一種聚丙烯醯胺凝膠電泳中的dna銀染方法
2023-12-09 11:35:56
專利名稱：一種聚丙烯醯胺凝膠電泳中的dna銀染方法
技術領域：
本發明屬於分子遺傳學領域的電泳染色方法，具體涉及一種聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)中的DNA銀染方法。
背景技術：
聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)電泳是分析蛋白質和核酸樣品的一種常用的方法，在分子 生物學及相關學科的基礎和臨床研究中得以廣泛的應用。電泳後對樣品的顯示有許多的方 法，銀染法因具有靈敏度高、無毒無害且顯色結果可以隨幹膠直接保存等優點而得以廣泛 應用，特別是近幾年在SSCP、DDPCR和DNA測序等實驗中更顯示出其優越性。傳統的銀染方 法主要包含下面幾個步驟(1)預處理與固定，(2)染色，(3)顯色，(4)終止反應。整個過 程比較繁瑣，要用到蒸餾水或去離子水、乙醇、硝酸、硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、硫代硫酸鈉、乙 酸等多種化學試劑。近年來，許多研究人員對PAGE膠中蛋白質和DNA的銀染和顯色的過程 優化進行了探索，以求得到簡便、快速、靈敏度高且消耗低的銀染顯色方法，但改良後的方 法，染色與顯色的整個過程仍然至少需要40 50min。
發明內容
針對上述現有技術存在的缺陷或不足，本發明的目的在於，提供一種快速、靈敏和 有效的聚丙烯醯胺(PAGE)電泳中的DNA銀染方法。為了實現上述任務，本發明採取如下的技術解決方案
一種聚丙烯醯胺(PAGE)電泳中的DNA銀染方法，其特徵在於，該方法先用質量濃度 0. 1%的AgN03浸泡聚丙烯醯胺凝膠lOmin - 15min,然後對用浸泡後的聚丙烯醯胺凝膠蒸餾 水清洗凝膠2次，再用質量分數0. 04%的Na2C03、每升含有質量濃度37%的HCOH，2mL、質量 分數2%的NaOH的混合溶液顯色5min - 6min,顯色後用蒸餾水衝洗聚丙烯醯胺凝膠2次。所述的聚丙烯醯胺凝膠的質量濃度為8%或12%，交聯度為29 :1。本發明與現有技術相比，具有以下有益的技術效果
傳統的DNA銀染方法需要5-6種化學試劑，配製4種溶液，花費40-60min才能完成染色 步驟，而本方法只需要4種化學試劑，即硝酸銀(AgN03)、氫氧化鈉(NaOH)、碳酸鈉(Na2C03) 和甲醛(HC0H)，配製2種溶液，花費20min就可以達到與傳統染色方法相同的結果，而且在 變性聚丙烯醯胺電泳(PAGE)中，該方法可以將DNA的用量降低到0. 44ng ；在非變性聚丙烯 醯胺電泳(PAGE)中可以將DNA的用量降低到3. 5ng。本方法與傳統染色方法相比，不僅節 約了時間，降低了成本，而且提高了檢測的靈敏度。
圖1是採用本發明對GDF9基因外顯子1的PCR產物的變性聚丙烯醯胺凝膠(濃度 12%)電泳檢測對比圖，圖中，A表示本發明的DNA銀染方法；B表示採用傳統方法1 ；C表示 採用傳統方法2 ；D表示採用傳統方法3 ；圖2是採用本發明對微衛星BM1329PCR產物的非變性聚丙烯醯胺凝膠(濃度8%)電泳 檢測圖，圖中，1、2、3和8表示關中奶山羊；4和5表示濟寧青山羊；6和7表示布爾山 羊；9和10表示西農薩能奶山羊，M表示pBR322DNA/MspI ；
圖3是採用本發明對GDF9基因外顯子2PCR產物的變性聚丙烯醯胺凝膠(濃度12%)電 泳檢測圖，圖中，1、2和3表示關中奶山羊；4、5和7表示濟寧青山羊；6和8表示布爾 山羊；9、10和11表示西農薩能奶山羊；
以下通過對3種傳統的DNA銀染方法與本發明的DNA銀染方法的實施例進行比較分 析，對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式1、3種傳統的DNA銀染方法與本發明的DNA銀染方法的比較
按照表1的操作步驟對3種傳統的DNA銀染方法(圖中的方法1、方法2和方法3)與本 發明的DNA銀染方法進行比較，電泳檢測結果如圖1所示，從圖1可知，本發明的染色方法 明顯優於3種傳統的染色方法。用8%的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測400頭山羊的微衛星BM1329，使用本發明 的DNA銀染方法染色，檢測結果如圖2所示；
用12%變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測400頭山羊GDF9基因外顯子2的多態性，使用本 發明的DNA銀染方法染色，試驗結果如圖3所示。從圖2和圖3可知，使用優化後的DNA銀染方法染色能夠獲得良好的試驗結果。表1 :3種傳統的DNA銀染方法與本發明的DNA銀染方法操作步驟的比較
注表中所用試劑為質量濃度。
表2 3種傳統的DNA銀染方法與本發明的DNA銀染方法效果的比較
權利要求
一種聚丙烯醯胺(PAGE)電泳中的DNA銀染方法，其特徵在於，該方法先用質量濃度0.1%的AgNO3浸泡聚丙烯醯胺凝膠10min–15min，然後對用浸泡後的聚丙烯醯胺凝膠蒸餾水清洗凝膠2次，再用質量分數0.04%的Na2CO3、每升含有質量濃度37%的HCOH，2mL、質量分數2%的NaOH所構成的混合溶液顯色5min–6min，顯色後用蒸餾水衝洗聚丙烯醯胺凝膠2次。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的聚丙烯醯胺凝膠的濃度為8%或12%， 交聯度為29 :1。
全文摘要
本發明公開了一種聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)電泳中的DNA銀染方法，先用0.1%AgNO3浸泡聚丙烯醯胺凝膠10–15min，用蒸餾水清洗2次，其次用0.04%的Na2CO3、2mL的37%HCOH/L、2%的NaOH混合溶液顯色5–6min，蒸餾水衝洗2次即可完成全部染色過程。傳統的DNA銀染方法需要5-6種化學試劑，配製4中溶液，花費40-60min才能完成染色步驟，而本方法只需要4種化學試劑，配製2種溶液，花費20min就可以達到與傳統染色方法相同的結果，而且在變性聚丙烯醯胺電泳(PAGE)中，本染色方法可以將DNA的量降低到0.44ng；在非變性聚丙烯醯胺電泳(PAGE)中可以將DNA的量降低到3.5ng。本方法與傳統染色方法相比，不僅節約了時間，降低額成本，而且提高了檢測的靈敏度。
文檔編號G01N1/30GK101865798SQ20101019944
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月12日 優先權日2010年6月12日
發明者侯金星, 姬雲濤, 安小鵬, 宋宇軒, 曹斌雲, 王建剛 申請人:西北農林科技大學