高效表達重組蛋白的宿主cho細胞株的製作方法

2023-12-10 06:16:07 1

專利名稱：高效表達重組蛋白的宿主cho細胞株的製作方法
技術領域：
-
本發明涉及細胞生物學領域，其技術屬於細胞生物學的相關實驗方法與 技術，特別是一種適應無血清、懸浮、高密度狀態的CHO細胞株。
技術背景-
CHO細胞是實驗中非常常用的一個細胞株，是一個得到廣泛應用的真 核基因表達宿主，在生物製藥中使用也非常廣泛，該細胞株培養條件簡單， 貼壁強度適中，比較容易轉染。CHO是T. T. Puck在1957年從一隻成年 中國倉鼠卵巢獲得的。用於培養CHO細胞的培養基為完全培養基Ham's F12培養基，其中添加2Mm的穀氨醯胺、1.5g/L的碳酸氫鈉，10%的胎牛 血清。
CHO細胞可以對真核基因產物進行一系列的翻譯後修飾，使其獲得生 物活性。目前許多真核細胞表達的基因藥物是用CHO細胞生產的。CHO 細胞的規模化培養技術已經形成固定的操作規範，如果在項目的研發階段 採用CHO細胞作為表達宿主，可以為以後的工廠化生產提供有利條件。 宿主CHO細胞的應用
由於動物細胞培養技術的複雜性，目前我國批准上市的哺乳動物細胞 尤其是CHO細胞表達的產品很少，只有促紅細胞生成素(EPO)、 CHO基因 工程B肝疫苗、以及最近批准上市的治療性抗體藥物益賽普(有效成分相當 於美國食品藥品管理局批准的Enbrel)和泰欣生(有效成分相當於美國食品 藥品管理局批准的Erbitux)等少數幾種生物技術藥物。北京大學血研所教 授王德炳血小板生成素(TPO) CHO細胞中成功表達具有活性的基因重組 人TPO;篩選獲得穩定產生抗TPO單克隆抗體的細胞株。TPO基因治療 適用於惡性腫瘤、白血病化療後因血小板減少症需要重建造血功能的病人， 使用後無血液製品導致的合併症，在將來過渡到臨床後可提高癌症病人對 化療的耐受性，提高治癒率，延長病人的生存期。
用於生物製藥的工程細胞在體外培養時，多數呈貼壁生長或兼性貼壁 生長；而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時，由於缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往 往以懸浮形式生長。懸浮培養是目前大規模培養的趨勢，具有操作簡單， 易放大規模等優點。
由於傳統的含有血清的細胞培養會給生產及科研帶來許多不利因素。 自50年代起人們開始無血清培養基的研究，至今已經過三代。第一代雖然 不含有血清，但含有大量的動物或植物蛋白，不利於目標蛋白的分離純化， 降低了回收率，增加了成本；第二代、第三代，完全不用動物來源蛋白或 者含量極低，是目前市面上市的主要基因工程產品,但是僅限於幾株細胞 系，尚未應用到疫苗生產中；培養基中無血清、無蛋白，適合多種不同細 胞生長並可高溫消毒，是第四代無血清細胞培養的發展趨勢，目前引進了 學界和產業界共同關注。
開發適於各種CHO工程細胞的無血清培養基生產不同的重組蛋白國 外已有學者進行了相關研究。早期常用的CHO細胞的無血清培養基為 DMEM/F12，目前國外許多廠家都在開發適用於CHO細胞高密度生產及高 水平目的產物表達的無血清培養基，國內的一些單位在DMEM/F12培養的 基礎上進行優化，取得了進展。另有研究表明在培養基中添加成分如丁酸 鈉等對促進細胞生長的影響顯著。CHO細胞傳統培養的方法是貼壁培養， 但貼壁介質(如微載體)具有成本高和由於流體力學效應和細胞生長的限 制而難以實現長期連續高密度培養等缺點。
在經歷了天然培養基、合成培養基後，無血清培養基和無血清培養成 為當今細胞培養領域的一大趨勢。採用無血清培養可降低生產成本，簡化 分離純化步驟，避免病毒汙染造成的危害。因此利用本研究所獲得的懸浮、 無血清、高密度宿主細胞株進行蛋白類藥物的生產，在安全性，產物的表 達量，提純工藝的簡單化及節約成本等方面都具有重要的意義。

發明內容
本發明的目的是為了解決上述背景技術存在的不足，建立懸浮、無血
清、高密度的CHO細胞系。
本發明的目的按下述方案實現更換幾種無血清培養基，使CHO細胞
逐步適應無血清的生長環境、高密度的生長環境；使細胞在方瓶及搖瓶中適應懸浮的生長狀態，從而建立了建立懸浮、無血清、高密度的CHO細胞株。
其繼代培養方法
1. 倒掉原瓶中的培養基。
2. 用0. 25。/。(w/v)胰酶-0. 53 mM EDTA液體洗滌，以去除血清(血清會抑制 胰酶的活性)。
3. 將3.0ml帶有胰酶的EDTA溶液添加到細胞瓶中，在細胞從貼壁狀態消 化下來，並開始處於分散狀態下，於倒置顯微鏡觀察細胞。
注意為了避免細胞聚集在一起不能搖動細胞液，且細胞在37'C下很難分 散。
4. 添加6.0ml的完全培養基並輕輕吸取至細胞瓶中。
5. 添加適當的細胞懸液到新的細胞瓶中。
6. 在5%0)2、 37'C下孵箱中培養。
接種比率按l: 6接種，傳代期間培養液更換2次。
凍存培養基:為95%的完全培養基；5%DMS0，凍存於液氮中。
具體實施例方式
一無血清、高密度、懸浮CHO細胞系的建立
1. 先接入方瓶，更換無血清培養基。
2. 當細胞生長至對數期時進行傳代。
3. 連續傳代使其適應在方瓶中的無血清狀態。
4. 轉至搖瓶。
5. 連續傳代使之逐步適應搖瓶中的無血清、懸浮狀態。 二製備主細胞庫
1.細胞在方瓶中適應無血清的狀態下，對細胞進行計數，凍存密 度為5xlS個活細胞/ml， -80匸過夜，然後轉至液氮保存。
2. 細胞在搖瓶中適應無血清的狀態下，凍存細胞，與方瓶凍存條件一致。
3. 細胞在搖瓶中適應無血清、懸浮狀態下凍存細胞，與方瓶凍存條 件一致。
權利要求
1、一種適應無血清、懸浮、高密度狀態的宿主CHO細胞株。
2、 如權利要求1所述的宿主CHO細胞細胞可用於生產抗B肝病毒 (HBV)的抗原。
3、 如權利要求1所述的宿主CHO細胞細胞可用於表達人紅細胞 (erythropoietin ， EPO)。
4、 如權利要求1所述的宿主CHO細胞細胞可用於外源性TPA基因的表達。
5、 利用權利l所述細胞株用於各類基因工程蛋白的表達。
6、 利用權利l所述細胞株用於生物技術藥物的生產。
全文摘要
本發明是一種細胞株。原宿主CHO細胞株為貼壁、低密度狀態，所用培養基含10％的胎牛血清，通過對原宿主細胞株進行更換培養基，懸浮狀態適應的馴化，獲得了一種適應無血清、懸浮、高密度狀態的宿主CHO細胞株，可用於各類重組蛋白的表達。
文檔編號C12N5/06GK101302493SQ20071010711
公開日2008年11月12日 申請日期2007年5月8日 優先權日2007年5月8日
發明者劉逸人, 唐文英, 丹 散, 李榮皓, 穎 王, 峰 高, 黎志良 申請人:中美奧達生物技術(北京)有限公司;北京湧泉萬方生物技術有限公司