一種蜂花粉核酸的提取方法
2023-12-10 09:59:07
專利名稱：一種蜂花粉核酸的提取方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種蜂花粉核酸的提取方法。背景技術：
蜂花粉是蜜蜂採集蜜源植物的花粉加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液形成的不規則扁圓形團狀物。蜂花粉的營養成分十分豐富，不僅含有豐富的蛋白質、糖類、脂類、維生素、有機酸、礦物質、核酸，還有酶和其他生物活性物質，且具有低脂肪、高蛋白的特點，常被稱為「微型營養庫」和「完全營養素」，是21世紀新型的營養源和保健食品。蜂花粉中核酸含量豐富，蔣瀅等人的檢測發現，IOOg油菜花粉中含有386.72mg核酸，且核酸具有獨特的抗衰老作用。目前國內外學者認為多吃含核酸的食物可使細胞再生，預防衰老和各種慢性疾病的發生，美國、日本和我國已用核酸產品對免疫功能低下者和腫瘤病人進行治療。補充核酸，DNA和RNA能刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖及分泌速度，從而提高機體免疫功能。蜂花粉核酸的提取是核酸功能發揮和產業化的關鍵。目前，植物中核酸的提取主要採用CTAB法、SDS法、苯酚法、三氯乙酸(TCA)或高氯酸法，其中CTAB法提取核酸純度高而得到廣泛應用，該方法中需添加Tris-HCl，Tris為實驗室有毒物質，對人體有害，又不易揮發去除，因而該方法提取的核酸不能用於食品及藥品，對核酸的廣泛應用受到限制，且提取成本高。
發明內容
本發明的目的是提供一種處理成本低，操作簡單，快速且無有毒有害物質殘留的蜂花粉核酸提取技術。本發明擬採取的技術方案為:一種蜂花粉核酸的提取方法，其特徵在於該方法包括以下工藝步驟:
(1)蜂花粉壁破碎處理:蜂花粉中加入溶劑，其質量體積比為1:3 5，溶劑為提取液和體積比為23 25:1的氯仿/異戊醇混合液按等體積比混合，提取液為20 mmol/LEDTA、質量體積比為2%CTAB，1.4 mo I/L NaCl混合而成，在0 25°C溫度下浸泡12 24h後，在勻漿機中進行勻質破壁，勻漿機轉速為18000 24 000轉/min，勻質2 3次，每次5 8min ；
(2)水浴:在步驟(I)獲得的勻質液中，再加入5 10倍的提取液，於55 70°C條件下水浴0.5 1.5h ;
(3)提取:冷卻至室溫，再加入等體積的體積比為23 25:1的氯仿/異戊醇，振蕩8 IOmin,在0 4°C、4000 12000r/min、離心管條件下離心分離8 IOmin,得提取液；
(4)重複提取:將步驟(3)所得固相重複步驟(3)2 4次；
(5)純化:合併步驟(3)和步驟(4)獲得的提取液，在合併提取液中加入其體積2/3的0^40C的異丙醇，混勻後在_20°C放置2h以上，棄去液相，沉澱物用體積比為75%的乙醇洗滌2 3次，去除乙醇，自然風乾，得蜂花粉核酸。本發明與現有技術相比具有以下優點:本發明提取原料易得，因此處理成本低；工藝簡單，並且在提取液配製中不添加Tris-HCl，因此，有效避免了 Tris等有毒有害物質的殘留；經檢測，本發明所得蜂花粉核酸純度高， 本發明得到的蜂花粉核酸可應用於食品及藥品，對蜂花粉核酸的廣泛應用開闢了新途徑。本發明核酸提取物的檢測方法如下:
⑴核酸稀釋液配製:
取本發明所提取的油菜蜂花粉核酸，用滅菌ddH20按質量體積比1:5(T120稀釋後，即得核酸稀釋液。⑵微量分光光度計檢測:
取2 ii I上述⑴配製的核酸稀釋液,用Thermo Scientific NanoDrop 2000C微量分光光度計檢測其純度和含量，發現在260nm及280nm吸光度(A)的比值(A260/A280)，A260/A280=l.82 2.00之間(比值A260/A280可作為核酸純度的指標，A260/A280=l.80 2.00之間，意指高純度的核酸)，說明所得核酸純度較高。根據所提花粉重量和所得核酸乾重，計算其得率為0.37%，即提取IOOg花粉所得核酸乾重為370mg。⑶瓊脂糖凝膠電泳檢測:
取4iU上述⑴配製的核酸稀釋液，在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，UVP凝膠成像系統觀察電泳檢測結果，說明本發明能夠從油菜蜂花粉中提取得到核酸。四
圖1為本發明從花粉中所提核酸電泳檢測圖
圖中I為實施例1核酸電泳檢測圖 2為實施例2核酸電泳檢測圖3為實施例3核酸電泳檢測圖 4為實施例4核酸電泳檢測圖 5為液氮研磨2XCTAB法提取的核酸電泳檢測圖 M為1DNA/HIND III核酸電泳檢測圖
五具體實施例方式 實施例1:
(1)蜂花粉壁破碎處理:稱取油菜蜂花粉50g加入75ml提取液和75ml體積比為23:1的氯仿/異戊醇混合溶劑，提取液為20 mmol/LEDTA、質量體積比為2%CTAB，1.4 mol/L NaCl混合而成，在25°C溫度下浸泡12h，在勻漿機中進行勻質破壁，勻漿機轉速為24000轉/min，勻質3次，每次8min ；
(2)水浴:在步驟(I)獲得的勻質液中，再加入5倍的提取液，於55°C條件下水浴1.5h ；
(3)提取:冷卻至室溫，再加入等體積的體積比為24:1的氯仿/異戊醇，振蕩lOmin，在4°C、12000r/min、離心管條件下離心分離8min,得提取液；
(4)重複提取:將步驟(3)所得固相重複步驟(3)2次；
(5)純化:合併步驟(3)和步驟(4)獲得的提取液，在合併提取液中加入其體積2/3的0°C的異丙醇，混勻後在_20°C放置14h，棄去液相，沉澱物用體積比為75%的乙醇洗滌2次，去除乙醇，自然風乾，得蜂花粉核酸，稱取其乾重為0.1865g。實施例2:
(I)蜂花粉壁破碎處理:稱取槐花蜂花粉50g加入125ml提取液和125ml體積比為24:1的氯仿/異戊醇混合溶劑，提取液為20 mmol/LEDTA、質量體積比為2%CTAB，1.4 mol/L NaCl混合而成，在25°C溫度下浸泡12h，在勻漿機中進行勻質破壁，勻漿機轉速為24000轉/min,勻質2次，每次5min ；(2)水浴:在步驟(I)獲得的勻質液中，再加入10倍的提取液，於70°C條件下水浴
0.5h ；
(3)提取:冷卻至室溫，再加入等體積的體積比為24:1的氯仿/異戊醇，振蕩8min，在0°C、4000r/min、離心管條件下離心分離IOmin,得提取液；
(4)重複提取:將步驟(3)所得固相重複步驟(3)4次；
(5)純化:合併步驟(3)和步驟(4)獲得的提取液，在合併提取液中加入其體積2/3的0°C的異丙醇，混勻後在_20°C放置24h，棄去液相，沉澱物用體積比為75%的乙醇洗滌3次，去除乙醇，自然風乾，得蜂花粉核酸，稱取其乾重為0.1496g。實施例3
(1)蜂花粉壁破碎處理:稱取油菜蜂花粉20g加入30ml提取液和30ml體積比為24:1的氯仿/異戊醇混合溶劑，提取液為20 mmol/LEDTA、質量體積比為2%CTAB，1.4 mol/L NaCl混合而成，在0°C溫度下浸泡24h，在勻漿機中進行勻質破壁，勻漿機轉速為20000轉/min，勻質3次，每次8min ；
(2)水浴:在步驟(I)獲得的勻質液中，再加入5倍的提取液，於65°C條件下水浴Ih；
(3)提取:冷卻至室溫，再加入等體積的體積比為24:1的氯仿/異戊醇，振蕩lOmin，在4°C、12000r/min、離心管條件下離心分離8min,得提取液；
(4)重複提取:將步驟(3)所得固相重複步驟(3)2次； (5)純化:合併步驟(3)和步驟(4)獲得的提取液，在合併提取液中加入其體積2/3的0°C的異丙醇，混勻後在-20°C放置14h，棄去液相，沉澱物用體積比為75%的乙醇洗滌2 3次，去除乙醇，自然風乾，得蜂花粉核酸，稱取其乾重為0.0632g。實施例4
(I)油菜蜂花粉壁破碎處理:稱取槐花蜂花粉5g用IOml提取液和IOml體積比為24:1的氯仿/異戊醇混合液，於18°C溫度下浸泡16h，用勻漿機進行勻質破壁；勻質速度為24000轉/分鐘，勻質2次，每次5min。所述提取液由20 mmol/L EDTA，質量體積比為2%CTAB, 1.4 mol/L NaCl 混合而成。(2)在步驟(I)獲得的勻質液中，再加入5倍的提取液，於65°C水浴lh。(3)冷卻至室溫，再加入等體積的體積比為24:1的氯仿/異戊醇振蕩8min，於4°C, 12000r/min,離心管條件下離心分離IOmin ；
(4)將離心所得水相轉入另一離心管，重複步驟(3)3次；
(5)在步驟(4)獲得的水相中加入其體積2/3預冷至0°C的異丙醇，混勻後在_20°C放置過夜；10 000r/min離心lOmin，棄去液相，沉澱物用體積比為75%的乙醇洗滌2 3次，去除乙醇，自然風乾，得油菜蜂花粉核酸，稱取其乾重為0.0171g。
權利要求
1.一種蜂花粉核酸的提取方法，其特徵在於該方法包括以下工藝步驟: (1)蜂花粉壁破碎處理:蜂花粉中加入溶劑，其質量體積比為1:3 5，溶劑為提取液和體積比為23 25:1的氯仿/異戊醇混合液按等體積比混合，提取液為20 mmol/LEDTA、質量體積比為2%CTAB，1.4 mo I/L NaCl混合而成，在0 25°C溫度下浸泡12 24h後，在勻漿機中進行勻質破壁，勻漿機轉速為18000 24000轉/min，勻質2 3次，每次5 8min ； (2)水浴:在步驟(I)獲得的勻質液中，再加入5 10倍的提取液，於55 70°C條件下水浴0.5 1.5h ; (3)提取:冷卻至室溫，再加入等體積的體積比為23 25:1的氯仿/異戊醇，振蕩8 IOmin,在0 4°C、4000 12000r/min、離心管條件下離心分離8 IOmin,得提取液； (4)重複提取:將步驟(3)所得固相重複步驟(3)2 4次； (5)純化:合併步驟(3)和步驟(4)獲得的提取液，在合併提取液中加入其體積2/3的0^40C的異丙醇，混勻後在_20°C放置2h以上，棄去液相，沉澱物用體積比為75%的乙醇洗滌2 3次，去除乙醇 ，自然風乾，得蜂花粉核酸。
全文摘要
本發明涉及一種蜂花粉核酸的提取方法，該方法包括以下步驟蜂花粉壁破碎處理、水浴、冷卻、提取、重複提取、純化後得到蜂花粉核酸。本發明提取原料易得，因此處理成本低；工藝簡單，並且在提取液配製中不添加Tris-HCl，因此，有效避免了Tris等有毒有害物質的殘留；經檢測，本發明所得蜂花粉核酸純度高，本發明得到的蜂花粉核酸可應用於食品及藥品，對蜂花粉核酸的廣泛應用開闢了新途徑。
文檔編號C12N15/10GK103146682SQ20121050253
公開日2013年6月12日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者高林, 胡延萍, 王莉, 李瑞欣, 李毅 申請人:青海睿元藥物研究所有限責任公司, 中國科學院西北高原生物研究所