調控陸地棉抗逆性的轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法
2023-12-10 06:34:22
專利名稱：調控陸地棉抗逆性的轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物轉錄因子及其編碼基因與應用，特別是來源於陸地棉的轉錄因子及其編碼基因與應用。
棉花作為一種重要的經濟作物，改善其抗逆性具有重要的經濟價值，是棉花育種研究的重點。
本發明所提供的抗逆轉錄因子名稱為GhDREB，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
序列表中序列2胺基酸殘基序列是由153個胺基酸殘基組成的蛋白質。所述序列2中自碳端到氮端第29-96個胺基酸殘基保守結構域是轉錄因子GhDREB的ERF功能保守域。
抗逆轉錄因子GhDREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由866個鹼基組成，該基因的讀碼框為自3』端第106到第565位鹼基，其表達主要受乾旱、低溫、高鹽以及外來脫落酸、乙烯的誘導。
利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，如pBIN19以及由其衍生而來的pBI101，pBI121和pBI221系列載體(Bevan，1984核酸研究，128711-8721)，將本發明所提供的編碼轉錄因子GhDREB的基因導入植物細胞，可獲得對乾旱、低溫和高鹽脅迫耐受力得到增強的轉基因細胞系及轉基因植株。表達載體pBI121-GhDREB是利用常規分子生物學手段構建的帶有本發明GhDREB cDNA的表達載體，它的基因圖譜如
圖1所示。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV35S)以及Ubiquitin啟動子等。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素，卡那黴素等)。攜帶有本發明GhDREB基因的表達載體可通過使用Ti(Tumor-induced-癌誘導)質粒、Ri(Root-induced-根誘導)質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導等常規生物技術方法導入植物細胞，被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發明的基因對培育抗逆植物品種，特別是培育抗旱、抗寒和抗鹽的植物品種，提高農作物產量具有重要意義。
圖2為GhDREB基因在大腸桿菌中的體外表達。
圖3為Southern雜交分析結果。
圖4為不同脅迫條件下Northern雜交檢測的GhDREB基因表達特徵。
取1μg總RNA通過下面所描述的三條正向引物與四條反向引物組合的12對特異簡併性引物進行各自獨立的一步逆轉錄鏈式擴增反應(PCR)，擴增AP2/EREBP保守域。
3條對應於AP2/EREBP保守域N-端的5』-GIRMRK-3』正向引物(Forwardprimers)GDF15』-GGIAT(A/C/T)CGIATGCGIAA(A/G)-3』；GDF25』-GGIAT(A/C/T)CGIATGAG(A/G)AA(A/G)-3』；GDF35』-GGIAT(A/C/T)AG(A/G)ATGCGIAA(A/G)-3』；4條對應於AP2/EREBP保守域C-端的5』-ARLNFP-3』反向引物(Reverseprimers)GDR15』-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAGICGIGC-3』；GDR25』-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAG(C/T)CTIGC-3』；GDR35』-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AA(T/C)CTIGC-3』；GDR45』-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AAICGIGC-3』。
在上述引物中，I為次黃苷酸(inosine)，PCR條件為94℃，3分；94℃30秒，60℃30秒，72℃1.5分-30循環；72℃10分；4℃保存。PCR產物連接到pMD18-T載體上用於測序，再以陽性克隆為模板利用一對特異性引物GhDF1R5』-CTTCCTCATCCTTATCCC-3』；GhDR1F5』-GCCAGGCTCAACTT CCCT-3』，通過逆轉錄PCR反應擴增目的基因的5』端(PCR程序見kit D6122，Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)以及3』端(PCR程序見kit D6121，Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)。然後體外包裝Invitro-GmDREB基因序列，再設計一對特異性引物GhDREBFd5』-AAAAGAATTCATGGAGCTAGGTGATTGTTG-3』(107-126)；GhDREBRe5』-AAAACTCGAGATCTTCATCAGAACTGTCAG-3』(562-546)；94℃，3分；94℃1分，58℃1分，72℃1.5分-30循環；72℃10分；4℃保存，擴增GhDREB cDNA，PCR產物接於pMD18-T載體進行測序，得到了一個與體外包裝序列完全一致的cDNA克隆，命名為GhDREB。該基因插入片段為866bp，含有459bp的開放閱讀框架，編碼153個胺基酸組成的多肽，在氨基端和羧基端分別含有一個富含鹼性胺基酸的核信號定位保守區域和一個富含酸性胺基酸的激活域保守區域，其5』端為106bp，3』端為179bp。
實施例2、用於轉化的融合表達載體的構建。
GhDREB cDNA表達載體的構建按常規分子生物學手段進行。將GhDREB編碼區域利用GhDREB cDNA作模板進行PCR擴增並通過正向引物端的BamHI和反向引物端的SacI位點將其插入到pBI121雙元表達載體中一個CaMV35S啟動子後面，得到一個融合表達載體pBI121-GhDREB(圖譜如圖1所示)，經酶切鑑定插入片段無誤後，轉化於農桿菌，再提取質粒經酶切確認成功轉化於農桿菌中，該融合表達載體可直接通過轉基因技術用於植物特別是棉花的基因轉化。其中，LUC螢光素酶基因作為篩選陽性轉基因植株的標記物。
實施例3、棉花GhDREB基因在大場桿菌中的體外表達鑑定將GhDREB cDNA編碼區域連接於一個表達載體pGEX-4T-1上，經IPTG在大腸桿菌中誘導，SDS-PAGE檢測表明該基因能夠在大腸桿菌中進行體外翻譯表達。而未經誘導的菌株卻沒有蛋白表達帶出現。聚丙烯凝膠電泳譜帶如圖2所示，圖中，M是Marker；1、3是經誘導的菌株；2是未經誘導的菌株。從圖中可以看出，經誘導的菌株有蛋白條帶出現，未經誘導的菌株沒有蛋白條帶出現。
實施例4、GhDREB基因在棉花基因組中的分析。
利用GhDREB cDNA作為探針，與經不同限制性內切酶(EcoRI，EcoRV，P-PstI以及XhoI)消化後的棉花基因組DNA在65℃條件下進行Southern雜交分析，並在高嚴謹度下洗膜(高嚴謹度的條件是0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)，結果如圖3所示，除用EcoRV和XhoI(因為二者分別在395和510的位置上處有一個位點)消化的基因組DNA呈現微弱兩條雜交帶外，其它均只出現一條雜交帶，表明GhDREB基因在棉花基因組中是一個單拷貝基因，或者存在著低拷貝的GhDREB同源體。
實施例5、棉花GhDREB基因在逆境脅迫條件下的表達特徵將生長2個星期的棉花幼苗分別置於4℃水，250mM的NaCl水溶液，以及100μM脫落酸(ABA)溶液中進行光照培養，乾旱處理是將生長2個星期的棉花幼苗經水洗淨後置於足以吸乾水分的濾紙上在室溫下脫水，並分別在1小時、3小時、5小時、7小時、12小時以及24小時取樣，提取總RNA，與GhDREB cDNA探針進行Northern雜交分析。結果如圖4所示，其中A是乾旱處理的結果，B是4℃低溫處理的結果，C是250mM NaCl處理的結果，D是脫落酸處理的結果，從圖中可以看出，基因GhDREB的轉錄主要受低溫，鹽以及乾旱誘導表達，而且外來的脫落酸以及乙稀也可誘導該基因的表達。
序列表16022101211866212DNA213棉屬陸地棉(Gossypium hirsutum L.)4001tttttctcct tcttatggct tacaagttat agtttccaga aacaagggga aataaaaaaa 60aatccatttt gttttaggat tttggtcttc ttttatcttt tgggtcatgg agctaggtga 120ttgttgttta acatcaagtc cagcaagcgg agagaagcga aagctgcata ggacacagca 180aaaggagaaa ccattcagag ggataaggat gaggaagtgg ggaaagtggg tcgctgaaat 240cagagaaccc aacaagcggt ccaggatttg gcttggttct tacaccaccc ctgtagccgc 300cgctcgtgct tatgacacag ccgttttcta cttgcggggt ccttccgcca ggctcaactt 360ccctgacctc atattccaag aagacgagct tagggatatc tcagccgctt ccatacgcaa 420gaaagcaacc gaggtggggg ctaaagtcga cgctttacag acctcactcc atcatgcttc 480tgcttcatca tcggaatcat cgaaccctac tcgagttttc cgtaaacctg atttgaacaa 540gtaccctgac agttctgatg aagattgaaa acaatataat agtttaccat aacccaaaaa 600cctataactg ttcatactcg ccactttttt tttttcccca cttatgtctt tttgattctc 660tcatggaata gcaagtgccc aaagaataga atcaataaaa aaatggattg attctctgtt 720tgataaggtt atgaatgttt tactttggga atacaagttt agtttatggc atgtaacttt 780taacatgaat ggatattgat gaaacaggga tatatatcgc tgagttagta aatactccta 840attccttgac caaaaaaaaa aaaaaa 8662101211153212PRT213棉屬陸地棉(Gossypium hirsutum L.)4002Met Glu Leu Gly Asp Cys Cys Leu Thr Ser Ser Pro Ala Ser Gly5 10 15Glu Lys Arg Lys Leu His Arg Thr Gln Gln Lys Glu Lys Pro Phe20 25 30Arg Gly Ile Arg Met Arg Lys Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile
35 40 45-Arg Glu Pro Asn Lys Arg Ser Arg Ile Trp Leu Gly Ser Tyr Thr50 55 60Thr Pro Val Ala Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Val Phe Tyr65 70 75Leu Arg Gly Pro Ser Ala Arg Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ile Phe80 85 90Gln Glu Asp Glu Leu Arg Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Arg Lys95 100 105Lys Ala Thr Glu Val Gly Ala Lys Val Asp Ala Leu Gln Thr Ser110 115 120Leu His His Ala Ser Ala Ser Ser Ser Glu Ser Ser Asn Pro Thr125 130 135Arg Val Phe Arg Lys Pro Asp Leu Asn Lys Tyr Pro Asp Ser Ser140 145 150Asp Glu Asp15權利要求
1.抗逆轉錄因子GhDREB，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的轉錄因子，其特徵在於它是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質。
3.根據權利要求2所述的轉錄因子，其特徵在於所述序列2中自氮端到碳端第29-96個胺基酸殘基保守結構域是轉錄因子GhDREB的ERF功能保守域。
4.抗逆轉錄因子GhDREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於所述抗逆轉錄因子GhDREB的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根據權利要求5所述的基因，其特徵在於該基因的讀碼框為自3』端第106到第565位鹼基。
7.含有權利要求4所述基因的表達載體。
8.根據權利要求7所述的基因，其特徵在於所述表達載體為pBI121-GhDREB。
9.含有權利要求4所述基因的細胞系。
10.權利要求4所述基因在培育抗旱、抗寒、抗鹽植物品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種調控陸地棉抗逆性的轉錄因子及其編碼基因與應用。本發明所提供的抗逆轉錄因子名稱為GhDREB，是具有序列表中序列2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。抗逆轉錄因子GhDREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明的基因對培育抗逆植物品種，特別是培育抗旱、抗寒和抗鹽的植物品種，提高農作物產量具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK1475497SQ0212887
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月16日 優先權日2002年8月16日
發明者程憲國, 侯玉霞, 劉強 申請人:清華大學