他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測方法
2023-12-09 06:19:01 1
專利名稱：他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物技術領域的藥物敏感度檢測方法，包括引物、探針及其試劑盒，具體是一種用於他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，針對他莫西芬藥物使用者基因內3個生物標記的引物、探針及其試劑盒。
背景技術：
化療在目前是惡性腫瘤治療的重要手段，臨床化療的效果對於腫瘤患者的治療和提高生存期有著至關重要的影響。對於不同的患者，不同的化療藥物的效果差異很大。腫瘤患者對化療的反應不同，很多時候是由於對化療藥物敏感性存在差異。由於臨床醫生往往只能憑經驗對不同患者使用某種化療藥物或化療方案，帶有一定的盲目性，因此很多腫瘤患者的化療效果並不理想，往往達不到化療的預期目的。所以，一個能夠在化療前篩選出針對性強、患者敏感度較高化療藥物的檢測方法，對於提高個體化治療效果，提高化療的成功率，有著重要的意義。
近年來國內外腫瘤和化療藥物研究領域相繼創建了一系列體內或體外預測腫瘤化療藥物敏感性的方法。常用的有裸鼠皮下移植藥敏測定法、人體腫瘤細胞集落測定法、放射性標記代謝物前體摻入法、MTT比色、三磷酸腺苷法和快速螢光分析等等。這些方法均存在一些缺點，要麼費用昂貴且檢測周期長，不適合常規使用；要麼需要在體外培養原發腫瘤，檢測成功率低。這些缺陷把腫瘤化療藥敏實驗限制在了研究性的實驗室裡，很少有大規模使用的報導。藥物基因組學(pharmacogenomics)研究的進展為從分子水平研製和開發新一代的，針對藥物敏感性進行檢測的方法提供了理論基礎和大量的實驗數據。實驗證明，個體基因水平上的差異，包括基因多態性、基因突變和表達差異等，與腫瘤患者對藥物的敏感性密切相關。通過檢測患者在這些基因上與藥物敏感性相關的生物標記，可以預測患者對腫瘤化療藥物的敏感性，幫助進一步指導選擇合理的化療方案。我們通過設計試劑盒，檢測人類基因上的多個SNP生物標記，可以方便、快速的預測他莫西芬藥物對患者個體的療效。
發明內容
本發明的目的是利用SNP標記檢測方便快捷，準確率高的優點，採用Seqnome檢測技術，提供一種用於他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，包括PRC弓I物、延伸弓I物和試劑盒。本發明涉及一種用於他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，含有SEQID No.1 3所示的上遊引物和SEQ ID No. 4 6所示的下遊引物。本發明涉及一種用於他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的單鹼基延伸引物，含有SEQ ID No. 7 9所示的單鹼基延伸引物。本發明設計一種試劑盒，由PCR擴增試劑組、SAP酶試劑組和iPLEX試劑組構成，其中PCR擴增試劑組含有PCR緩衝液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQID No.1 3所示的上遊引物和如SEQ ID No. 4 6所示的下遊引物；SAP酶試劑組含有SAP緩衝液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有iPLEX緩衝液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ ID No. 7 9所示的單鹼基延伸引物。上述標記組合優選利用飛行質譜(MALD1-T0F)方法進行檢測，檢測方法包括以下步驟(I)提取基因組DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮細胞DNA ;(2)飛行質譜檢測SNP多態；(3)根據SNP分型結果推斷他莫西芬藥物敏感度。本發明對ABCBl基因上的三個SNP生物標記進行分型，建立了一個快速，簡便，且成本低廉的檢測試劑盒，該試劑盒準確度高，靈敏性好，具有很強的實用價值。
實施例以下實施例，對本發明的具體實施方式
進行詳細描述，實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍，實施例1 :採用飛行質譜方法對腫瘤患者進行SNP分型及他莫西芬藥物敏感度檢測方法
一)提取基因組DNA:本試驗的樣本是使用刮棒採集的口腔黏膜細胞，室溫保存。刮棒採樣DNA提取的具體步驟如下 1)將口腔刮棒上的脫落細胞溶於400μ L IX裂解液中，加入IyL蛋白酶Κ，56度水浴30分鐘；
2)取出樣品置冰水浴I分鐘，加入6mol/LNaCl 150 μ L，劇烈振蕩15-20秒，13000轉離心10分鐘；
3)吸取上清液至新的離心管中，加入1.1mL無水乙醇，上下顛倒10次至絮狀DNA沉澱出現。室溫放置10分鐘，13000轉離心2分鐘沉澱DNA ；
4)棄去上清液，再加入O.25mL70%乙醇洗滌DNA沉澱，室溫放置I分鐘後，13000轉離心5分鐘；
5)用移液器小心吸取乙醇，然後放入通風櫥中通風10分鐘，然後用35μ L TE溶解DNA ；6) DNA可在4度保存1-2個月，或者存放在-20度長期保存；
7)使用18PLPCR Master Mix反應液以及2μ DNA模板，PCR擴增β-actin片斷，1.5%瓊脂糖凝膠，120V電泳15分鐘，觀察結果合格後轉移至PCR管中；
8)紫外分光光度計SMA3000測定溶液中DNA的濃度和A260/A280比值，測量3次取平均值，濃度應在30ng/y L，A260/A280比值應該在1. 7-2. O之間，合格的DNA 4°C取用或_20°C保存；
二)飛行質譜檢測SNP多態，採用本發明中所述試劑盒對樣本中的SNP生物標記進行檢測，下面為檢測過程
1)引物與DNA稀釋以及質檢PCR引物稀釋至終濃度為O.5μΜ ;根據Sequenom的稀釋公式，按照單鹼基延伸引物的分子量將引物稀釋至終濃度為7-14 μ M之間；
2)PCR擴增在每個384孔PCR板中加入Iμ L DNA和4 μ L PCR擴增試劑，共5 μ L，按照PCR儀程序I進行擴增
PCR 程序1:94°C 15min
丨94。。20sec56°C30sec45 cycles
72 °C Imin 72 °C 3min 4 °C 00
PCR擴增結束後，將384孔板短暫離心後備用，可在4°C保存；
3)SAP酶處理在PCR擴增後的產物加入2PL的SAP酶試劑，共7μ 。按照PCR儀程序2進行擴增
權利要求
1.一種用於他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，其特徵在於，包含SEQID No.1 3所示的上遊引物和SEQ ID No. 4 6所示的下遊引物。
2.一種用於他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的引物單鹼基延伸引物，其特徵在於，包含SEQ ID No. 7 9所示的單鹼基延伸引物。
3.一種用於他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，其特徵在於，由PCR擴增試劑組、SAP試劑組、iPLEX試劑組構成，包括 1)PCR擴增試劑組含有PCR緩衝液、MgCl2, dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQ ID No.1 3所示的上遊引物和如SEQ ID No. 4 6所示的下遊引物； 2)SAP酶試劑組含有SAP緩衝液、SAP酶和純水； 3)iPLEX試劑組含有iPLEX緩衝液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ IDNo. 7、所示的單鹼基延伸引物。
4.根據權力要求3所述方法製造的系列試劑盒，包括 1)根據權力要求3所述方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的PCR擴增緩衝液為IOX緩衝液，含2mM MgCl2 ；2)根據權力要求3所述方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的MgCl2濃度為2mM； 3)根據權利要求3所述方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的dNTP混合液的濃度為,500 μ M ；4)根據權利要求3所述方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的HotstarTaq酶為O. 5U ； 5)根據權利要求3所述方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的SAP緩衝液為IOX緩衝液； 6)根據權利要求3所述方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的SAP酶為1.7 U/μ L的蝦鹼性磷酸酶； 7)根據權利要求3所述方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的iPLEX緩衝液IOX緩衝液； 8)根據權利要求3所述的方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的ddNTP混合液為經過質量修飾的核苷酸； 9)根據權利要求3所述的方法製造的試劑盒，其特徵是，所述的單鹼基延伸酶為iPLEX聚合酶。
全文摘要
一種分子生物技術領域的用於他莫西芬抗腫瘤藥物敏感度檢測方法包括引物、探針及以此製造的試劑盒，該試劑盒由PCR擴增試劑組、SAP酶試劑組、iPLEX試劑組構成。PCR擴增試劑組含有PCR緩衝液、MgCl2、dNTP混合液、HotstarTaq酶、純水和如SEQIDNo.1~3所示的上遊引物和如SEQIDNo.4~6所示的下遊引物；SAP酶試劑組含有SAP緩衝液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有iPLEX緩衝液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQIDNo.7~9所示的單鹼基延伸引物。利用該項技術將腫瘤患者的DNA提取並處理後，利用飛行質譜方法，檢測引物擴增片段內的生物標記，並基於檢測結果評價腫瘤患者對他莫西芬藥物的敏感度，結果準確，靈敏度高，方法快速簡便並且有很高通量。
文檔編號C12N15/11GK103045734SQ20121055256
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者王健, 其他發明人請求不公開姓名 申請人:上海迪道科技有限公司, 郭景康