG-3』 ；(SEQ ID No:89)
[0455]5』-ATGCTGTCCAGGTCGAGAC-3』 ；(SEQ ID No:90)
[0456](46)檢測LFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0457]5，-GTCAGCGAGAACAAGGTG-3， ；(SEQ ID No:91)
[0458]5』-GATCCGCTCAGCCGTATTCA-3』 ；(SEQ ID No:92)
[0459](47)檢測LM02基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0460]5』-GACAAGCGGATTCGTGCCTA-3』 ；(SEQ ID No:93)
[0461]5』-AGTTGATGAGGAGGTATCTGTC-3』 ；(SEQ ID No:94)
[0462](48)檢測MAP2K7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0463]5』-TGCTTTGGGACGTTCATCAC-3』 ；(SEQ ID No:95)
[0464]5』-CCACTGTCATCTTGCCCAGA-3』 ；(SEQ ID No:96)
[0465](49)檢測MFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0466]5』-TGCTGAGTTCGACACCTTCT-3』 ；(SEQ ID No:97)
[0467]5』-GCCCTTGGGTTCACATAGTT-3』 ；(SEQ ID No:98)[0468](50)檢測MMP7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0469]5』-GAGTGAGCTACAGTGGGAAC-3』 ；(SEQ ID No:99)
[0470]5』-CTATGACGCGGGAGTTTAACA-3』 ；(SEQ ID No:100)
[0471](51)檢測MYCLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0472]5』-GCCACCCCAAACCTGTCA-3』 ；(SEQ ID No:101)
[0473]5』-GGCCTTGCTTAGGATCACTACT-3』 ；(SEQ ID No:102)
[0474](52)檢測NC0R2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0475]5，-TGCAGATCATCTACGACGAG-3， ；(SEQ ID No:103)
[0476]5』-TCCGCATCGCCTGGTTTATT-3』 ；(SEQ ID No:104)
[0477](53)檢測NESTIN基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0478]5』-AGCCCTGACCACTCCAGTTTA-3』 ；(SEQ ID No:105)
[0479]5』-CCCTCTATGGCTGTTTCTTTCTC-3』 ；(SEQ ID No:106)
[0480](54)檢測NEURL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0481]5』-GTGTCTTC CACCGCATCAA-3』 ；(SEQ ID No:107)
[0482]5，-ACCAGCTCGCTATCAAGCA-3， ；(SEQ ID No:108)
[0483](55)檢測NFKBl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0484]5』-GAAGCACGAATGACAGAGG-3』 ；(SEQ ID No:109)
[0485]5』-GCTTGGCGGATTAGCTCTTT-3』 ；(SEQ ID No:110)
[0486](56)檢測NFKB2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0487]5』-ATGGAGAGTTGCTACAACCC-3』 ；(SEQ ID No:111)
[0488]5，-CTGTTCCACGATCACCAGGT-3， ；(SEQ ID No:112)
[0489](57)檢測Notchl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0490]5』-ATCGACGATTGTCCAGGAAAC-3』 ；(SEQ ID No:113)
[0491]5』-TACTGACCTGTCCACTCTGGC-3』 ；(SEQ ID No:114)
[0492](58)檢測N0TCH2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0493]5』-AAGCAGAGTCCCAGTGCCT-3』 ；(SEQ ID No:115)
[0494]5』-CAGGGGGCACTGACAGTAA-3』 ；(SEQ ID No:116)
[0495](59)檢測N0TCH2NL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0496]5』-TGTGACAGCCTGTATGTGC-3』 ；(SEQ ID No:117)
[0497]5』-TGAGCAGCTTAGGAAAGATTG-3』 ；(SEQ ID No:118)
[0498](60)檢測N0TCH3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0499]5』-TGTGGACGAGTGCTCTATC-3』 ；(SEQ ID No:119)
[0500]5』-AATGTCCACCTCGCAATAG-3』 ；(SEQ ID No:120)
[0501](61)檢測N0TCH4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0502]5』-CTAGGGGCTCTTCTCGTCC-3』 ；(SEQ ID No:121)
[0503]5』-CAACTTCTGCCTTTGGCTT-3』 ；(SEQ ID No:122)
[0504](62)檢測NR4A2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0505]5』-GCCACCTTGCTTGTACCAAA-3』 ；(SEQ ID No:123)
[0506]5』-GGCTTGTAGTAAACCGACCC-3』 ；(SEQ ID No:124)[0507](63)檢測NUMB基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0508]5』-TCAGCAGATGGACTCAGAGT-3』 ；(SEQ ID No:125)
[0509]5』-AGGCTCTATCAAAGTTCCTGTC-3』 ；(SEQ ID No:126)
[0510](64)檢測PAX5基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0511]5』-ACTTGCTCATCAAGGTGTCA-3』 ；(SEQ ID No:127)
[0512]5』-TCCTCCAATTACCCCAGGCT-3』 ；(SEQ ID No:128)
[0513](65)檢測PDPKl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0514]5』-ACGGAGAAGTCCGCCTGTA-3』 ；(SEQ ID No:129)
[0515]5』-CTCGTTTCCAGCTCGGAAT-3』 ；(SEQ ID No:130)
[0516](66)檢測POFUTl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0517]5』-AACCAGGCCGATCACTTCTT-3』 ；(SEQ ID No:131)
[0518]5』-GTTGGTGAAAGGAGGCTTGT-3』 ；(SEQ ID No:132)
[0519](67)檢測PPARG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0520]5』-GGGAT CAGCTCCGTGGATC-3』 ；(SEQ ID No:133)
[0521]5』-TGCACTTTGGTACTCTTGAAGT-3』 ；(SEQ ID No:134)
[0522](68)檢測PSENl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0523]5』-GACGACCCCAGGGTAACT-3』 ；(SEQ ID No:135)
[0524]5』-ACTGACTTAATGGTAGCCACG-3』 ；(SEQ ID No:136)
[0525](69)檢測PSEN2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0526]5』-ACCGCTATGTCTGTAGTG-3』 ；(SEQ ID No:137)
[0527]5』-CGCTCCGTATTTGAGGGTCA-3』 ；(SEQ ID No:138)
[0528](70)檢測PSENEN基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0529]5』-CTGGAGCGAGTGTCCAATGA-3』 ；(SEQ ID No:139)
[0530]5』-GCGCCAGACATAGCCTTTGA-3』 ；(SEQ ID No:140)
[0531](71)檢測RFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0532]5』-CGCCAGCAGACGTTTATCTT-3』 ；(SEQ ID No:141)
[0533]5』-CCGAGCAGTTGGTGTTGAT-3』 ；(SEQ ID No:142)
[0534](72)檢測RUNXl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0535]5』-CTGCCCATCGCTTTCAAGG-3』 ；(SEQ ID No:143)
[0536]5』-GCCGAGTAGTTTTCATCATTGC-3』 ；(SEQ ID No:144)
[0537](73)檢測SELlL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0538]5』-AAACCAGCTTTGACCGCCA-3』 ；(SEQ ID No:145)
[0539]5』-GTCATAGGTTGTAGCACACCA-3』 ；(SEQ ID No:146)
[0540](74)檢測SH2D1A基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0541]5』-GACAGCACCTGGGGTACATA-3』 ；(SEQ ID No:147)
[0542]5』-TGCAGAGGTATTACAATGCCTT-3』 ；(SEQ ID No:148)
[0543](75)檢測SHH基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0544]5』-CTCGCTGCTGGTATGCTC-3』 ；(SEQ ID No:149)
[0545]5』-ATCGCTCGGAGTTTCTGGAG-3』 ；(SEQ ID No:150)[0546](76)檢測Smo基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0547]5』-GTTCTCCATCAAGAGCAACCA-3』 ；(SEQ ID No:151)
[0548]5』-CGATTCTTGATCTCACAGTCAG-3』 ；(SEQ ID No:152)
[0549](77)檢測SNWl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0550]5』-GGATACCGGAAAGGCTGGAT-3』 ；(SEQ ID No:153)
[0551]5』-TGACTGTCCTTGTCGAGCAA-3』 ；(SEQ ID No:154)
[0552](78)檢測STAT6基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0553]5』-GTTCCGCCACTTGCCAAT-3』 ；(SEQ ID No:155)
[0554]5』-GTTCCGCCACTTGCCAAT-3』 ；(SEQ ID No:156)
[0555](79)檢測SUFU基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0556]5』-CCAGGTTACCGCTATCGTCA-3』 ；(SEQ ID No:157)
[0557]5』-CGAAGCTGATGTAGTGCCAG-3』 ；(SEQ ID No:158)
[0558](80)檢測TEADl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0559]5』-ATGGAAAGGATGAGTGACTCTG-3』 ；(SEQ ID No:159)
[0560]5』-TCCCACATGGTGGATAGATAG-3』 ；(SEQ ID No:160)
[0561](81)檢測TLEl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0562]5』-GAGTCCCTGGACCGGATTAA-3』 ；(SEQ ID No:161)
[0563]5』-AATACATCACATAGTGCCTCTG-3』 ；(SEQ ID No:162)
[0564](82)檢測WISPl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0565]5』-TGCTGTAAGATGTGCGCTCA-3』 ；(SEQ ID No:163)
[0566]5』-ACACTCCTATTGCGTACCTC-3』 ；(SEQ ID No:164)
[0567](83)檢測WNTlI基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0568]5』-GGAGTCGGCCTTCGTGTAT-3』 ；(SEQ ID No:165)
[0569]5』-GCTGAGGTTGTCCGCACA-3』 ；(SEQ ID No:166)
[0570](84)檢測ZIC2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0571]5』-CACCTCCGATAAGCCCTATC-3』 ；(SEQ ID No:167)
[0572]5』-GGCGTGGACGACTCATAG-3』 ；(SEQ ID No:168)
[0573](85)檢測GAPDH基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0574]5』-ACTGCCACCCAGAAGAC-3』 ；(SEQ ID No:169)
[0575]5』-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3』 ；(SEQ ID No:170)
[0576](86)檢測ACTB基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0577]5』-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3』 ；(SEQ ID No:171)
[0578]5』-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3』 ；(SEQ ID No:172)
[0579](87)檢測B2M基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
[0580]5』-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3』 ；(SEQ ID No:173)
[0581]5』-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3』 (SEQ ID No:174)。
[0582]上述引物置於96孔板上進行PCR反應，其中每對引物置於任一孔中，共將87對引物置於87個孔中即可。
[0583]實驗結果如圖2所示，圖2所示的是進行NOTCH信號通路核心基因的實時螢光定量PCR後的擴增曲線，該結果可以看到目的基因擴增良好，有利於下遊的分析研究。
[0584]五、數據分析
[0585]利用各個基因的Ct值計算核心NOTCH基因的表達差異，如圖3和圖4所示。圖3顯示了 HS578BST和HS578T經溶解曲線分析後的結果，每一個基因的溶解曲線均為單峰，說明PCR產物單一，沒有引物二聚體等雜峰的出現，擴增的雙鏈DNA均為目的基因。圖4是在比較分析HS578BST和HS578T的PCR結果後獲得的差異基因表達結果，該結果篩選出了影響乳腺癌發生發展的核心Notch信號通路基因。
[0586]本發明將涉及與Notch信號通路密切相關的分子，該核心分子集中在一個平板上，通過做一次實時螢光定量PCR反應，反應細胞的生存狀態，與正常的乳腺細胞、乳腺癌做對比，探討Notch信號通路在腫瘤/正常細胞中的可能途徑，為研究關鍵蛋白的調控提供最直接的證據；本發明從轉錄水平快速準確的找到Notch信號通路相關分子，為抗癌藥物篩選、新靶向藥物的機制探討等提供了有力的工具。
[0587]以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換；而這些修改或替換，並不使相應技術方案的本質脫離`本發明所要求保護的技術方案的精神和範圍。
【權利要求】
1.一種檢測細胞NOTCH信號通路的試劑，其特徵在於它包括以下引物:(1)檢測ADAMlO基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5，-ATGGGAGGTCAGTATGGGAAT-3，；，5』-ACTGCTCTTTTGGCACGC-3』 ；(2)檢測ADAMl7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5』-ATGTTTCACGTTTGCAGTCTC-3』 ；，5』-AGAAGCGATGATCTGCTACC-3』 ；(3)檢測AES基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:，5，-ACCCCAGCAACTCAAATTCA-3，；，5』-AAGCCGTAGGACATCTCGTA-3』 ；(4)檢測CBL基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:，5』-TGGTGCGGTTGTGTCAGA-3'；，5』-GGTAGGTATCTGGTAGCAGG-3』 ；(5)檢測CCNDl基因的的PCR反應引物，其引物序列如下: ，5，-GCTGCGAAGTGGAAACC AT-3，；，5』-CCTCCTTCTGCACACATTTGA-3』 ；(6)檢測⑶44基因的的PCR反應引物，其引物序列如下:，5，-CCCATCCCAGACGAAGACA-3，；，5』-GCCATTTGTGTTGTTGTGTGA-3』 ；(7)檢測⑶KNlA基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5』-TGTCCGTCAGAACCCATG-3』 ；，5，-AAAGTCGAAGTTCCATCGCT-3，；(8)檢測CFLAR基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5』-AGAGTGAGGCGATTTGACCT-3』 ；，5，-GTCCGAAACAAGGTGAGGGT-3，；(9 )檢測CHUK基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5』-ATGAAGAAGTTGAACCATGCC-3』 ；，5』-CCTCCAGAACAGTATTCCATTG-3』 ；(10)檢測CTNNBl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5』-ATGTCCAGCGTTTGGCTGA-3』 ；，5』-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGT-3』 ；(11)檢測DLLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5』-TGTGACGAACACTACTACGG-3』 ；，5，-AGCCAGGGTTGCACACTT-3，。(12)檢測DLL3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5』-GCCAGAGCTTTTCCACTGATT-3』 ；，5，-GCGTCAGGCCTAGAAACAAAA-3，；(13)檢測DLL4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:，5，-ACCTTCTCGCTCATCATCGA-3，；.5』-CCTGGATGGCGATCTTGC-3』 ；(14)檢測DTXl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-CAGTCCATGCACCAGTTTC-3』 ；.5』-TCCATATCGTAGGCCGTCCA-3』 ；(15)檢測ERBB2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GCTCATCGCTCACAACCAAG-3，； .5』-ACAGGGGTGGTATTGTTCAG-3』 ；(16)檢測FOSLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-CAGGCGGAGACTGACAAACT-3，；.5』-TCCTTCCGGGATTTTGCAGA-3』 ；(17)檢測FZDl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-ATCTTCTTGTCCGGCTGTTAC-3』 ；.5』-GTCCTCGGCGAACTTGTCAT-3』 ；(18)檢測FZD2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GTGCCATCCTATCTCAGCTAC-3』 ；.5』-CTGCATGTCTACCAAGTACGT-3』 ；(19)檢測FZD3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GGATTGTTCTCGGGATTTCC-3』 ；.5』-AGTGTGACACGTCCATATTCC-3』 ；(20)檢測FZD4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GTCTTTCAGTCAAGAGACGCT-3』 ；.5』-GTTGTGGTCGTTCTGTGGT-3』 ；(21)檢測FZD6基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GTGCAACTCTGTTCACATTCC-3』 ；.5』-GCTATCGCCTAGCAAAAATCC-3』 ；(22)檢測FZD7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GTGCCAACGGCCTGATGT-3』 ；.5，-AGGTGAGAACGGTAAAGAGC-3，；(23)檢測GBP2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:5』-TTTCCAGCATTTGTGTGGAC-3』 ；.5』-GGGAAGAACTTTCGGATGCA-3』 ；(24)檢測Glil基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-TTCCTACCAGAGTCCCAAG-3』 ；.5』-CCCTATGTGAAGCCCTATT-3』 ；(25)檢測GSK3B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GGCAGCATGAAAGTTAGCAG-3，；.5，-GGCGACCAGTTCTCCTGAAT-3，；(26)檢測HESl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-ACACGACACCGGATAAACCA-3，；.5』-GCCGCGAGCTATCTTTCTTC-3』 ；(27)檢測HEYl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-ATCTGCTAAGCTAGAAAAAGCC-3』 ；.5』-CGTCAAAGTAACCTTTCCCTCC-3』 ；(28)檢測HEYL基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GGCTGCTTACGTGGCTGT-3』 ；.5，-GACCCAGGAGTGGTAGAGCA-3，；(29)檢測H0XB4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-CGTGAGCACGGTAAACCC-3，；.5』-CGAGCGGATCTTGGTGTT-3'；(30)檢測HR基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-CCCAGAGCATCCATGTGACT-3』 ；.5』-TGCCCACCAGAGTTTAAGC-3』 ；(31)檢測IFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-TCGGTAACTGACTTGAATGTCC-3』 ；.5』-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTG-3』 ；(32)檢測IL17B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GAGCCCCAAAAGCAAGAGGA-3，；.5』-TGCGGGCATACGGTTTCAT-3』 ；(33)檢測IL2RA基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GTGGGGACTGCTCACGTT-3』 ；.5，-GGATCTCTGGCGGGTCAT-3，；(34)檢測ITGAl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-CTGGACATAGTCATAGTGCTGG-3』 ；.5』-ACCTGTGTCTGTTTAGGACC-3』 ；(35)檢測ITGA2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GGGAATCAGTATTACACAACGG-3』 ；.5』-CCACAACATCTATGAGGGAAGG-3』 ；(36)檢測ITGA3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-TGTGGCTTGGAGTGACTGT-3』 ；.5，-TCATTGCCTCGCACGTAG-3，；(37)檢測ITGA4基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GGTAGCCCTAATGGAGAACC-3，；.5』-TATGCCCACAAGTCACGATG-3』 ；(38)檢測ITGAV基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-CCCCATTGTACCATTGGAGAA-3』 ；.5』-TGGAGCATACTCAACAGTCTTT-3』 ；(39)檢測ITGBl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-CAAGAGAGCTGAAGACTATCCC-3』 ；.5』-TGAAGTCCGAAGTAATCCTCC-3』 ；(40)檢測ITGB3基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GTGACCTGAAGGAGAATCTG-3，；.5』-CCGGAGTGCAATCCTCTG-3』 ； (41)檢測ITGB5基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GGAAGTTCGGAAACAGAGGG-3，；.5』-CTTTCGCCAGCCAATCTTCT-3』 ；(42)檢測JAGl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GGGGCAACACCTTCAACCT-3，；.5，-CCAGGCGAAACTGAAAGG-3，；(43)檢測JAG2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-TGGGCGGCAACTCCTTCT-3』 ；.5，-GCCTCCACGATGAGGGTAA-3，；(44)檢測KAT2B基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GAAAAACCCTAACCCCTCAC-3，；.5，-CCTTGTGGACACAGGTAAAGAG-3，；(45)檢測KRTl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GGTGCTTATATGACCAAGGTG-3』 ；.5』-ATGCTGTCCAGGTCGAGAC-3』 ；(46)檢測LFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GTCAGCGAGAACAAGGTG-3，；.5』-GATCCGCTCAGCCGTATTCA-3』 ；(47)檢測LM02基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-GACAAGCGGATTCGTGCCTA-3』 ；.5』-AGTTGATGAGGAGGTATCTGTC-3』 ；(48)檢測MAP2K7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-TGCTTTGGGACGTTCATCAC-3』 ；.5』-CCACTGTCATCTTGCCCAGA-3』 ；(49)檢測MFNG基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-TGCTGAGTTCGACACCTTCT-3』 ；.5，-GCCCTTGGGTTCACATAGTT-3，；(50)檢測MMP7基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GAGTGAGCTACAGTGGGAAC-3，；.5』-CTATGACGCGGGAGTTTAACA-3』 ；(51)檢測MYCLl基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5，-GCCACCCCAAACCTGTCA-3，；.5』-GGCCTTGCTTAGGATCACTACT-3』 ；(52)檢測NCOR2基因的PCR反應引物，其引物序列如下:.5』-TGCAGATCATCTACGACGAG-3』 ；
2.根據權利要求1所述的檢測細胞NOTCH信號通路的試劑，其特徵在於:所述試劑還含有內參調控基因GAPDH、ACTB、B2M的PCR反應引物。
3.根據權利要求2所述的檢測細胞NOTCH信號通路的試劑，其特徵在於: 檢測GAPDH基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
5，-ACTGCCACCCAGAAGAC-3，；
5，-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3，； 檢測ACTB基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
5』-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3』 ；
5』-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3』 ； 檢測B2M基因的PCR反應引物，其引物序列如下:
5』-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3』 ；
5』-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3』 。
4.利用權利要求書I所述試劑檢測Notch信號通路的PCR檢測方法，其特徵在於，所述PCR檢測方法為實時螢光定量PCR方法。
5.根據權利要求書4所述的檢測Notch信號通路的PCR檢測方法，其特徵在於，所述實時螢光定量PCR的反應體系為:Taq聚合酶反應混合液10 μ 1，上遊引物0.1 μ mol，下遊引物0.1 μ mol, cDNA模 板50ng,滅菌蒸懼水補足到20 μ I。
6.根據權利要求書5所述的檢測Notch信號通路的PCR檢測方法，其特徵在於，所述Taq聚合酶為TaKaRa公司的2><SYBR? Premix Ex Taq聚合酶。
7.根據權利要求書4或5所述的檢測Notch信號通路的PCR檢測方法，其特徵在於，所述實時螢光定量PCR的反應程序為:95°C預變性，30秒；95°C變性，5秒，60°C，20秒，進行40個循環。
8.權利要求1所述的試劑在製備檢測癌細胞的檢測試劑中的應用。
9.根據權利要求8所述的試劑在製備檢測癌細胞的檢測試劑中的應用，其特徵在於:所述癌細胞為肺癌細胞、乳`腺癌細胞、肺癌細胞和肝癌細胞。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627814SQ201310686645
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】王海波, 梁曄, 劉相萍, 王麗萍, 劉世海, 姚如永, 隋愛華, 楊堃, 遲靜薇, 周泉, 劉加秀 申請人:青島大學醫學院附屬醫院