家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法
2023-12-10 01:50:36 2
專利名稱：家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法
技術領域：
本發明屬於轉基因物質，尤其是畜禽用轉基因酶製劑製造領域。
中國專利CN99103564公開了一種應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統生產植酸酶的基因工程方法，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，並使其處於多角體蛋白基因啟動子的控制下，再將此重組質粒與野生型BmNPV-DNA共轉染於家蠶細胞，通過體內同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動子啟動植酸酶基因，並將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白。但如何將家蠶基因工程植酸酶生產在較大的工業化程度上實現，或者更具體地說在畜禽用轉基因酶製劑工業中批量化、低成本生產出具有商業競爭力的產品仍是需要解決的問題。
本發明的目的是，研究一種家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，使之能改善現有技術的不足，低成本、批量化生產畜禽飼料用基因工程植酸酶商品化製劑。
本發明的目的使通過如下的方法實現的。
家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統生產植酸酶，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，並使其處於多角體蛋白基因啟動子的控制下，再將此重組質粒與野生型BmNPV-DNA共轉染於家蠶細胞，通過體內同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動子啟動植酸酶基因，並將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白，其特徵在於，收蠶後經勻漿後以細度大於16-60目的麩皮混勻，麩皮用量按重量比0.5-2.0/每克蠶混勻吸附，其混合物在溫和溫度下烘乾，再經粉碎——過篩——攪拌均勻後製得畜禽用植酸酶製劑。
採用本發明的方法，在較小的生產成本下可保證較大批量的蛹(蠶)獲得平均較高的酶活量，從而使基因工程植酸酶製劑能在在較大的工業化程度上實現商品化。
工藝條件的選擇1.勻漿液用量經多次實驗，選取勻漿緩衝液的組成為HAc-NaAc，pH 5.5，Ca2+1毫摩爾/升，緩衝液的加入量以緩衝液的加入量按0.5-2.0ml/克蠶為宜；2.麩皮細度將烘乾後的麩皮分別粉碎至過8目、16目、30目、60目的篩網，與蠶漿混合吸附，再經50℃溫和烘乾粉碎過同樣目數的篩網，取樣測酶活，得如
圖1結果。
圖1為酶活性能與麩皮粉碎細度的關係圖。
由
圖1看出當粉碎細度在30目以上時，酶活性提高明顯，而以60目時最高。然而，當粉碎細度超過30目以上時，粉碎時間將延長2～3倍，酶活提高與30目相比並不顯著。因此，從產業化的角度看，30目附近的細度應該是最理想的。
3.烘乾溫度其他條件同實施例1，將以30目細度麩皮吸附的中間產品作烘乾溫度實驗，將含植酸酶樣品分別放置於室溫，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃下烘乾之後，按前述方法測酶活，結果見下表
由此看出溫度在50℃以下時，植酸酶活性比較穩定，進一步的實驗表明在55℃時，製劑仍有相當的植酸酶活性，但當溫度≥60℃時，酶活立即降為0。因此，在家蠶基因工程植酸酶的烘乾過程中，溫度應控制在50℃以下，一般不宜超過55℃。
進一步的實驗還表明，在勻漿工序前，將所收病蠶(蛹)作適度凍存處理，對於提高可檢出酶活值具有良好的作用。
權利要求
1.家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，應用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達系統生產植酸酶，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，並使其處於多角體蛋白基因啟動子的控制下，再將此重組質粒與野生型BmNPV-DNA共轉染於家蠶細胞，通過體內同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動子啟動植酸酶基因，並將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內繁殖產生目標物植酸酶蛋白，其特徵在於，收蠶後經加緩衝液勻漿，然後以細度16-60目，重量比為0.5-2.0克/克蠶的麩皮混勻吸附，其混合物在溫和溫度下烘乾，再經粉碎——過篩——攪拌均勻後製得畜禽用植酸酶製劑。
2.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，其特徵在於，所述麩皮細度為30目。
3.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，其特徵在於，所述溫和溫度為30-55℃。
4.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，其特徵在於，勻漿緩衝液的組成為HAc-NaAc，pH 5.5，Ca2+1毫摩爾/升。
5.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，其特徵在於，緩衝液的加入量按0.5-2.0ml/克蠶。
6.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，其特徵在於，蠶體在勻漿處理前先經凍存處理。
7.根據權利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法，其特徵在於，所述蠶體可為幼蠶及蠶蛹。
全文摘要
本發明涉及一種家蠶基因工程植酸酶製劑後加工處理工藝方法,應用重組BmNPV載體－家蠶宿主表達系統生產植酸酶,感染的病蠶收蠶勻漿後以細度大於16－60目的麩皮混勻,其混合物在不超過55℃的溫和溫度下烘乾,再經粉碎——過篩——攪拌均勻後製得畜禽用植酸酶製劑。在本發明的工藝條件下製得的酶製劑具有收率高、酶活損失小的優點。
文檔編號C12N9/16GK1384194SQ0110739
公開日2002年12月11日 申請日期2001年4月30日 優先權日2001年4月30日
發明者陳英, 石鈺, 秦儉 申請人:四川華神集團股份有限公司