新的鈉通道的製作方法

2023-12-09 01:41:36 2

專利名稱：新的鈉通道的製作方法
新的鈉通道 相關申請的交叉引用
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背景
所有細胞都依靠無機離子跨細胞膜的受調節的運動來進行基本的 生理功能。電興奮性、突觸可塑性和信號轉導是在其中離子濃度變化 起到重要作用的過程的實例. 一般地，允許這些變化的離子通道是由 一個或多個亞基組成的蛋白質孔洞，每個亞基含有兩個或多個跨腹結 構域.大多數離子通道依靠對大小和電荷的物理偏愛性對特定的離 子，主要是Na+、 K\ Ca2+、或CT具有選擇性.電化學力，而不是主 動轉運，驅動了離子跨越膜，因而單個通道可能容許每秒數百萬的粒 子通過.取決於通道的子類，通道開放、或"閘門"受電壓的變化或 受配體結合的緊密控制.由於涉及許多生理學過程，因此離子通道是 吸引人的治療靶點，而產生對特定組織類型中的特定通道具有特異性 的藥物仍然是主要的挑戰.
電壓門控的離子通道響應於膜電位的變化而開放.舉例來說，可 興奮細胞例如神經元的去極化引起Na+離子的短暫流入，這傳播了神經 衝動。這種Na+濃度的變化由電壓門控的K+通道感知，其然後允許1^+離子流出。K+離子的流出使膜復極化.其他細胞類型依靠電壓門控的 Ca"通道來產生動作電位。在不可興奮細胞中電壓門控的離子通道也 執行重要的功能，例如分泌的調節、體內平衡過程和有絲分裂過程. 配體門控的離子通道可以由細胞外的刺激，例如神經遞質(例如，谷 氨酸、5-羥色胺、乙醯膽鹼)或細胞內刺激(例如，cAMP、 Ca"和褲 酸化)打開.
鈉(Na+)通道包括電壓門控的和非電壓門控的種類.電壓門控 的Na+通道介導神經元中動作電位的再生所需的短暫Na+離子流入. 電壓門控的Na+通道可以進一步分為亞型；已經克隆了至少九種獨特 的電壓門控的Na+通道a亞基(Navl.l-1.9)，並已經克隆了至少三種 相關的P亞基.電壓門控的Na+通道的a亞基類似於電壓門控的Ca2+ 通道的a亞基，含有四個重複區域，每個重複區域含有六個跨膜結構 域。電壓門控的Na+通道在腦、肌肉、心臟、脊髄、子宮和感覺神經 元中表達.a亞基與輔助亞基相連，所述輔助亞基通過例如修改a亞 基的門控來調節通道的功能。
離子通道功能的遺傳的或藥理學擾動可能具有顯著的臨床後果。 長QT綜合症、癲癇症、嚢性纖維化和偶發的共濟失調是由離子通道亞 基中的突變引起的遺傳性疾病的幾個實例，由某些藥物觸發的毒性副 作用，例如心律不齊和發作(seizure)是由於對離子通道功能的幹擾 (Sirois and Atchison, TVei/rWojdco/ogy, 17 (1 ) :63-84， 1996; Keating, M.T.，&i'em^272:681-685， 1996).調節離子通道活性的藥物具有在治 療許多病理狀況方面的應用，包括疼痛、高血壓、心絞痛、心肌缺血、 孝喘、膀胱機能過度、脫髮、疼痛、心力衰竭、痛經、H型糖尿病、 心律不齊、移植排斥、發作、驚厥、癲癇症、中風、胃運動過強、精 神病、癌症、肌肉萎縮和發作性睡病(Coghlan， M.J.，"a/.，/. CAe肌 44:1627-1653， 2001; Ackerman. M.J.， and Clapham， D.E.，A^ 336:1575-1586,1997).鑑定的離子通道的數目增多和對它們的複雜性 的進一步了解今後將有助於在修改離子通道功能的治療方面的努力.
概述
在此提供了新的Na+通道亞基多肽、核酸和所述多肽和核酸的片 段。還提供了使用所述新的亞基多肽、核酸和其片段的方法.在一個方面，本發明表徵了分離的鈉通道HI型a亞基(mNav1.3 a亞基)多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:2的胺基酸序列，在一 個實施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO:2的胺基酸序列組成.
在另一個方面，本發明表徵了包括SEQ ID NO:2的至少IO個連 續胺基酸的分離的mNav1.3 a亞基多肽，其中所述多肽包括以下胺基酸 中的一個或多個異亮氨酸289、脯氨酸518、絲氨酸728、絲氨酸1355、 天冬醯胺1909、蘇氨酸1910和纈氨酸1921.
在另一個方面，本發明表徵了編碼在此描述的多肽的分離的 mNav1.3 a亞基核酸分子，所述多肽例如包括SEQ ID NO:2的胺基酸序 列的鈉通道III類型a亞基(mNav1.3 a亞基)多肽.在一個實施方式 中，所述核酸包括SEQIDNO:l的核苷酸序列.在一個實施方式中， 所述核酸分子基本上由SEQ ID NO:l的核苷酸序列組成。在一個實施 方式中，所述核酸分子是SEQIDNO:l的核酸序列的等位基因.
在另一個方面，本發明表徵了編碼在此描述的多肽的分離的 mNav1.3 a亞基核酸分子的片段，所述多肽例如包括SEQ ID NO:2的氨 基酸序列的鈉通道III類型a亞基(mNav1.3 a亞基)多肽，在一個實
施方式中，所述片段編碼以下的胺基酸中的一個或多個異亮氨酸 289、脯氨酸518、絲氨酸728、絲氨酸1355、天冬醯胺1909、蘇氨酸 1910和纈氨酸1921.
在另一個方面，本發明表徵了包括與啟動子可操作連接的、編碼 在此描述的mNav1.3 a亞基的核酸或其片段的表達載體.
在另一個方面，本發明表徵了包括編碼在此描述的mNav1.3 a亞 基的核酸或其片段的宿主細胞，
在另一個方面，本發明表徵了與mNavl.3 a亞基多肽優先地結合 的試劑，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的胺基酸序列，
在另一個方面，本發明表徵了與mNav1.3 a亞基多肽選擇性結合 的試劑，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的胺基酸序列，和其中所述 試劑不與鈉通道I型或II型a亞基多肽結合.在一個實施方式中，所 述試刑是小分子、核酸或蛋白.在一個實施方式中，所述試劑調節 mNa4.3a亞基多肽活性.在一個實施方式中，所述試劑是抗體或其抗 原結合片段.在一個實施方式中，所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗 體。在另一個方面，本發明表徵了藥物組合物，包括與mNav1.3 a 亞基多肽選擇性結合的試劑，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基 酸序列；和藥學上可接受的栽體.
在另一個方面，本發明表徵了調節細胞中mNav1.3 a亞基多肽活 性的方法，該方法包括提供包括mNavl.3a亞基多肽的鈉通道，其中 所述niNav1,3 a亞基多肽包括SEQ ID NO:2的胺基酸序列；使所述通 道與一定量的、有效調節所述mNav:L3a亞基多肽的活性的mNav1.3 a 亞基多肽調節物接觸.在一個實施方式中，所述調節物是小分子、核 酸或蛋白.
在另一個方面，本發明表徵了鑑定調節mNav1.3 a亞基多肽活性 的試劑的方法，該方法包括提供包含mNavl.3a亞基多肽的第一鈉通 道，其中所述mNav1.3 a亞基多肽包括SEQ ID NO:2的胺基酸序列； 使所迷通道與測試化合物接觸；以及評估所述鈉通道的活性，其中相 對於參考值的活性變化是該化合物是調節所述通道的試劑的指示。
在一個實施方式中，所述測試化合物是小分子、肽或核酸.在一 個實施方式中，所迷鈉通道包含在生物樣品中，在一個實施方式中， 所述通道與多種測試化合物接觸.
在一個實施方式中，所述樣品包含細胞膜.在一個實施方式中， 所述樣品包含細胞.在一個實施方式中，所述細胞是真核細胞.在一 個實施方式中，所述細胞是非洲爪塘(Xenopus)卵母細胞.在一個實 施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞。
在一個實施方式中，所述活性包括調節鈉濃度.在一個實施方式 中，所述評估包括檢測鈉排出(Sodium flux),在一個實施方式中， 所述接觸在不存在測試化合物的情況下發生，產生第一鈉排出量.在 一個實施方式中，所述評估包括使用Na+流量分析(Na+flux assay). 在一個實施方式中，所述分析使用膜片鉗電生理學.在一個實施方式 中，所述分析使用二電極電壓鉗電生理學.在一個實施方式中，所迷 評估包括使用鈉敏感性染料.在一個實施方式中，所述分析是高通量 分析，
在一個實施方式中，所述方法進一步包括步驟提供包含mNay1.3 a亞基多肽的第二鈉通道，其中所述mNav1.3 a亞基多肽不同於第一 mNavl.3a亞基多肽(例如，第二鈉通道不同於包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列的mNavl.3tt亞基多肽)；使所述第二鈉通道與所述測試化合 物接觸；評估所述第二鈉通道的活性.
該方法可進一步包括比較存在測試化合物的情況下笫一鈉通道的 活性和存在測試化合物的情況下第二鈉通道的活性.在一個實施方式 中，提供了多種鈉通道.
在另一個方面，本發明表徵了鑑定在治療與鈉通道電流(sodium channel current)調節有關的失調方面有用的試劑的方法，該方法包 括提供包含mNav1.3 a亞基多肽的鈉通道，其中所述多肽包括SEQ ID NO:2的胺基酸序列；使所述通道與測試化合物接觸；以及評估所述通 道的活性，其中相對於參考值的活性變化是所述測試化合物是在與鈉 電流有關的失調方面有用的試劑的指示.在一個實施方式中，所述失 調是疼痛、感覺異常、中風、頭外傷、神經變性失調、或與神經元的 超興奮性有關的失調.
所述方法可以進一步包括體內施用所述化合物(例如，使用動物 模型).所述方法可以進一步包括為了體內使用而修飾所述化合物. 所述方法可以進一步包括評估由所述化合物對相關的人類Nav1.3 a亞 基多肽的調節.
在另一個方面，本發明表徵了治療患有與鈉通道電流相關的失調 的受試者的方法，所述方法包括鑑定選擇性結合mNavL3a亞基多肽 的試劑，向需要這種治療的受試者施用藥理學試劑，所述藥理學試劑 對於包含mNav1.3 a亞基多肽的鈉通道是有選擇性的.
在一個實施方式中，所述失調是疼痛、感覺異常、中風、頭外傷、 神經變性失調、或與神經元的超興奮性有關的失調.
附圖的簡要說明
附

圖1描述了新的鼠Nav1.3 a亞基胺基酸序列與兩種人類Nav1.3 a 亞基序列和大鼠Nav1.3 a亞基序列的胺基酸序列比對，
附圖2描述了新的鼠Nav1.3 a亞基胺基酸序列與GenBank Acc. No.NM一018732的部分核苷酸序列編碼的胺基酸序列的胺基酸序列比 對。來自克隆mNavl.3野生型的預測的胺基酸序列與公開的部分小鼠 NavL3蛋白(登記號碼NM—018732)進行比對.相同的殘基高亮度顯 示，終止密碼子顯示為灰色，部分小鼠mNavl.3蛋白與克隆mNavl.3的比對從胺基酸853到1115.264-289的區域可能代表mNavl.3的可變 剪接區域.
附圖3是描述用新的鼠Nav1.3 a亞基轉染的、以一定電壓範閨去極 化的非洲爪蟾印母細胞中的鈉電流的圖表，
附圖4是描述用新的鼠Nav1.3 a亞基轉染的、以一定電壓範圍去極
化的非洲爪蟾卵母細胞中平均電流/電壓相互關係的圖表， 附圖5描述SEQ IDNOs:l-ll。
詳細說明
本發明部分基於對新的Na+通道III型a (Nav1.3 )亞基的鑑定. 該新的cDNA是從鼠腦組織分離的.該cDNA的編碼序列(SEQ ID NO:l)相應於表l中所示序列的核苷酸8到核苷酸5947.該新的亞基 的預測的胺基酸序列在SEQ ID NO:2示出.在GenBank⑧中登記號碼 NM一006922、 AF225986和NM一013U9中發現了相關的人類和大鼠亞 基核苷酸序列(SEQIDNO:4、 SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8).已 經克隆了相關的鼠Na+通道cDNA的片段，在GenBank⑧登記號 NM—018732 (SEQ ID NO:IO)中發現.SEQ ID NO:2與這個序列的比 對在附圖2中示出.
該新的鼠核酸序列含有與相關的人類和大鼠序列相比的差別.預 計這些差別編碼了獨特的多肽序列.在附圖1中描述了該新的小鼠 3+ 通道a亞基的預測的胺基酸序列與相關的大鼠和人類亞基進行的比 對，
電壓門控的Na+通道
電壓門控的Na+通道是多亞基跨膜蛋白，具有大約260千道爾頓 (kD)的a亞基、大約35 kD的P 1亞基和大約35 kD的P 2亞基。這 些通道介導鈉離子流入細胞.a亞基形成通道的電壓敏感性的成孔部 分，p亞基調節a亞基的門控和細胞 一 細胞相互作用，Na+通道的ot亞 基含有四個重複的結構域(I-IV).這些重複結構域的每一個都含有六 個跨膜片段(S1感S6)(綜述在Baker， MD， and Wood, JN. rremfa !Vi 泡,m22 ( 1 ) :27-31， 2001 ) a
電壓門控的Na+通道響應膜極化的變化經歷靜止(極化；關通道； 可激活)、開放(去極化；開通道；激活)和關閉(去極化，關通道；鈍化)狀態的循環.大多數電壓門控的Na+通道從開放快速地(即，數 毫秒內)關閉.離子導電a亞基的帶電區域對膜極化的變化敏感。
Na+通道允許電脈衝在可興奮細胞中產生和傳播.舉例來說，在 初級感覺神經元(例如，脊後根神經節(DRG)神經元、三叉神經神 經元)中表達的Na+通道響應刺激產生去極化上升支，其也是感覺信息 的傳遞所需的.
根據對河豚毒素(TTX)抑制的敏感性可以辨別Na+通道的亞型， 河豚毒素是河豚表達的胍鹽毒素.TTX以納摩爾範圍內的濃度阻斷 Navl.l、 Navl,2和Nav1.3 a亞基通道的活性.通道的所有三種類型都 在腦中表達.響應於損傷的Na+通道水平的去調節(disregulation)可 以導致神經元Na+通道的超興奮性.這種類型的去調節被認為促進了 慢性疼痛.例如，軸突橫斷引起某些Na+通道的下調和Nav1.3 a亞基 通道的上調(綜述在Waxman，S,G.，iVa似re及ev. 2:652-659， 2001)，這 導致神經元的不適當的重複發放(firing).
如在此使用的，"鈉通道a亞基"或"Na+通道a亞基"是指在 細胞，例如神經元細胞，例如，背根神經節中涉及接收、傳導和發送 信號的蛋白。"鼠Na4.3a亞基"或"mNav1.3 a亞基"是指在此描述 的鼠的HI型a亞基.
如在此使用的，"Na+通道介導的活性"是指涉及Na+通道，例如， 腦細胞或肌細胞中的Na+通道的活性、功能或反應.Na+通道介導的活 性是在例如神經系統(例如，中樞神經系統和外周神經系統)、肌肉 組織、心臟組織和其他細胞和組織中接收、傳導和發送信號所涉及的 活性.Na+通道介導的活性包括，例如，Na+流入細胞的調控和感覺刺 激的傳遞.並且，如在此可互換使用的，"Na+通道a亞基活性"、"mNav1.3 通道活性"、"Na+通道a亞基的生物學活性"、或"Na+通道a亞基 的功能活性"，是指Na+通道a亞基蛋白、多肽或核酸分子的活性、功 能或反應。
本發明的分離的蛋白，例如在此描述的mNav1.3 a亞基蛋白，具 有與SEQIDNO:2的胺基酸序列足夠同源的胺基酸序列，或由與SEQ IDNO:l足夠同源的核苷酸序列編碼，如在此使用的，術語"足夠同源 的"是指第一胺基酸或核苷酸序列，其含有與第二胺基酸或核苷酸序 列足夠或最小數量的同一或等同(例如，具有相似側鏈的胺基酸殘基)有共同的結構域或基序或共同的功能活性.編碼SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:l的核苷酸序列的所有筒並變體都認為是與SEQ ID NO:l "足 夠同源的".
因此，本發明的另一個實施方式表徵了具有niNav1.3 a亞基活性
的分離的11^3^.3 0[亞基蛋白和多肽、片段和其變體.
長度約5940個核苷酸的新的mNav1.3 a亞基編碼序列(SEQ ID NO:l)編碼長度約1980個胺基酸殘基的蛋白.編碼這個新的亞基的基 因在腦中表達，例如，在腦、心臟和骨骼肌中表達Na"J通道.Nav1.3 通道可以在給定組織中以低水平或高水平表達.某些在神經元中表達 的Nav1.3通道在神經元損傷後被上調(Waxman， SG， et al. J5/vw"及d 8886:5-14， 2000; Kim， CH， et al. MoZ. J5nn/t及d 95:153-161， 2001 ),
在以下小節中進一步詳細地描述本發明的多種方面.
分岸^凝拔為、於
本發明的一個方面涉及編碼niNav1.3 a亞基多肽或其生物學活性
部分的分離的核酸分子，以及核酸片段，其足以用作雜交探針來鑑定 編碼在此描述的mNav1.3 a亞基的相關同種型的核酸分子，和用作PCR 引物用於mNav1.3 a亞基核酸分子的擴增或突變的片段.如在此使用 的，術語"核酸分子"意圖包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA) 和RNA分子(例如，mRNA )和使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA 的類似物.核酸分子可以單鏈的或雙鏈，但優選的是雙鏈DNA,
"分離的"核酸分子是與存在於該核酸的天然來源中的其他核酸 分子分離了的核酸分子."分離的"核酸不含在得出所述核酸的有機 體的基因組DNA中天然地側翼於所述核酸的序列(即，位於所述核酸 的5，和3，末端的序列).例如，在各種實施方式中，分離的mNav:L3a 亞基核酸分子可以含有少於約5kb、 4kb、 3 kb、 2kb、 1 kb、 0.5 kb或 0.1 kb的核苦酸序列，所述核苷酸序列在得出所述核酸的細胞的基因組 DNA中天然地側翼於所述核酸分子.此外，"分離的"核酸分子，例 如cDNA分子，當通過重組技術產生時可以基本上不含其他細胞物質、 或培養基，或當化學合成時可以基本上不含化學藥品前體或其他化學 藥品。可以使用標準的分子生物學技術和在此提供的序列信息來分離本
發明的核酸分子，例如具有SEQ ID NO:l的核苷酸序列的核酸分子， 或其部分.使用SEQ ID NO:l的核酸序列的全部或部分作為雜交探 針，可以使用標準的雜交和克隆技術分離mNav1.3 ct亞基核酸分子。(例 如,描述於Sambrook, J.， Fritsh， E. F.， and Maniatis， T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd， ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor， N.Y"1989),
此外，包括SEQIDNO:l的全部或部分的核酸分子可以使用根據 SEQ ID NO:l的序列設計的合成寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應 (PCR)來分離.
本發明的核酸可以使用cDNA、 mRNA或可選擇地使用基因組 DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物根據標準PCR擴增技術來擴 增.這樣擴增的核酸可以被克隆到合適的栽體中並通過DNA序列分析 來表徵.此外，可以通過標準的合成技術，例如，使用自動化DNA合 成儀來製備相應於Na+通道a亞基核苷酸序列的寡核苷酸.
在另一個實施方式中，本發明的分離的核酸分子包含mNav1.3 a 亞基核酸分子，其是SEQIDNO:l所示核苷酸序列的互補物，或這些 核苷酸序列的部分.與SEQ ID NO:l所示核苷酸序列互補的核酸分子 是一種與SEQ ID NO:l所示核普酸序列足夠互補從而可以與SEQ ID NO:l所示核苷酸序列雜交的核酸分子.
在再另一個實施方式中，本發明的分離的核酸分子包含與SEQ ID NO:l所示核苷酸序列的完整長度有至少約75。/。、 85%、 95%或更高同 源性的核苷酸序列，或這個核苷酸序列的部分。
此外，本發明的核酸分子可以僅包含SEQIDNO:l的核酸序列的 一部分，例如，能用作探針或引物的片段或編碼mNavl.3a亞基蛋白的 生物學活性部分的片段.根據克隆mNav1.3 a亞基cDNA確定的核苷酸
序列容許產生探針和引物，其被設計用於從其他物種鑑定和/或克隆相 關的同種型以及同源物.所述探針/引物一般包含基本上純化的寡核苷 酸。所述寡核苷酸一般包含在嚴格條件下與SEQ ID NO:l的正義序 列、或SEQIDNO:l的反義序列、或SEQ ID NO:l的天然發生的等位 變體或突變體的至少約12或15個、優選的約20或25個、更優選的約30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65或75個連續核苷酸雜交的核苷酸序 列區域.
根據mNa4.3 a亞基核苷酸序列的探針可以用於檢測編碼相關同 種型的轉錄產物.所述探針可進一步包括連接於其上的標記基團，例 如，所述標記基團可以是放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子， 這種探針可用作診斷測試試劑盒的部分，用於鑑定表達或錯誤表達 mNavl,3tt亞基蛋白的細胞或組織，例如，通過測量來自受試者的細胞 樣品中編碼mNavl,3a亞基的核酸的水平，例如，檢測邁Nayl.3a亞基 mRNA水平或測定在將會影響mNav1.3 a亞基同種型表達的區域中基 因組mNav1.3 a亞基基因是否已經突變或刪除.
通過分離編碼具有mNav1.3 a亞基生物學活性(在此描述了 mNavl.3a亞基蛋白的生物學活性)的多肽的、SEQIDNO:l的核苷酸 序列的一部分，表達所編碼的mNavl.3a亞基蛋白的部分(例如，通過 體外重組表達)，並評定所編碼的mNavl.3 tt亞基蛋白的部分的活性，
可製備編碼"11^34.3(1亞基蛋白的生物學活性部分"的核酸片段。
本發明進一步包括，由於遣傳密碼的簡併性而不同於SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列、並由此編碼與SEQIDNO:l所示核苷酸序列 所編碼的相同的mNav1.3 a亞基蛋白的核酸分子.在另一個實施方式
中，本發明的分離的核酸分子具有編碼一蛋白的核普酸序列，所述蛋 白具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列.
除了 SEQ ID NO:l所示的mNav1.3 a亞基核苷酸序列之外，本領 域技術人員應當理解的是，在群體中可能存在著導致mNav1.3 a亞基蛋 白的胺基酸序列變化的DNA序列多態性.由於天然的等位變異，這種 在mNav1.3 a亞基基因中的遺傳多態性可能存在於群體的個體之間.如 在此使用的，術語"基因"和"重組基因"是指包含編碼mNav1.3 a
亞基蛋白的開放閱讀框的核酸分子.這種天然的等位變異一般可引起 mNav1.3 a亞基基因的核苷酸序列中1-5%的變化，在mNav1.3 a亞基
基因中，作為天然等位變異的結果並且不改變mNav1.3 a亞基蛋白的功 能活性的、任何的和所有的這種核苷酸變異以及產生的胺基酸多態
性，都包括在本發明的範閨之內.
此外，編碼其他mNav1.3 a亞基通道家族成員並由此具有不同於 SEQ IDNO:l的mNav1.3 a亞基序列的核芬酸序列的核酸分子，包括在本發明的範圍之內.例如，根據mNavl.3a亞基的核苷酸序列(例如， SEQIDNO:l)可以鑑定另一個mNavl,3a亞基cDNA,此外，編碼來
自不同物種的mNav1.3 a亞基蛋白並由此具有不同於SEQ ID NO:l的 mNavl.3a亞基序列的核苷酸序列的核酸分子，包括在本發明的範圍之內.
相應於本發明的mNav1.3 a亞基cDNA的天然等位變體和同源物 的核酸分子，可以根據它們與在此公開的mNav1.3 a亞基核酸的同源性 使用在此公開的cDNA或其部分作為雜交探針根據標準雜交技術在嚴 格雜交條件下來分離.
因此，在另一個實施方式中，本發明的分離的核酸分子長度是至 少15、20、25、30或更多個核苷酸，並在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:l 的核苷酸序列的核酸分子雜交.優選的，所述分子在高度嚴格條件下 雜交.在其他實施方式中，所述核酸長度是至少30、 300、 500、 700、 850、 950或2000個核苷酸.如在此使用的，術語"在嚴格條件下雜交" 意圖是描述雜交和洗滌的條件，在這種條件下彼此具有至少60%、 85 %或95%同源性的核苷酸序列一般仍然相互雜交.雜交條件是本領域 技術人員已知的，可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.， 6.3 a subuniU-6.3 a subunit.6, 1991中找到.中度 雜交條件定義為相當於在2X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在30TC下雜 交，隨後在IXSSC、 0.1% SDS中在50TC下洗滌，高度嚴格條件定義 為相當於在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在45TC下雜交，隨後在0.2 XSSC、 0.1%SDS中在651C下洗滌.
在中度或高度嚴格條件下與SEQ ID NO:l的序列雜交的本發明 的分離的核酸分子可以相應於天然發生的核酸分子.如在此使用的，
"天然發生的"核酸分子是指具有在自然中發生的核苷酸序列的RNA 或DNA分子(例如，編碼天然蛋白).
除了可能存在於群體中的mNav1.3 a亞基序列的天然發生的等位 變體之外，本領域技術人員將進一步理解的是，可以通過突變向SEQ ID NO:l的核苷酸序列中導入變化，從而引起所編碼的mNav1.3 a亞基蛋 白的胺基酸序列的變化，而不改變mNa4,3a亞基蛋白的功能能力.例 如，可以在SEQlDNO:l的序列中進行導致在"非必需"胺基酸殘基
."非必需"胺基酸殘基是可以在mNav1.3a亞基的野生型序列中改變而不改變生物學活性的殘基，而"必需"氨 基酸殘基是生物學活性所需的，例如，在本發明的mNavL3a亞基蛋白 之間保守的胺基酸殘基，預計是特別不能改變的.此外，在本發明的 mNav1.3 a亞基蛋白和其他mNav1.3 a亞基通道亞基之間保守的其他氨 基酸殘基很可能是不能改變的.
因此，本發明的另一個方面涉及編碼mNa4.3 a亞基蛋白的核酸 分子，所述mNavl,3a亞基蛋白含有對於活性不必需的胺基酸殘基的變 化.這種mNav1.3 a亞基蛋白在胺基酸序列上與SEQ ID NO:2不同， 而又保持了生物學活性.生物學活性可以通過在此描述的分析來測 量，例如Na+通道活性分析，例如Na+流入分析，在一個實施方式中， 分離的核酸分子包含編碼一蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包含與 SEQIDNO:2有至少約65。/。、 75%、 85%、 95%或更高同源性的氨基
酸序列.
可以通過向SEQ ID NO:l的核苷酸序列中導入一個或多個核苷 酸替換、添加或刪除，從而在所編碼的蛋白中導入一個或多個胺基酸 替換、添加或刪除，來產生編碼與SEQID NO:2的蛋白同源的mNav1.3 a亞基蛋白的分離的核酸分子.可以通過標準技術，例如定點誘變和 PCR介導的誘變來向SEQIDNO:l中導入突變，可以在一個或多個預 測的非必需胺基酸殘基處進行保守性胺基酸替換，"保守性胺基酸替 換"是在其中胺基酸殘基被替換為具有相似側鏈的胺基酸殘基的一種 替換.本領域已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族.這些家 族包括帶有鹼性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈 (例如，天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘氨酸、天 冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性 側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta-分支的側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨 酸)的胺基酸.由此，在mNavl.3a亞基蛋白中預測的非必需胺基酸殘 基優選的被來自相同側鏈家族的另 一個胺基酸殘基替換。在對SEQ ID NO:l誘變之後，可以表達編碼的蛋白並且可以測定該蛋白的活性。
可以分析突變mNavl,3a亞基蛋白的(1)與非mNav1.3 a亞基蛋 白質分子，例如，Na+通道pi或p2亞基，或TTX相互作用；或(2)調節膜興奮性的能力.
除了如上所述編碼mNav1.3 tt亞基蛋白的核酸分子之外，本發明 的另一個方面涉及與其反義的分離的核酸分子."反義"核酸包含與 編碼蛋白的"正義"核酸互補的核苷酸序列，例如，與雙鏈cDNA分 子的編碼鏈互補，或與mRNA序列互補.因此，反義核酸可以與有義 核酸氫結合(hydrogen bond).反義核酸可以與整個mNav1.3 a亞基 編碼鏈互補，或僅與其一部分互補.在一個實施方式中，反義核酸分 子與編碼mNa4,3a亞基的核苷酸序列的編碼鏈的"編碼區"反義.術 語"編碼區"是指包含被翻譯成胺基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區 域(例如，mNavl,3a亞基的編碼區相應於SEQIDNO:l).在一個實 施方式中，反義核酸分子與編碼mNav1.3 a亞基的核苷酸序列的編碼鏈 的"非編碼區"反義.術語"非編碼區"是指側翼於編碼區不被翻譯 成胺基酸的5，和3，序列(即，也稱為5，和3，非翻譯區).
給出在此公開的編碼mNav1.3 a亞基的編碼鏈序列(例如，SEQ ID NO:l)，本發明的反義核酸可以根據Watson和Crick鹼基配對的規則 來設計.反義核酸分子可以與mNav1.3 a亞基mRNA的完整編碼區互 補，但更優選的是與mNav1.3 a亞基mRNA的編碼或非編碼區的僅一 部分反義的寡核苷酸.例如，反義寡核苷酸可以與圍繞著mNav1.3 a 亞基mRNA的翻譯起始位點的區域互補.反義寡核苷酸的長度可以 是，例如，約5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45或50個核苷酸. 本發明的反義核酸可以使用化學合成和酶連接反應使用本領域已知的 方法來構建.例如，可以使用天然發生的核苷酸或不同地修改的核苷 酸來化學合成反義核酸(例如，反義寡核苷酸)，目的是提高分子的 生物學穩定性或提高反義和正義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩定 性，例如，可以使用硫代磷酯衍生物和吖啶取代的核苷酸.可用於產 生反義核酸的修改的核苷酸的實例包括5-氟尿嘧咬、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧咬、5-碘尿嘧啶、次黃噪呤、黃噪呤、4-acetylcy tosine、 5-(羧 基鞋基甲基)尿嘧咬，1，5-carboxymethylami nomethyl-2-硫尿嘧咬、5-
黃苷、N6-異丙烯基腺嘌呤、1-甲基鳥噪呤、1-甲基次黃苷、2，2-二甲基 鳥噪呤、2-甲基腺噪呤、2-甲基鳥噪呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 N6-腺噪呤、7-甲基鳥嚷呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-
氫尿嘧咬、beta-D-galactosylqueosine、 次硫尿嘧焚、beta-D-mannosylqueosiiie、 5 ,-甲氧基羧甲基尿嘧梵、5-甲 氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、 wybutoxosine、偽尿嘧咬、queosine、 2-碟胞嘧咬、5-甲基-2-疏尿嘧咬、 2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、S-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿 嘧啶-5-氧乙酸(v) 、 5-甲基-2-硫尿嘧啶、3- (3-氨基-3-N-2-羧丙基) 尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤.做為選擇，可以使用表達栽體生物學地產生 反義核酸，在所述表達栽體中已經按反義方向亞克隆了核酸(即，從 該插入的核酸轉錄的RNA將是感興趣的目標核酸的反義反向的，在以 下小節中進一步描迷了).
一般地將本發明的反義核酸分子施用給受試者或在原位產生，從 而它們與編碼mNav1.3 a亞基蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA雜 交或結合，從而抑制該蛋白的表達，例如，通過抑制轉錄和/或翻譯。 根據常規的核苷酸互補性進行雜交來形成穩定的雙鏈體，或，例如， 對於與DNA雙鏈體結合的反義核酸分子來說，通過雙螺旋的大溝中的 特異性相互作用來雜交.本發明的反義核酸分子的施用途徑的實例包 括在組織部位直接注射.做為選擇，可以修改反義核酸分子以靶向選 定的細胞，然後全身地施用.例如，對於全身性施用，可以修改反義 分子使得它們特異性結合選定細胞表面表達的受體或抗原，例如，通 過將反義核酸分子連接到與細胞表面受體或抗原結合的肽或抗體上。 也可以施用在此描述的栽體將反義核酸分子遞送給細胞.為了達到反 義分子的足夠的細胞內濃度，預想了栽體構建體，在其中反義核酸分 子被置於強pol H或pol III啟動子的控制下.
在又一個實施方式中，本發明的反義核酸分子是a-異頭核酸分 子.a-異頭核酸分子與互補RNA形成特殊的雙鏈雜交物，其中，與普 通的P單元相反,鏈是相互平行的(Gaultier et al. 7V"c7e/c JaVfa. 15:6625-6641， 1987).反義核酸分子也可以包含2 '-o-甲基核糖核苷酸 (Inoue et al. ( 1987) iV"c/e!c爿c!Vfc15:6131-6148)或嵌合的 RNA-DNA類似物(Inoue et al. Ffi^S JLe汰215:327-330， 1987 ),
在再另一個實施方式中，本發明的反義核酸是核酶。核酶是具有 核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能夠裂解含有與它們互補的區 域的單鏈核酸，例如，mRNA,因而，核酶(例如，錘頭核酶(描述於 (Haselhoff and Gerlach iV似",e 334:585-591， 1988))可用於催化性裂解mNav1.3 a亞基mRNA轉錄產物從而抑制mNav1.3 a亞基mRNA的 翻譯.可以根據在此公開的mNavl,3a亞基cDNA的核苷酸序列(即， SEQ ID NO:l)設計具有對mNav1.3 a亞基編碼核酸的特異性的核酶. 例如，可以構建四膜蟲L"19IVSRNA的衍生物，其中活性部位的核苷 酸序列與mNav1.3 a亞基編碼mRNA中要裂解的核苷酸序列互補.參 見，例如，Cech et al.美國專利No.4，987，071;和Cech et al.美國專利 No.5，116，742,做為選擇，mNav1.3 a亞基mRNA可用於從RNA分子庫 (pool)中挑選具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA,參見，例 如，Bartel， D. and Szostak， J. W. Scie/ice 261:1411-1418， 1993.
在本發明的另一個實施方式中，RNA幹擾(RNAi)可以用於抑制 mNavl.3tt亞基蛋白的表達.可以降低各種抑制性RNAi分子，那些抑 制mNav1.3 a亞基表達的分子可以配製為藥物組合物，來在在此描述的 治療方法中施用。
RNAi是一種術語，用於指一種機制，通過這種機制特定的mRNA 在宿主細胞中被降解，為了抑制mRNA，相應於待沉默的基因(例如， 編碼mNa4.3 a亞基多肽的基因)的一部分的雙鏈RNA (dsRNA)被 導入到細胞中.dsRNA被消化成21-25個核苷酸長度的雙鏈體，稱為 短幹擾RNA (或siRNA)，其與核酸酶複合物結合形成所稱的RNA 誘導的沉默複合物(RISC).通過在siRNA鏈之一和內源mRNA之 間的鹼基配對相互作用，RISC靶向同源的轉錄產物.它然後裂解 mRNA的從siRNA 3，端起約12個核苷酸.(參見Sharp " a/.， Ge/ies "ev. 15:485-490， 2001， and Hammond " fl/" iVa似re及ev. (Jew. 2:110-119, 2001).研究在人類細胞，包括人類胚腎細胞和Hela細胞中成功地證 明了RNAi(參見，例如，Elbashir W a/.，7Vfl似re 411:494-498， 2001). 通過進行RNA髮夾序列的內源表達(參見Paddison " fl/.， iVoc. A^/. Jcarf. 99:1443-1448， 2002)或通過小的(21-23nt) dsRNA的
轉染(綜述在Caplen，7VemfeiVi歷WecA. 20:49-51,2002)，可以在哺乳
動物細胞中誘導基因沉默。
RNAi技術利用了標準的分子生物學方法.dsRNA(在此，例如， 其相應於編碼mNav1.3 a亞基多肽的序列)可以通過標準方法產生(例 如，通過用T7 RNA聚合酶同時轉錄相應於mNav1.3 a亞基序列的模板 DNA的兩條鏈；RNA也可以化學合成或重組產生).生產dsRNA的試劑盒是商業上可獲得的(來自，例如，New England Biolabs，Inc), 用於介導RNAi的RNA可以包括合成的或修改的核苷酸，例如硫代磷 酯核普酸。用dsRNA或用工程化以產生dsRNA的質粒轉染細胞的方 法也是本領域常規的.
已經報導了在用mRNA-cDNA雜交構建體轉染的哺乳動物細胞中 與RNAi所觀察到的相類似的基因沉默效果(Lin "a/.，歷oc/^飢 J8/印/^s.281:639-644， 2001)。因此，含有mNav1.3 a亞基 序列的mRNA-cDNA雜交物，以及含有mNav1.3 a亞基序列的雙鏈體 (例如，含有21-23 bp單體的雙鏈體)，在本發明的範圍之內.可以 根據在此描述的分析測試雜交物和雙鏈體的活性(即，它們可以充當 測試試劑)，展現出抑制活性的那些可以用來治療患者，所述患者患 有，或可能發展出與mNavl.3a亞基活性有關的疾病或狀況，例如神經
性疼痛.
本發明的dsRNA分子(相應於mNav1.3 a亞基基因的一部分的雙 鏈RNA分子)可以按各種方式變化，例如，它們可以包括3，羥基以及， 如上所述，可以含有21、 22或23個連續核苷酸的鏈.此外，在3，末 端、5，末端、或在兩端，它們可以是平端的，或包括突出末端.例如， RNA分子的至少一條鏈可以具有長度約1到約6個核苷酸的3，突出(例 如，1-5、 1-3、 2-4或3-5個核苷酸(無論是嘧啶核苷酸還是嘌呤 核苷酸).當兩條鏈都包括突出時，對於每條鏈，突出的長度可以是 相同的或不同的.為了進一步提高RNA雙鏈體的穩定性，可以針對降 解來穩定3，突出(通過，例如，包括入噪呤核苷酸，例如腺苷酸或烏 嚷呤核苷酸，或通過修改的類似物替換嘧啶核苷酸(例如，用2'-脫 氧胸腺嘧啶核苷來替換尿嘧啶核苷2核苷酸3，突出的替換，有耐受性 並且不影響RNAi的效率)，構成雙鏈體或雜交抑制物的，或僅作為反 義RNA寡核苷酸的單鏈mNav1.3 a亞基RNA分子，也在本發明的範 圍之內。任何dsRNA都可以用於本發明的方法，只要它與感興趣的目 標基因，例如，mNa4.3a亞基基因有足夠介導RNAi的同源性.雖然 如上所述雙鏈體具有21-23個核苷酸，但本發明不受此限制；在可以 施用的dsRNA的長度方面沒有上限(例如，dsRNA可以從基因的約21 個鹼基對到基因的全長，或更多(例如，50-100、 100-250、 250-500、 500-1000，或超過1000個鹼基對).當將這些核酸施用給人類時，它們可以降低mNavl,3 a亞基 mRNA水平，從而抑制mNav1.3 a亞基的表達，將細胞或有機體維持 在某些情況下，在這些情況中mNav1.3 a亞基mRNA被降解，從而在 細胞或有機體中介導RNAi.做為選擇，可以從個體獲得細胞，在體外 處理，並重新導入到個體中.
在又一個實施方式中，本發明的mNav1.3 a亞基核酸分子可以在 鹼基部分、糖部分或磷酸醋主幹進行修改來改善，例如，分子的穩定
主幹來產生肽核酸，(參見Hyrup B. et al. 說'卯rgflm'c在Aferf/ci/tfl/ CAe附^/j 4( 1): 5-23， 1996).如在此使用的，術語"肽核酸"或"PNA" 是指核酸模擬物例如DNA模擬物，在其中脫氧核糖褲酸醋主幹被偽肽 主千替代，僅保留四個天然的核鹼基.已經顯示了 PNA的中性主幹允 許在低離子強度的條件下與DNA和RNA特異性雜交.可以使用標準 的固相肽合成方案，例如在Hyrup B. et al. supra; Perry-O'Keefe et al. 屍wc. iVW/. Jcarf. 5W. 93: 14670-675， 1996中描述的，來進行RNA寡聚 物的合成.
mNav1.3 ot亞基核酸分子的PNA可以用於治療和診斷應用.例 如，PNA可以用作反義或抗基因(antigene)試劑，用於通過例如誘導 轉錄或翻譯延滯或抑制複製來序列特異性地調節基因表達.mNav1.3 a 亞基核酸分子的PNA也可以用於基因中的單鹼基對突變分析，(例如， 通過PNA指導的PCR鉗)；當與其他酶組合使用時作為"人工限制 性內切酶"，(例如，SI核酶(Hyrup B.,同上))；或作為探針或 引物用於DNA測序或雜交(Hyrup B. et al"同上；Perry-O'Keefe, 同上)。
在另一個實施方式中，通過給PNA連接親油性的或其他輔助基 團，通過PNA-DNA嵌合體的形成，或通過使用脂質體或本領域已知 的其他藥物遞送技術，可以修改mNav1.3 a亞基的PNA (例如，來增 強它們的穩定性或細胞攝取).
在其他實施方式中，寡核苷酸可以包括其他附加的基團，例如肽 (例如，用於體內靶向宿主細胞受體)，或促進跨細胞膜轉運(參見， 例如Letsinger et al. /Voc. TVfl". Jcflrf. 5W. US. 86:6553-6556， 1989j Lemaitre et al.7Va汰5W.84:648-652， 1987; PCT '〉開No.W088/09810))或跨血腦屏障轉運(參見，例如，PCT公開 No.W089/10134)的試劑.此外，可以用雜交觸發的裂解試劑(參見， 例如Krol et al.說o-rec/im^ies 6:958-976， 1988)或插入試劑(參見， 例如Zon 7V^/m5:539-549， 1988)來修飾寡核苷酸.為此，寡核 苷酸可以與另一個分子結合(例如，肽、雜交觸發的交聯劑、轉運試 劑、或雜交觸發的裂解試劑).
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本發明一個方面涉及分離的mNav1.3 a亞基蛋白和其生物學活性 部分，以及適合用作免疫原來產生抗mNavl.3 a亞基抗體的多肽片段， 在一個實施方式中，可以使用標準的蛋白純化技術通過合適的純化方 案從細胞或組織來源分離天然mNav1.3 a亞基蛋白.在另一個實施方式 中，通過重組DNA技術產生mNa4,3a亞基蛋白.作為對重組表達的 替代，可以使用標準的肽合成技術來化學地合成mNav1.3 a亞基蛋白或 多肽。
"分離的"或"純化的"蛋白或其生物學活性部分基本上不含來 自得出該mNav1.3 a亞基蛋白的細胞或組織來源的細胞物質或其他汙 染蛋白，或當化學合成時基本上不含化學藥品前體或其他化學藥品. 用語"基本上不含細胞物質"包括製備mNavl.3a亞基蛋白，其中蛋白 從細胞的細胞組分分離，所述蛋白分離自所述細胞或由所述細胞重組 產生。在一個實施方式中，用語"基本上不含細胞物質"包括製備 mNav1.3 a亞基蛋白，所述mNav1.3 a亞基蛋白具有低於約30% (乾重) 的非mNavL3a亞基蛋白(在此也稱為"汙染蛋白")，更優選的低於 約20%、 10%或5%的非mNavl,3a亞基蛋白，當所述mNav1.3 a亞基 蛋白或其生物學活性部分是重組產生的時，同樣優選的是它基本上不 含培養基，即，培養基低於蛋白製品體積的約20%、 10%或5%.
用語"基本上不含化學藥品前體或其他化學藥品"包括製備 mNav1.3 a亞基蛋白，其中所述蛋白從在該蛋白的合成中所涉及的化學 藥品前體或其他化學藥品中分離.用語"基本上不含化學藥品前體或 其他化學藥品"包括製備niNav1.3 a亞基蛋白，其具有低於約30%、 20%、 10%或5% (乾重)的化學藥品前體或非mNa4.3a亞基化學藥如在此使用的，mNav1.3 a亞基蛋白的"生物學活性部分"包括 mNav1.3 a亞基蛋白的片段，其參與mNav1.3 a亞基分子與非mNav1.3 a 亞基分子之間的相互作用.mNav1.3 a亞基蛋白的生物學活性部分包括 包含胺基酸序列的肽，所述胺基酸序列來源於mNav1.3 a亞基蛋白的氨 基酸序列，例如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列，或與之足夠同源， 所述肽包括比全長mNavl.3a亞基蛋白少的胺基酸，並展現出mNav1.3 a亞基蛋白的至少 一種活性. 一般地，生物學活性部分包含具有mNavl .3 a亞基蛋白的至少一種活性的結構域或基序，所述活性例如結合P 1或 0 2 Na+通道亞基.mNav1.3 a亞基蛋白的生物學活性部分可以用作把 點，用於開發調節Na+通道介導的活性的試劑，
在一個實施方式中，mNav1.3 a亞基蛋白的生物學活性部分包含 至少一個跨膜結構域。mNav1.3 a亞基蛋白的生物學活性部分介導 mNav1.3 a亞基活性並包括mNav1.3 a亞基蛋白的一種或多種特徵.在 其中蛋白的其他區域被刪除的生物學活性部分，可以通過重組技術來 製備，並對其評估天然mNav1.3 a亞基蛋白的一種或多種功能活性.
在一個實施方式中，mNav1.3 a亞基蛋白具有SEQ ID NO:2所示 的胺基酸序列，或基本上與SEQIDNO:2同源，並保持了 SEQIDNO:2 的蛋白的功能活性，而由於天然的等位變異或突變在胺基酸序列上又 不同，如在關於核苷酸的小節中詳細描述的.
因此，在另一個實施方式中，mNavl .3 a亞基蛋白是包含與SEQ ID NO:2有至少約50。/n、 75%、 85%、 95%、 99%或更高特異性的胺基酸 序列的蛋白.
為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸的同源性百分比，根據最優 的比較目的對序列進行比對(例如，可以在笫一胺基酸或核酸序列中 導入缺口來優化與笫二胺基酸或核酸序列的比對，並且對於比較目的 可以忽略非同源序列).用於比較目的比對的參考序列的長度可以是 該參考序列長度的至少50%、甚至70%、 80%或90%.然後比較相應
胺基酸位置或核苷酸位置上的胺基酸殘基或核苷酸.當第一序列中的 一個位置被與第二序列中相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據 時，則該分子在這個位置是同源的(即，如在此使用的，胺基酸或核 酸"同源性"相當於胺基酸或核酸"同一性").兩個序列之間的同 源性百分比是序列共有的同一的位置數目的函數(即，同源性％ -同一的位置數/總位置數x100).
可以使用數學算法來完成兩個序列之間的序列比較和同源性百分 比的確定.用於序列比較的數學算法一個非限制性實例是Karlin and Altschul iVfl汰t/A4 87:2264-68， 1990的算法，在Karlin and Altschul屍roc. iVa". Jcc^. 5W. t/5L4 90:5873-77， 1993中進行了修 改，這種算法被合併到Altschul， et al. / Mo/. 215:403-10， 19卯的 NBLAST和XBLAST程序中(版本2.0).可以用NBLAST程序進行 BLAST核苷酸檢索，分值- 100，字長- 12,來獲得與本發明的mNav1.3 ot亞基核酸分子同源的核苷酸序列.可以用XBLAST程序進行BLAST 蛋白檢索，分值-50，字長-3，來獲得與本發明的mNav1.3 oc亞基蛋 白分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的的有缺口的比對， 可以利用如Altschul et al" iV"c/"c25 (17) : 3389-3402， 1997 中描述的Gapped BLAST.當利用BLAST和Gapped BLAST程序時， 可以使用各個程序(例如，XBLAST和NBLAST )的默i人參數。參見 國家生物技術信息中心的網站，用於序列比較的數學算法的另一個非 限制性實例是Myers and Miller, CABIOS (1989)的算法.這種算法被 合併到ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比對軟體包中的一 部分.當利用ALIGN程序來比較胺基酸序列時，可以使用PAMI120 加權殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分.
本發明還提供了 mNav1.3 oc亞基嵌合或融合蛋白.如在此使用 的，mNav1.3 ot亞基"嵌合蛋白"或"融合蛋白"包含與非mNav1.3 a 亞基多肽可操作連接的mNav1.3 ct亞基多肽。"mNav1.3 oc亞基多肽" 是指具有相應於mNav1.3 cc亞基的胺基酸序列的多肽，而"非mNav1.3 a亞基多肽"是指具有相應於與mNav1.3 ct亞基蛋白基本上不同源的 蛋白的胺基酸序列，所述蛋白例如，不同於mNa4,3 a亞基蛋白並來 源於相同或不同有機體的蛋白，或不含有在此描述的mNav1.3 a亞基 蛋白的一種或多種特徵的蛋白，在mNav1.3 ot亞基融合蛋白中， mNav1.3 ot亞基多肽可以相應於mNav1.3 a亞基蛋白的全部或部分. 在特定的實施方式中，mNavl.3 a亞基融合蛋白包含mNa4.3 cx亞基 蛋白的至少一個生物學活性部分.在另一個實施方式中，mNav1.3 a 亞基融合蛋白包含mNav1.3 a亞基蛋白的至少兩個生物學活性部分. 在所述融合蛋白中，術語"可操作連接的"意圖是指出niNav1.3 ct亞基多肽和非inNav1.3 a亞基多肽是按閱讀框相互融合的，非mNav1.3 ot亞基多肽可以與mNavl,3 a亞基多肽的N-末端或C-末端融合.
例如，在一個實施方式中，所述融合蛋白是GST-mNav1.3 ot亞 基融合蛋白，其中mNavl.3 a亞基序列被融合到GST序列的C-末端. 這種融合蛋白可以便於重組mNav1.3 ot亞基的純化，
在另一個實施方式中，所述融合蛋白是在其N-末端含有異源信號 序列的mNa4.3 oc亞基蛋白.在某些宿主細胞(例如，哺乳動物宿主 細胞)中，mNav1.3 ot亞基的表達可以通過使用異源信號序列來提高.
本發明的mNav1.3 ot亞基融合蛋白可以摻入藥物組合物並體內 施用給受試者，mNav1.3 oc亞基融合蛋白可以用來影響mNav1.3 ct亞 基底物的生物利用率.對於治療與Na+通道活性有關的失調，例如，神 經性疼痛，使用mNav1.3 a亞基融合蛋白可能是治療上有用的。
此外，本發明的mNa4.3 a亞基融合蛋白可用作免疫原來在受試 者中產生抗niNav1.3 a亞基抗體，來純化mNav1.3 a亞基配體，和用 於篩選分析以鑑定抑制mNavl.3 a亞基與mNav1.3 a亞基底物的相互 作用的分子.
本發明的mNav1.3 a亞基嵌合或融合蛋白可以通過標準的重組 DNA技術產生.例如，根據常規技術將編碼不同多肽序列的DNA片 段按閱讀框連接在一起，例如，通過使用平端的或交錯端的末端用於 連接，限制性內切酶消化以提供合適的末端，視情況填補粘性末端， 鹼性磷酸酶處理以避免不希望的接合，和酶連接.融合基因可以通過 常規技術，包括自動化DNA合成儀，來合成.做為選擇，可以使用錨 引物來進行基因片段的PCR擴增，所述錨引物產生兩個連續基因片段 之間的互補的突出，其隨後可以退火和再擴增以產生嵌合基因序列(參 見,例如Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992 ).此外許多以及編碼融合部分的表達栽體(例 如，GST多肽)是商業上可獲得的.mNa4.3a亞基編碼核酸可以克隆 到這種表達栽體中，從而融合部分按閱讀框連接到mNav1.3 a亞基蛋白 上.
本發明還涉及作為mNav1.3 a亞基激動劑(模擬物)或作為 mNavl.3a亞基拮抗劑起作用的mNav:L3a亞基蛋白的變體.可以通過 誘變，例如，離散點突變或對inNav1.3 a亞基蛋白的截斷來產生mNav1.3a亞基蛋白的變體.mNav1.3 a亞基蛋白的激動劑可以基本上保持 mNav1.3 a亞基蛋白的天然發生形式的相同的生物學活性，或其生物學 的活性的子集.mNav1.3 a亞基蛋白的拮抗劑可以通過例如竟賽地調節 mNav1.3 a亞基蛋白的Na+通道介導的活性，來抑制mNav1.3 a亞基蛋 白的天然發生的形式的一種或多種活性。因而，通過用有限功能的變 體處理可以引發特定的生物學效果.在一個實施方式中，用具有所述 蛋白的天然發生形式的生物學活性子集的變體治療受試者，相對於用 mNav1.3 a亞基蛋白的天然發生形式治療，在受試者中有較少的副作 用。
在一個實施方式中，作為mNa4,3 a亞基激動劑(模擬物)或作 為mNav1.3 a亞基拮抗劑起作用的mNav1.3 a亞基蛋白變體可以通過根 據mNav1.3 a亞基蛋白激動劑或者拮抗劑活性篩選mNav1.3 a亞基蛋白 的突變體，例如，截斷突變體的組合庫來鑑定.在一個實施方式中， mNavl.3 a亞基變體的多樣化的庫通過核酸水平的組合誘變來產生，並 由多樣化的基因文庫編碼。可以通過例如，將合成寡核苷酸的混合物 酶連接到基因序列中，從而作為單獨的多肽或選擇性地作為其中含有 mNav1.3 a亞基序列組的更大的融合蛋白的組(例如，對於噬菌體展 示)，可能的mNav1.3 a亞基序列的簡併組是可表達的，來產生mNav1.3 a亞基變體的多樣化庫.存在著可用於從簡併寡核苷酸序列產生可能的 mNav1.3 a亞基變體庫的各種方法.可以在自動DNA合成儀中進行簡 並基因序列的化學合成，合成基因然後可以連接到適合的表達栽體 中。使用基因的簡併組允許在混合物中提供編碼期望的、可能的 mNav1.3 a亞基序列組的所有序列.合成簡併寡核苷酸的方法是本領域 已知的(參見，例如Narang， S. A. 7^rflAWrort 39:3， 1983; Itakura et al.
及ev.53:323， 1984; Itakura et al. 5"度e 198:1056， 1984; Ike et al. iVwc/e/c ^c/rf及m. 11:477， 1983
此外，mNav1.3 a亞基蛋白編碼序列的片段的庫可以用來產生 mNav1.3 a亞基片段的多樣化群體，用於mNav1.3 a亞基蛋白變體的篩 選和隨後的選擇.
在此描述的mNav1.3 a亞基蛋白可以用可檢測物質直接或間接地 標記，以便於檢測結合的或未結合的結合試劑.適合的可檢測物質包 括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料和放射性物質.分離的mNav1.3 a亞基蛋白或其部分或片段可被用作免疫原來使 用多克隆和單克隆抗體製備的標準技術產生結合mNav1.3 a亞基的抗 體，可以使用全長mNavl,3a亞基蛋白，或做為選擇，本發明提供了用 作免疫原的mNav1.3 a亞基的抗原性肽片段.mNav1.3 a亞基的抗原性 肽包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列，或SEQ ID NO:2的胺基酸序列的 至少8個胺基酸殘基，並包括mNavl,3a亞基的表位，從而針對該肽產 生的抗體與mNavl,3a亞基形成特定的免疫複合物.優選的，抗原性肽 包含至少IO、 15、 20或30個胺基酸殘基.
mNav1.3 a亞基免疫原一般用於通過使用該免疫原免疫適合的受 試者(例如，兔、山羊、小鼠或其他哺乳動物)來製備抗體.適合的 免疫原性製品可以含有，例如，重組表達的mNavl,3a亞基蛋白或化學 合成的mNavl,3a亞基多肽.該製品可以進一步包括佐劑，例如弗氏完 全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激性試劑.用免疫原性mNav1.3 a 亞基製品免疫適合的受試者誘導了多克隆抗mNav1.3 a亞基抗體反 應.
因此，本發明的另一個方面涉及抗mNav1.3 a亞基抗體.如在此 使用的術語"抗體"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活 性部分，即，含有特異性地與抗原例如mNa4Ja亞基結合(免疫反應) 的抗原結合位點的分子.免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實例包括F (ab)和F (ab') 2片段，可通過用酶，例如胃蛋白酶處理抗體產生。 本發明提供了結合mNav1.3 a亞基的多克隆和單克隆抗體，如在此使用 的，術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指抗體分子的群 體，其僅含有能與mNav1.3 a亞基的特定表位免疫反應的一類抗原結合 位點.因而單克隆抗體組合物一般展現了對於其免疫反應的特定 mNav1.3 a亞基蛋白的單一結合親合性。
如上所述通過用mNav1.3 a亞基免疫原免疫適合的受試者可以制 備多克隆抗mNavl,3a亞基抗體.可以通過標準技術，例如，用使用了 固定化mNavl.3a亞基的酶聯免疫吸附分析(ELISA)，可以監視免疫 的受試者中在時間上抗mNavl.3a亞基抗體滴度.如杲需要，可以從哺 乳動物(例如，從血液)分離針對mNavl.3a亞基的抗體分子，通過已 知技術，例如蛋白A層析來進一步純化，以獲得IgG級分.在免疫後 的適當時間，例如，當抗mNav:L3a亞基抗體滴度最高時，可以從受試者獲得抗體生產細胞，用於通過標準技術製備單克隆抗體，例如，最
初由Kohler and Milstein (l975) JVa似"256:495_497描述的雜交瘤技 術(也參見Brown et al. / /附附mwo/. 127:539-46， 1981; Brown et al. j.
Oie/ft 255:4980-83， 1980; Yeh et al. iVoc. Wa".爿caA 5W. 76:2927-31， 1976; and Yeh et al. /W. / Cancer 29:269-75， 1982 )，更新 近的人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor et al. 7> w"/io/ 7V，rf^ 4:72， 1983 ), EBV雜交瘤技術(Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss， Inc., pp, 77-96， 1985)或三瘤(trioma)技術。 生產單克隆抗體雜交瘤的技術是公知的(一般參見R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); E. A. Lerner Yale / 脂.臉rf.， 54:387-402， 1981; M. L. Gefter et al. Somatic Cell Genet. 3:231-36， 1977),簡要地，將永生細胞系( 一般是骨髄瘤)與來自用 如上所述mNav1.3 a亞基免疫原免疫的哺乳動物的淋巴細胞( 一般是脾 細胞)融合，篩選產生的雜交瘤細胞的培養物上清液來鑑定產生結合 mNav:L3a亞基的單克隆抗體的雜交瘤.
可以將許多用於融合淋巴細胞和永生細胞系的已知方案的任何一 種，應用於產生抗mNa4.3a亞基單克隆抗體的目的(參見，例如，G. Galfre et al.266:55052, 1977j Gefter et al. S頻Wc CW/ ( 麼t， cited supra; Lemer， Yale / J :'o/. AfedL， cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra).此夕卜，技術人員將能理解，存在 著也會有用的這些方法的許多變體.
作為對製備單克隆抗體分泌雜交瘤的選擇，可以通過用mNav1.3 a 亞基篩選重組組合免疫球蛋白庫(例如，抗體噬菌體展示庫)從而分 離結合mNav1.3 a亞基的免疫球蛋白庫成員，來鑑定和分離單克隆抗 mNav1.3 a亞基抗體.用於產生和篩選噬菌體展示庫的試劑盒是商業上 可獲得的(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, CatalogNo.27-9400-01 ).另外，對於產生和篩選抗體展示庫特別有用 的方法和試劑的實例可以在例如Ladner et al.美國專利No.5，223，409; Kang et al. PCT國際公開No.WO 92/18619;和McCafferty et al. iVa似^ 348:552-554， 1990中找到.
另外，可以使用標準重組DNA技術產生的重組抗mNavl.3 a亞基抗體，例如包含人類和非人類部分的嵌合和人源化單克隆抗體，在本 發明的範閨之內.這種嵌合和人源化單克隆抗體可以通過本領域已知
的重組DNA技術產生，例如，使用以下描述的方法，Robinsonetal.國 際申請No.PCT/US86/02269; Akira， et al.歐洲專利申請184,187; Taniguchi， M.，歐洲專利申請171,496; Morrison et al.歐洲專利申請 173,494; Neuberger et al. PCT國際公開No.WO 86/01533; Cabilly et al. 美國專利No.4，816，567; Cabilly et al.歐洲專利申請125,023; Better et al. 5We"ce 240:1041-1043， 1988; Liu et al. iVoc. iVfl比爿ow/. t/5L4 84:3439-3443， 1987; Liu et al. / /附w"wo/. 139:3521-3526， 1987; Sim et al. iVoc.胸/. ]carf. 84:214-218， 1987; Nishimura et al. Omc.
47:999-1005， 1987; Wood et al. iVa似re 314:446-449， 1985;和Shaw et al. / Omcer Jto. 80:1553-1559， 1988) ; Moirison， S. L. 5V:iV髒 229:1202-1207， 1985; Oi et al. 5/orecA附《"es 4:214， 1986; Winter美國 專利No.5，225，539; Jones et al. Atore 321:552-525， 1986; Verhoeyan et al. 5We/ice 239:1534， 1988;和Beidler et al. / /m/mmo/. 141:4053-4060， 1988。
抗mNa4.3 a亞基抗體(例如，單克隆抗體)可用於通過標準技 術，例如親和層析或免測沉澱來分離11^34.3 0[亞基。抗mNavl,3a亞 基抗體可以便於來自細胞的天然mNav1.3 a亞基、和在宿主細胞中表達 的重組產生的mNavl.3a亞基的純化，此外，抗mNav1.3 a亞基抗體可 用於檢測mNavl,3a亞基蛋白(例如，在細胞的溶胞產物或細胞上清液 中)來評估mNav1.3 a亞基蛋白表達的豐度和模式.可以診斷性使用抗 mNav1.3 a亞基抗體來監視組織中的蛋白水平，作為臨床試驗過程的一 部分，例如，來確定給定治療方法的效力。可以通過將抗體聯結(即， 物理連接)到可檢測物質來便於檢測。可檢測物質的實例包括各種酶、 輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料和放射性物質。適合的酶 的實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶； 適合的輔基複合物的實例包括鏈黴抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋 白/生物素；適合的螢光材料的實例包括傘形稱、螢光素、異硫氰酸熒 光素、羅丹明、二氯三喙基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材 料的實例包括魯米諾；生物發光材料的實例包括螢光素酶、螢光素和 水母發光蛋白，適合的放射性物質的實例包括1251、 35S、或311.本發明的另一個方面涉及栽體，優選的表達栽體，含有編碼
mNavl,3a亞基蛋白的核酸(或其部分).如在此使用的，術語"栽體" 是指能夠轉運與之連接的另一個核酸的核酸分子. 一種類型的栽體是 "質粒"，是指在其中可以連接其他DNA片段的環狀雙鏈DNA環. 另一種類型的栽體是病毒栽體，其中其他的DNA片段可以連接到病毒 基因組中.某些栽體能夠在導入它們的宿主細胞中自主複製(例如， 具有細菌複製起點的細菌栽體和游離哺乳動物栽體).其他類型的栽 體(例如，非游離哺乳動物栽體)在導入宿主細胞中時被整合到宿主 細胞的基因組中，從而隨宿主基因組一起複製。此外，某些栽體能夠 指導與它們可操作連接的基因的表達.這種栽體在此稱為"表達栽 體". 一般地，在重組DNA技術中有實用性的表達栽體常常是質粒的 形式.在此，"質粒"和"栽體"可互換地使用，因為質粒是最常用 的載體形式。然而，本發明意圖包括其他形式的表達栽體，例如病毒 栽體(例如，複製缺陷性逆轉錄病毒、腺病毒和腺病毒相關病毒)， 其提供了等同的功能.
本發明的重組表達包含以適合於宿主細胞中核酸表達形式存在的 本發明的核酸，這意味著所述重組表達栽體包括一個或多個根據用於 表達的宿主細胞選擇的調節序列，所述調節序列要表達的核酸序列可 操作連接.在重組表達載體內，"可採作連接的"意指感興趣的核苷 酸序列以允許所述核苷酸序列表達的方式與調節序列連接(例如，在 體外轉錄/翻譯系統中，或當載體導入宿主細胞中時在宿主細胞中). 術語"調節序列"意圖包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(例 如，多聚腺苦酸信號)，例如，在Goeddel; Gene Expression Technology-Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 中描述了這種調節序列.調節序列包括在許多種類的宿主細胞中指導 核苷酸序列的組成型表達的那些，和僅在某些宿主細胞中指導核苷酸 序列表達的那些(例如，組織特異性調節序列).本領域技術人員要 理解的是，表達栽體的設計可以取決於一些因素，例如，要轉化的宿 主細胞的選擇、希望的蛋白表達水平，等等，本發明的表達栽體可以 被導入宿主細胞，從而生產由在此描述的核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如，mNavl,3 a亞基蛋白、mNav1.3 a亞基蛋白的突 變形式、融合蛋白，等等).
本發明的重組表達栽體可以被設計為在原核或真核細胞中表達 mNav1.3 a亞基蛋白.例如，mNav1.3 a亞基蛋白可以在細菌細胞例如 E,coli、昆蟲細胞(使用杆狀病毒表達栽體)、酵母細胞、兩棲動物細 胞或哺乳動物細胞中表達，在Goeddel， Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego， Calif. (1990) 中進一步討論了適合的宿主細胞.做為選擇，重組表達栽體可以體外 轉錄和翻譯，例如，使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶。
原核生物中的蛋白表達最常見地在帶有栽體的E.coli中進行，所 述栽體含有指導融合或非融合蛋白表達的組成型或可誘導啟動子.
例如，純化的融合蛋白可以用於mNav1.3 a亞基活性分析，(例 如，以下詳細描述的直接分析或竟爭性分析)，或用以產生特異於 mNav1.3 a亞基的抗體.
在另 一個實施方式中，mNav1.3 oi亞基表達栽體是酵母表達栽體. 用於在酵母S. cerivisae中表達的栽體的實例包括pY印Secl( Baldari， et al.， 1987， EMBO J. 6:229-234. )、pMFa( Kurjan and Herskowitz， Cell 30 : 933-943， 1982 ) 、 pJRY88 ( Schultz et al" Gene 54 : 113-123， 1987)、 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego， Calif.)和picZ (InVitrogen Corp， San Diego， Calif.)。
做為選擇，mNav1.3 a亞基蛋白可以使用杆狀病毒表達栽體在昆 蟲細胞中表達.可用於在培養的昆蟲細胞(例如，Sf9細胞)中表達蛋 白的杆狀病毒栽體包括pAc系列(Smith et al.似o/. CW/說W. 3:2156-2165， 1983)和pVL系列(Lucklow and Summers 170:31-39， 1989),
在又一個實施方式中，本發明的核酸使用哺乳動物表達栽體在哺 乳動物細胞中表達，哺乳動物表達栽體的實例包括pCDM8 (Seed, B. iVa似re 329:840， 1987 )和pMT2PC (Kaufman et al. 義6:187-195，
1987)。當在哺乳動物細胞中使用時，通常通過病毒調節元件來提供 表達栽體的控制功能.例如，常用的啟動子來源於多形瘤、腺病毒2、 巨細胞病毒和猿猴病毒40.關於原核和真核細胞的其他適合的表達系 統,參見Sambrook, J.， Fritsh， E. F.， and Maniatis, T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2nd， ed， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1989的第 16和17章.
在另一個實施方式中，重組哺乳動物表達栽體能夠指導核酸優先 地在特定細胞類型中表達(例如，使用組織特異性調節元件來表達核 酸).組織特異性調節元件是本領域已知的.適合的組織特異性啟動 子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝臟特異性；Pinkert et al, GWi" Z)ev. 1:268-277， 1987)、淋巴特異性啟動子(Calame and Eaton jrfv. /附附imo/. 43:235-275， 1988 )、特別是T細胞受體(Winoto and Baltimore / 8:729-733， 1989 )和免疫球蛋白(Banerji et al. CW/ 33:729-740， 1983; Queen and Baltimore CW/ 33:741-748， 1983 )的啟動子、神經元 特異性啟動子(例如，神經絲啟動子；Byrne and Ruddle
86:5473-5477， 1989)、鼓腺特異性啟動子(Edlund et al. 5Wewce 230:912-916， 1985)，和乳腺特異性啟動子(例如，乳清啟動 子；美國專利No.4，873，316和歐洲專利公開No.264，166).還包括發育 調節的啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel and Gruss iSWe"ce 249:374-379， 1990)和a-甲胎蛋白啟動子(Campes and Tilghman GWt^y Dev. 3:537-546， 1989 )
本發明進一步提供重組表達栽體，其包含以反義方向克隆到表達 栽體中的本發明的DNA分子.也就是說，DNA分子以一定方式與調 節序列可操作地連接，這種方式允許表達(通過DNA分子的轉錄)與 mNavl.3a亞基mRNA反義的RNA分子.可以選擇與按反義方向克隆 的核酸可操作連接的調節序列，其指導反義RNA分子在各種細胞類型 中的連續表達，例如，病毒啟動子或增強子，或可以選擇調節序列， 其指導反義RNA的組成型、組織特異性或細胞類型特異性表達.反義 表達栽體可以是重組質粒、噬菌粒或減毒病毒的形式，其中在高效率 調節區域的控制下產生反義核酸，其活性可通過其中導入了該栽體的 細胞類型來測定。對於使用反義基因調節基因表達的論述參見 Weintraub， H. et al" Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, 2>e/ /s i>t Gewd， Vol. 1 (1) 1986,
本發明的另一個方面涉及宿主細胞，在所述宿主細胞中導入了本 發明的核酸，例如，mNavl.3tt亞基mRNA或重組表達栽體，術語"宿主細胞"和"重組宿主細胞"在此可互換地使用.要理解的是，這種 術語不僅僅指特定的受試者細胞，還指這種細胞的子代或可能的子 代。由於突變或環境影響在繼承的一代中可能出現某些改變，實際上， 這種子代可能不與母細胞完全相同，但仍然包括在此處使用的該術語 的範閨內.
宿主細胞可以是任何原核或真核細胞，例如，mNav1.3 a亞基蛋 白可以在細菌細胞例如E. coli、昆蟲細胞、酵母細胞、非洲爪塘細胞 例如非洲爪蟾卵母細胞、或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞 (CHO )或COS細胞)中表達.其他適合的宿主細胞是本領域技術人 員已知的.
可以通過常規轉化或轉染技術將栽體DNA導入到原核或真核細 胞中.如在此使用的，術語"轉化"和"轉染"意指用於將外源核酸 (例如DNA)導入宿主細胞的各種本領域已知的技術，包括礴酸鈣或 氯化鉤共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染或電穿孔.可以在 Sambrook， et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd， ed， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1989)和其他實驗室手冊中找到轉化或轉染 宿主細胞的適合的方法。也可以通過顯微注射導入核酸，
對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知的是，取決於使用的表達栽 體和轉染技術，僅小部分細胞可能將外源DNA整合到它們的基因組 中.為了鑑定和選擇這些整合體， 一般與感興趣的基因一起將編碼選 擇性標記(例如，抗生素抗性)的基因導入宿主細胞.選擇性標記包 括賦予對藥物，例如G418、勻黴素和氨甲蝶呤的抗性的那些.編碼選 擇性標記的核酸可以在編碼mNav1.3 a亞基蛋白的相同栽體上導入宿 主細胞，或可以在獨立的栽體上導入.用導入的核酸穩定轉染的細胞 可以通過藥物選擇來鑑定(例如，摻入了選擇性標記基因的細胞將生 存，而其他細胞將死亡).
本發明的宿主細胞，例如培養物中的原核或真核宿主細胞，可被 用於產生(即，表達)mNavl,3a亞基蛋白，因此，本發明進一步提供 了使用本發明的宿主細胞生產mNavl.3 a亞基蛋白的方法.
本發明的核酸分子可以插入到栽體中，用作基因治療栽體.可以 通過，例如，靜脈內注射、局部施用(參見美國專利No.5，328，470)或通過立體策略(stereotactic)注射(參見，例如Chen et al. /Voc. iVii". y4cW5W. tASL4 91:3054-3057， 1994)，將基因治療栽體遞送給受試者。 基因治療栽體的藥物製劑可以包括處在可接受的稀釋劑中的基因治療 栽體，或可以包含基因遞送賦形劑包埋於其中的緩釋基質.做為選擇， 當可以從重組細胞完整地產生完整基因遞送栽體時，例如，逆病毒栽 體，藥物制刑可以包括產生該基因遞送系統的一個或多個細胞，
本*銀邦>^^弄才法
在此描述的核酸分子、蛋白、蛋白同源物和抗體可被用於一種或 多種以下方法a)篩選分析；b)預測性藥物(例如，診斷分析、預 後分析、監視臨床試驗和藥物遣傳學)；和c)治療方法(例如，治療 和預防).
本發明的分離的核酸分子能被用於，例如，表達mNa4.3ot亞基 蛋白(例如，在基因治療應用中通過在宿主細胞中的重組表達栽體)， 檢測mNav1.3 a亞基mRNA (例如，在生物樣品中)或編碼mNav1.3 a 亞基蛋白的基因中的遣傳改變，和調節mNavl,3a亞基活性，如以下進 一步描述的.mNavl,3a亞基蛋白可用於治療失調，所述失調以不足的 或過度的mNav1.3 a亞基底物產生或mNav1.3 a亞基抑制物產生為特 徵.此外，mNavL3a亞基蛋白可用於篩選天然發生的mNavl,3a亞基 底物，用於篩選調節mNa4.3a亞基活性的藥物或化合物，以及用於治 療失調，所述失調以不足的或過度的mNav1.3 a亞基蛋白產生或與 mNav1.3 a亞基野生型蛋白相比具有降低的或異常活性的mNav1.3 a亞 基蛋白的產生為特徵.此外，本發明的抗mNavl.3a亞基抗體可用於檢 測和分離mNav1.3 ot亞基蛋白以及調節mNav1.3 a亞基活性. ,這》、浙
本發明提供了鑑定與包含在此描述的mNav1.3 a亞基的Na+通道 結合的調節物，即候選或測試化合物或試劑(例如，蛋白、肽、擬肽、 類肽、小分子或其他藥物)的方法.這樣鑑定的化合物可以用於調節 這些Na+通道的活性，例如，在治療方案中.
在一個實施方式中，本發明提供了用於篩選作為Na+通道的底物 的測試化合物的分析，所述Na+通道包括在此描述的mNavL3a亞基或 所述亞基的生物學活性部分。在另一個實施方式中，本發明提供了用於篩選候選或測試化合物的分析，所述候選或測試化合物與這些Na+ 通道結合或調節它們的活性，
可以通過體內(例如，基於細胞和非細胞的)或體外方法鑑定離 子通道調節化合物，在一個實施方式中，離子流入分析被用於測量 8+ 通道活性.
測量離子通道活性的分析包括流量分析、膜片鉗電生理學和二電 極電壓鉗電生理學(參見，例如Lin etal"iVeM/wi 18:153-166， 1997). 膜片鉗生理學可以如下進行，簡要地，將含有小電極的吸管尖端壓到 細胞膜上以產生吸管和膜之間的緊密封閉(tightseal).電極俘獲流經 吸管尖端的邊緣劃定的膜的離子.可以採用各種結構來測量細胞內或 膜片內或整個細胞上的電流.
二電極電壓鉗(TEVC)生理學如下進行.簡要地，將兩個尖銳 的微電極壓穿細胞膜. 一個電極監視膜電位，另一個電極注入電流來 將膜電位保持在期望的水平.膜片鉗和TEVC技術都提供了關於離子 通道電流的動力學和強度的信息.
可以進行高通量電生理學，例如，如U.S. 6，268，168和U.S. 6，048，722中描述的，通過引用將它們的內容合併在此.
可以使用測量離子濃度變化的分析，例如，可以用可檢測的Na+ (例如，放射性標記的Na+)加栽測試系統。對Na+的檢測可以給出 Na+濃度變化的指標.在一個實施方式中，所述分析包括在對測試系統 (例如，細胞或封閉的膜製備物)施加電壓進行刺激之後檢測Na+.鈉 敏感性染料，例如鈉綠或冠紅，也可用於測量離子濃度的變化.
在一個實施方式中，使用非洲爪蟾卵母細胞系統分析Na+通道調 節.對於離子通道的短暫表達和來自非洲爪蟾卵母細胞的數據 (recording)的詳細說明,參見,例如Xu and Lipscombe， / iVeMmyc/, 21 (16) :5944-5951， 2001; Lin et al.，同上),在另一個實施方式中， 所述分析是基於哺乳動物細胞的分析，例如，使用人類或小鼠細胞。 通過轉染到不表達其他Na+通道的細胞類型中，可以獨立地研究特定的 Na+通道,例如mNav1.3 a亞基通道，
化合物
本發明的測試化合物可以單獨的獲得，或使用本領域已知的組合 庫方法中的許多手段的任何一種來獲得，包括生物學庫；類肽庫(具有肽的功能，但帶有新的對酶促降解有抗性但仍保持了生物活性的非
肽主幹的分子的庫；參見，例如，Zuckermann， R.N* WaA， / il/erf. C/ie附. 37:2678-85， 1994);空間可尋址的平行固相或液相庫；需要去褶合的 合成庫方法；"一個珠一個化合物"庫的方法；和利用親和層析選擇 的合成庫方法.生物學庫和類肽庫的方法限於肽庫，而其他四種方法 對肽、非肽寡聚物或化合物的小分子庫都是適合的(Lam，爿"Z/c朋cer /),"g/)d 12:145,1997).
用於分子庫合成的方法的實例可在本領域中找到，例如 DeWitt W u/" iVoc. iVa".爿carf. Sa: 90:6909， 1993; Erb W a/"
iVfl汰4cflw/. t/5^ 91:11422， 1994; Zuckermann Cflt/" / CAe抓 37:2678， 1994; Cho W a/" 5W潔e 261:1303， 1993., Carrell" fl/" CA隱/"A嵐五wg/, 33:2059， 1994j Carell" fl乙，Ot隱嵐嵐 33:2061， 1994;和Gallop W fl/" / 37:1233， 1994。
化合物的庫可以存在於溶液中(例如，Houghten，醜/o&cA/fi々"es 11:412-421， 1992 )、 或珠子上(Lam， A^"re 354:82-84， 1991)、晶片 上(Fodor， iVa似;^ 364:555-556， 1993 ) ， bacteria (Ladner， U.S. Patent No.5，223，409)、 孢子上(Ladner U.S. Patent No.S，223，409)，質粒上 (Cull W fl/"Wa"爿carf 5W (AS^ 89:1865-1869， 1992 )或嗛菌體上 (Scott and Smith, 249:386-390， 1990; Devlin， 5We髒
249:404-406， 1990; Cwirla W a/. Pwc. iVa".87:6378-6382， 1990; Felici，丄脅/.脅/. 222:301-310， 1991; Ladner訓戸.)。
用作測試化合物(即，可能的抑制物、拮抗刑、激動劑)的化學 化合物可以從商業來源獲得，或可以從易於獲得的起始材料使用本領 域技術人員已知的標準合成技術和方法來合成.通過在此描述的方法 鑑定的化合物的合成中有用的合成化學轉化和保護基團方法(保護和 解保護)是本領域已知的，包括，例如在R. Larock， Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989) ; T. W. Greene and P. G. M. Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd .ed.， John Wiley and Sons (1991) ; L. Fieser and M. Fieser， Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons ( 1994);和L Paquette， ed.， Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John. Wiley and Sons (1995)以及它們的後續版本中描述的那些.在一個方面，所述化合物是有機小分子，即，化合物具有小於1,000 amu的分子量，優選的在350-750 arau之間.在其他方面，所述化合物 是(i)非肽類的那些；(ii)具有1到5個之間，包括雜環基或雜芳 基環基團的那些，其可以進一步帶有取代基；(iii)處於各自的藥學上 可接受鹽的形式的那些；或(iv)肽類的那些.
術語"雜環基"是指非芳香族的3-8元的單環的、8-12元的二 環的、或11-14元的三環的環系統，如果為單環具有l-3個雜原子， 如果為二環具有1-6個雜原子，或如果為三環具有1-9個雜原子， 所述雜原子選自O、 N或S(例如，如果為單環、二環或三環，分別為 碳原子和N、 O或S的1-3、 1-6、或l-9個雜原子)，其中每個環 的0、 1、 2或3個原子可以被取代基取代.
術語"雜芳基"是指芳香族的5-8元的單環的、8-12元的二環 的、或11-14元的三環的環系統，如果為單環具有1-4個雜原子， 如果為二環具有1 _6個雜原子，或如果為三環具有1 — 9個雜原子， 所述雜原子選自O、 N或S(例如，如果為單環、二環或三環，分別為 碳原子和N、 O或S的1-4、 1-6、或l-9個雜原子)，其中每個環 的0、 1、 2、 3或4個原子可以被取代基取代.
術語"取代基"是指在烷基、環烷基、芳基、雜環基或雜芳基基 團上在基團的任何原子處被"取代"的基團.適合的取代基包括，無 限制地，烷基、烯基、炔基、烷氧基、面素、羥基、氰基、硝基、氨 基、S03H、全氟烷基、全氟烷氧基、亞甲二氧基、亞乙二氧基、羧基、 氧基、硫代、亞氨基(烷基、芳基、芳烷基)、S (O) n烷基(其中n 是0-2) 、 S (O) n芳基(其中n是0-2) 、 S (O) 雜芳基(其中n是 0-2) 、 S (O) 雜環基(其中n是0-2)、胺(單、二、烷基、環烷基、 芳烷基、雜芳烷基，和其組合)、酯(烷基、芳烷基、雜芳烷基)、 跣胺(單、二、烷基、芳烷基、雜芳烷基，和其組合)、磺胺(單、
二、烷基、芳烷基、雜芳烷基，和其組合)、未被取代的芳基、未被 取代的雜芳基、未被取代的雜環基、和未被取代的環烷基.在一個方 面，基團上的取代基獨立地是上述取代基的任一單個，或上述取代基 的任何子集，
在本發明預想的化合物中取代基和可變項的組合，僅是引起穩定 化合物形成的那些。如在此使用的，術語"穩定"是指化合物，其具有的穩定性足以允許製造，並且其維持化合物的完整性達到足夠時 間，對在此詳述的目的是有用的(例如，轉運、保存、分析、向受試 者治療性施用).
此處的化合物的藥學上可接受的鹽包括來源於藥學上可接受的無 機的和有機的酸和鹼的那些.適合的酸性鹽的實例包括醋酸鹽、己二 酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸
鹽、檸檬酸鹽、digluconate、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、羥乙 酸鹽、半硫酸鹽、heptanoate、已酸鹽、氫氯酸鹽、氬溴酸鹽、氫硤酸 鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、 硝酸鹽、palmoate、 pectinate、過硫酸鹽、辨酸鹽、苦酸鹽、特戊酸鹽、 丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、碗酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯 磺酸鹽和十一酸鹽。
在此描述化合物可以含有一個或多個不對稱中心，因而作為外消 旋物和外消旋混合物、單個對映異構體、單獨的非對應異構體和非對 映混合物存在.這些化合物的所有這樣的同分異構形式特意地包括在 本發明中.在此描述化合物也可以以互變異構形式存在，所有這些都 包括在此.化合物也可以以順式-或反式-或E-或Z-雙鍵同分異構形 式存在.這種化合物的所有這樣的同分異構形式特意地包括在本發明 中.
結合分析
還可以評估測試化合物與包含mNav1.3 ot亞基的Na+通道結合的 能力.雖然Na+通道結合不是通道調節活性的先決條件，結合Na+通道 的化合物在調節通道的活性方面可能是有用的。例如，通過將化合物 例如底物與放射性同位素或酶標記聯結，從而化合物例如底物與Na+ 通道的結合可以通過檢測複合物中的標記化合物例如底物來確定，可 以實現這一點.做為選擇，包含在此描述的mNav1.3 a亞基的Na+通道 可以與放射性同位素或酶標記聯結來監視測試化合物調節複合物的能 力。例如，可以用12SI、 3SS、 "C、或SH直接或間接地標記化合物，放 射性同位素可由放射的直接計數或閃爍計數來檢測.做為選擇，可以 用例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶來酶標記化合物，酶標 記可以通過檢測合適底物到產物的轉化來測定。
可以評估測試化合物與包含mNav1.3 a亞基的Na+通道相互作用的能力，或在沒有標記任何反應物的情況下評估.例如，在不標記化
合物或Na+通道的情況下可以使用微物理計(microphysiometer)來檢 測化合物與Na+通道的相互作用(McConneH， H. M. e, fl/" 5We"ce 257:1906-1912， 1992 ).如在此使用的，"微物理計"(例如，細胞傳 感器)是一種分析儀器，使用光可尋址的電勢傳感器(light-addressable potentiometricsensor, LAPS)測量細胞酸化其環境的速率，酸化速率 的變化可用作化合物和Na+通道之間的相互作用的指標.
在又一個實施方式中，提供了無細胞的分析，其中用測試化合物 接觸在此描述的Na+通道或其生物學活性部分，並評估測試化合物結合 所述通道或其生物學活性部分的能力.優選的，所述無細胞分析包含 膜，無細胞分析涉及製備目標基因蛋白和測試化合物的反應混合物， 在一定條件下並持續足夠的時間，以容許兩種成分相互作用和結合， 從而形成可以除去和/或檢測的複合物.
例如，也可以使用螢光能量轉移(FET)(參見，例如Lakowicz et al.，美國專利No.5，631，169; Stavrianopoulos et al.，美國專利 No.4，868，103)來檢測兩種分子之間的相互作用，選擇在第一個"供體" 分子上的螢光團標記，從而它發射的螢光能量被第二個"接受體"分 子上的螢光標記吸收，由於吸收的能量，其隨後能夠發出螢光，另一 方面，"供體"蛋白分子可能僅利用色氨酸殘基的天然螢光能量.選 擇發射不同的光波長的標記，從而"接受體"分子的標記可以與"供 體"的區別開來.由於在標記之間能量轉移的效率與分隔分子的距離 有關，可以評定分子之間的空間關係.當結合在分子之間發生的情況 下，在分析中"接受體"分子標記的螢光發射應是最大的。通過本領 域公知的標準螢光檢測手段(例如，使用螢光計)可以方便地測量FET 結合事件.
在另一個實施方式中，測定測試化合物結合在此描述的Na+通道 的能力可以使用實時生物分子互相作用分析(Biomoecular Interaction Analysis, BIA)來測定(參見，例如，Sjolander， S. and Urbaniczky， C.， J朋/. Of諷63:2338-2345， 1991; and Szabo e"/.， Cm/t. O/w". Ar"".
5:699-705， 1995 ),"表面胞質團共振(surface plasmon resonance)"或"BIA"實時地檢測生物特異性相互作用，而不用標 記任何反應物(例如，BIAcore).在結合表面處質量的改變(指示結合事件)引起接近該表面的光線的折射率改變(表面胞質團共振(SPR) 的光學現象)，產生可檢測信號，該信號可用作生物分子之間實時反 應的指示.
在一個實施方式中，包含Na+通道或測試化合物的樣品被錨定在 固相上.錨定在固相上的通道/測試化合物可以在反應結束進行檢測。
期望的是，固定Na+通道、抗Na+通道抗體或其靶分子，以便於從 一種或兩種蛋白的未複合形式中分離複合了的形式，以及便於適應分 析的自動化.在存在或不存在候選化合物的情況下，化合物與Na+通道 的結合，或Na+通道與靶分子的相互作用，可以在任何適於容納反應物 的容器中完成.這種容器的實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。 在一個實施方式中，可以提供融合蛋白，其添加了容許一種或兩種蛋 白與基質結合的結構域，例如，穀胱甘肽-S-轉移酶/mNa4.3 a亞基融 合蛋白或穀胱甘肽-S-轉移蘇/靶融合蛋白可以被吸附在穀胱甘肽瓊脂 糖珠(Sigma Chemical, St. Louis, MO)或穀胱甘肽衍化的微量滴定板 上，其然後與測試化合物或包含Na+通道的測試化合物和樣品化合，所 述Na+通道包含GST標記的亞基，並在有助於複合物形成的條件(例 如，鹽和pH值的生理條件)下孵化混合物.在觶化之後，洗滌珠子或 微量滴定板加樣孔以除去任何未結合的成分，對珠子的情況來說，例 如，如上所述直接或者間接地測定基質固定化的複合物，
將Na+通道亞基的複合物固定在基質上的其他技術包括使用生物 素和鏈黴抗生物素蛋白的接合.例如，生物素化的mNav1.3 a亞基蛋白 可以使用本領域已知4支術(例如，biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford， IL)從生物素-NHS (N-羥基-琥珀醯亞胺)製得，並固定在 鏈審抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)的加樣孔中。
為了進行分析，將非固定化的成分添加到含有錨定成分的包被的 表面，在反應完全後，在一定條件下除去未反應的成分(例如，通過 洗滌)，從而任何形成的複合物仍保持固定在固體表面上，可以用許 多途徑實現錨定在固體表面的複合物的檢測.當早先的非固定化成分 被預先標記時，檢測到表面上固定的標記指示了複合物形成。當早先 的非固定化成分沒有預先標記時，可使用間接標記來檢測錨定在表面 上的複合物；例如，使用特異於固定化成分的標記的抗體(該抗體隨 後可以用例如標記的抗Ig抗體直接標記或間接標記).在一個實施方式中，利用抗體進行這種分析，所述抗體與Na+通 道上的表位反應但是不幹擾所述通道與目標分子的結合.這種抗體可 以衍生化到平板的加樣孔，和未結合的靶點或通過抗體接合捕獲在加 樣孔中的Na+通道上.檢測這種複合物的方法，除了以上對於GST-固定化的複合物描述的之外，包括使用與Na+通道的成分有反應性的抗 體進行複合物的免疫檢測，以及依靠檢測與通道相關的酵活性的酶聯 分析.
做為選擇，可以在液相中進行無細胞的分析.在這種分析中，通 過許多標準技術的任何一種，包括但不限於差速離心(參見，例如 Rivas， G.， and Minton， A.P.， 7Vew必醜fOcAe附Sci' 18:284-7， 1993 );層對斤 (凝膠過濾層析、離子交換層析)；電泳和免測沉澱(參見，例如， Ausubel， F. ef flZ" eds, (1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: New York)，將反應產物從未反應的成分分離.這種樹脂和層 析技術是本領域技術人員已知的(參見，例如，Heegaard，N.H.，/Mo/ 及ecogm7 11:141-8， 1998; Hage， D.S.， and Tweed, S.A.， / CT^o/mitogr醜 5W j外，/. 699:499-525， 1997).進一步的，也可以方便地使用 如在此描述的螢光能量轉移來檢測結合而不需要進一步從溶液中純化 複合物，優選的，例如，通過包括膜成分或人工膜成分，無細胞分析 保持了 Na+通道複合物的結構，
在特定的實施方式中，所述分析包括使Na+通道或包含mNaY1.3 a 亞基的生物學活性部分的通道與結合所述通道的已知化合物接觸以形 成分析混合物，用測試化合物接觸分析混合物，並測定所述測試化合 物與Na+通道相互作用的能力，其中測定所述測試化合物與Na+通道相 互作用的能力包括，與已知化合物相比，測定所述測試化合物與Na+ 通道優先結合的能力，或調整通道活性的能力.
在此描述的Na+通道可以在體內與一種或多種細胞或細胞外大分 子，例如蛋白相互作用。為了這項論述，這種細胞和細胞外大分子在 此稱為"結合配偶體".破壞這種相互作用的化合物在調節目標基因 產物的活性方面可能是有用的.這種化合物可以包括，但不限於例如 抗體、肽和小分子的分子.
為了鑑定幹擾Na+通道與細胞外結合配偶體之間的相互作用的化 合物，製備含有目標基因產物和結合配偶體的反應混合物，在一定條件下並維持足夠的時間，以容許兩種產物形成複合物.為了測試抑制 試劑，在存在或不存在測試化合物的情況下提供反應混合物.測試化
合物可以最初就包括在反應混合物中，或可以在添加Na+通道和它的細 胞或細胞外結合配偶體之後一次添加.在沒有測試化合物或有安慰劑 的情況下辨化對照反應混合物.然後檢測在Na+通道和細胞或細胞外結 合配偶體之間任何複合物的形成.在對照反應中而不在含有測試化合 物的反應混合物中複合物的形成表示，該化合物幹擾了目標基因產物 和互相作用的結合配偶體之間的相互作用.另外，在含有測試化合物 和正常目標基因產物的反應混合物內的複合物形成，也可以與含有測 試化合物和包含一個或多個突變亞基的Na+通道的反應混合物內的復 合物形成進行比較.在希望鑑定破壞突變體而不是正常目標基罔產物 的相互作用的化合物的情況下，這種比較是很重要的.
這些分析可以以多相的或同相的形式進行.多相的分析包括將 Na+通道或結合配偶體錨定在固相上，並在反應結束時檢測錨定在固相 上的複合物.在同相的分析中，完整的反應在液相中進行，在任何一 種方法中，添加反應物的順序可以不同，以獲得關於被測化合物的不 同信息.例如，通過例如竟爭來幹擾目標基因產物和結合配偶體之間 的相互作用的測試化合物，可以通過在存在測試物質的情況下進行反 應來鑑定.做為選擇，破壞已形成的複合物的測試化合物，即，從復 合物中替換出成分之一、具有更高結合常數的化合物，可以通過在已 經形成複合物之後將測試化合物添加到反應混合物中來檢測。以下簡 述各種形式，
在多相分析系統中，目標基因產物或互相作用的細胞或細胞外結 合配偶體被錨定在固體表面(例如，微量滴定板)上，而非錨定種類 被直接或間接地標記.可以通過非共價的或共價的連接來固定化錨定 的種類.做為選擇，特異於被錨定種類的固定化抗體可用於將該種類 錨定到固體表面.
為了進行分析，固定化種類的配偶體被暴露於有或者沒有測試化 合物的包被的表面.在反應完全後，在一定條件下除去未反應的成分 (例如，通過洗滌)，任何形成的複合物仍保持固定在固體表面上. 當早先的非固定化種類被預先標記時，檢測到表面上固定的標記指示 了複合物形成.當早先的非固定化種類沒有預先標記時，可使用間接標記來檢測錨定在表面上的複合物；例如，使用特異於最初的非固定 化種類的標記的抗體(該抗體隨後可以用例如標記的抗Ig抗體直接標 記或間接標記).取決於添加反應成分的順序，可以檢測抑制複合物 形成的測試化合物或破壞已形成的複合物的化合物。
做為選擇，可以在存在或不存在測試化合物的情況下在液相中進 行反應，從未反應的成分分離反應產物，並檢測複合物；例如，使用 特異於結合成分之一的固定化抗體來鍩定溶液中形成的任何複合物， 和使用特異於另一個配偶體的標記的抗體來檢測錨定的複合物.再一 次，取決於向液相中添加反應物的順序，可以鑑定抑制複合物形成的 測試化合物或破壞已形成的複合物的化合物.
在本發明的可選實施方式中，可以使用同相的分析.例如，製備 目標基因產物和互相作用的細胞或細胞外結合配偶體產物的預先形成 的複合物，其中Na+通道亞基或它們的結合配偶體被標記，但是由標記 產生的信號由於複合物形成而淬滅(參見，例如，美國專利 No.4，109，496，其利用了這種方法進行免疫測定)，添加與之竟爭並從 預先形成的複合物替換出種類之一的測試物質，將引起高於背景的信 號的產生.這樣，可以鑑定破壞目標基因產物-結合配偶體相互作用 的測試物質，
在又一個方面，Na+通道蛋白或其片段可被用作雙雜交分析或三 雜交分析中的"誘餌蛋白"(參見，例如，美國專利No.5，283，317; Zervos W fl/" CW/ 72:223-232， 1993; Madura " a/" 脅/. C7^飢268:12046-12054， 1993; Bartel" a/"脅《ec/^一es 14:920-924， 1993j Iwabuchi" a/.， Owo^e"e 8:1693-1696， 1993;和Brent WO94/10300)來鑑定其他蛋 白，所述蛋白結合或與Na+通道蛋白相互作用("Na+通道結合蛋白" 或"Na+通道-bp")並涉及Na+通道活性.這種Na+通道-bp可能是Na+ 通道或Na+敏感性目標發送信號的活化物或抑制物。
雙雜交系統基於大多數轉錄因子的模塊特性，其由可分的DNA 結合和活化結構域組成。簡要地，該分析利用了兩種不同的DNA構建 體.在一個構建體中，編碼Na+通道a亞基蛋白或其片段(即，相應於 亞基的細胞外結構域的可溶部分)的基因被融合到編碼已知轉錄因子 (例如，GAL-4)的DNA結合結構域的基因.在另一個構建體中，來 自DNA序列庫、編碼未鑑別的蛋白("被捕物(prey)"或"樣品")的DNA序列被融合到編碼已知轉錄因子的活化結構域的基因。(做為 選擇，Na+通道亞基可以與活化結構域融合.)如果"誘斜"和"被捕 物"蛋白能夠在體內相互作用，形成Na+通道亞基依賴性複合物，轉錄 因子的DNA結合和活化結構域被帶至緊密鄰近.這種鄰近容許報告基 因(例如，lacZ)的轉錄，所述報告基因與對所述轉錄因子起反應的轉 錄調節位點可操作連接.可以檢測報告基因的表達，可以分離含有功 能性轉錄因子的細胞克隆，並用於獲得編碼與Na+通道亞基相互作用的 蛋白的基因.
在另一個實施方式中，鑑定Na+通道亞基表達的調節物.例如， 用候選化合物接觸細胞或無細胞混合物，相對於不存在該候選化合物 的情況下mNav1.3 a亞基mRNA或蛋白的表達水平，評估mNav1.3 a 亞基mRNA或蛋白的表達，當存在候選化合物的情況下mNav1.3 a亞 基mRNA或蛋白的表達大於不存在的情況時，該候選化合物被鑑定為 mNav1.3 a亞基mRNA或蛋白表達的刺激物.另外地，當存在候選化 合物的情況下mNav1.3 a亞基mRNA或蛋白的表達小於(統計學上顯 著的小於)不存在的情況時，該候選化合物被鑑定為mNav1.3 a亞基 mRNA或蛋白表達的抑制物.可以通過在此描述的用於檢測mNav1.3a 亞基mRNA或蛋白的方法來測定mNav1.3 a亞基mRNA或蛋白表達的 水平.
在另一個方面，本發明涉及在此描述的兩種或多種分析的組合， 例如，可以使用基於細胞的或無細胞的分析來鑑定調節試劑，試劑調 節Na+通道的能力可以在體內，例如，在動物體內證實，所述動物例如 疼痛失調的或與中風或外傷性腦損傷有關的失調的動物模型.
本發明進一步涉及通過上述篩選分析鑑定的新的試劑.因此，在 本發明的範圍內的是，進一步在合適的動物模型中使用如在此描述鑑 定的試劑(例如，mNavl.3a亞基通道調節試劑、相應於在此描述的一 種或多種Na+通道亞基的反義核酸分子、通道特異性抗體、或mNayl.3 a亞基通道結合配偶體)來確定用這種試劑治療的效力、毒性、副作用 或作用機制.此外，通過上述篩選分析鑑定的新的試劑可用於在此描 述的治療.
本發明的診斷和預後分析包括評定mNav1.3 a亞基的表達水平和 鑑定mNav1.3 a亞基分子的核苷酸或胺基酸序列中的變異和突變的方法.
表達監視和分布型.通過從測試受試者獲得生物樣品，用能夠檢
測inNav1.3 a亞基蛋白或編碼mNav1.3 a亞基蛋白的核酸(例如， mRNA、基因組DNA)的化合物或試劑接觸該生物樣品，從而在該生 物樣品中檢測所述蛋白或核酸的存在，可以評估在生物樣品中mNav1.3 a亞基蛋白或核酸的存在、水平或缺乏.術語"生物樣品"包括從受試 者分離的組織、細胞和生物學液體，以及存在於受試者體內的組織、 細胞和液體.優逸的生物樣品是腦組織.可以用許多方法測量mNav1.3 ot亞基基因的表達水平，包括但不限於測量mNa4,3a亞基基因編碼 的mRNA;測量mNavl.3 a亞基基因編碼的蛋白的數量；或測量mNavl.3 a亞基編碼的蛋白的活性.
在細胞中與mNav1.3 a亞基基因相應的mRNA的水平可以通過原 位的和通過體外的形式來測定.
分離的mRNA可被用於雜交或擴增分析，包括但不限於，Southern 或Northern分析、聚合酶鏈式反應分析和探針陣列.檢測mRNA水平 的一種診斷方法包括用能夠與要檢測的基因編碼的mRNA雜交的核酸 分子(探針)與分離的mRNA接觸.核酸探針可以是，例如，全長Na+ 通道a亞基核酸，例如在此描述的核酸或其部分，例如長度至少7、 15、 30、 50、 100、 250或500個核苷酸，並足以在嚴格條件下與Na+通道a 亞基mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸，所述探針可以布 置在陣列，例如以下所述陣列的地址上.在此描述了用於診斷分析的 其他適合的探針.
在一種形式中，mRNA (或cDNA)被固定在表面上並與探針接 觸，例如通過通過使分離的mRNA在瓊脂糖凝膠上跑動並將mRNA從 凝膠轉移到膜，例如硝化纖維上.在一種選擇性的形式中，探針被固 定在表面上，用探針接觸mRNA (或cDNA)，例如，在以下所述的 二維基因碎片陣列中，技術人員可以修改已知的mRNA檢測方法，用 於檢測mNav1.3 a亞基基因編碼的mRNA的水平.
樣品中由mNa4,3a亞基基因編碼的mRNA的水平可以用核酸擴 增，例如，通過rtPCR ( MuUis (1987)美國專利No.4，683，202)、連 接酶鏈式反應(Barany， /Voc. Wfl".爿carf. 5W. CASJ 88:189-193， 1991)、 自持的序列複製(Guatelli" a/.， /Voc. iVa". Jcarf. fAS/i 87:1874-1878，1990)、轉錄放大系統(Kwoh rt a/" iVoc. iVa". ^cflw/. Sd. tASJ 86:1173-1177， 1989) 、 Q-Beta複製酶(Lizardi W fl/"所0/recA朋/05y 6:1197,1988)、滾環複製(Uzardi e/fl/.， U.S. Patent No.5，854，033)或 任何其他核酸擴增方法，隨後使用本領域已知的技術檢測擴增的分子 來進行評估，如在此使用的，擴增引物被定義為核酸分子對，其可以 與基因的5，或3，區域退火(分別為正鏈和負鏈，或反之)並在中間含 有短的區域. 一般地，擴增引物的長度約10到30個核苷酸，側翼是 長度約50到200個核苷酸的區域.在適合的條件下使用適合的試劑， 這種引物允許擴增包含該引物的側翼核苷酸序列的核酸分子.
對於原位方法，可以製備/加工細胞或組織樣品並固定在支持物、 一般是玻璃栽片上，然後與能和要分析的mNav1.3 a亞基基因編碼的 mRNA雜交的探針接觸.
在另一個實施方式中，此處的方法進一步包括用能夠檢測 mNav1.3 a亞基mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸對照樣品， 然後比較對照樣品中mNavl,3 a亞基mRNA或基因組DNA的存在和測 試樣品中mNav1.3 a亞基mRNA或基因組DNA的存在.在再另一個實 施方式中，如美國專利No.5，695，937中描述的基因表達的系列分析被用 於檢測mNav1.3 a亞基轉錄產物水平.
可以使用各種方法來確定mNav1.3 a亞基基因編碼的蛋白的水 平. 一般地，這些方法包括用選擇性結合該蛋白的試劑，例如抗體與 樣品接觸，來評估樣品中的蛋白水平.在特定的實施方式中，所述抗 體帶有可檢測的標記.抗體可以是多克隆的，或更優選的，是單克隆 的.可以使用完整抗體或其片段(例如，Fab或F(ab')2).術語"標 記的"關於探針或抗體時，意圖包括通過將可檢測物質聯結(即，物 理地連接)到探針或抗體上直接標記探針或抗體，以及通過與可檢測 物質的反應性間接標記探針或抗體，在此提供了可檢測物質的實例。
所述檢測方法可以用於體外和體內檢測生物樣品中的mNav1.3 a 亞基蛋白。檢測蛋白的體外技術包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、 免測沉澱、免疫螢光、酶免疫測定(EIA)、放射性免疫測定(RIA)、 和Western blot分析.檢測蛋白的體內技術包括向受試者中導入標記 的抗mNav:L3a亞基抗體.例如，可以用放射性標記物標記抗體，在受 試者中放射性標記物的存在和位置可以通過標準成像技術來檢測.在另一個實施方式中，樣品被標記，例如，被生物素化，然後與抗體接
觸，例如，位於抗體陣列(如下所述)中的抗mNav:L3a亞基抗體。可 以用例如與螢光標記聯結的抗生物素蛋白檢測樣品.
在另 一個實施方式中，所述方法進一步包括用能夠檢測mNav1.3 a 亞基蛋白的化合物或試劑與對照樣品接觸，並比較對照樣品中蛋白的 存在和測試樣品中蛋白的存在.
本發明還包括用於檢測生物樣品中mNav1.3 a亞基蛋白的存在的 試劑盒.例如，所述試劑盒可以包括能夠檢測生物樣品中mNav1.3 a 亞基蛋白或mRNA的化合物或試劑；和標準.所述化合物或試劑可以 包裝在適合的容器中。所述試劑盒可以進一步包括使用該試劑盒檢測 mNavl,3a亞基蛋白或核酸的說明，
對於基於抗體的試劑盒，該試劑盒可以包括(l)與相應於本發 明的標記物的多肽結合的第一抗體(例如，附著於固相支持物)；和， 任選的，(2)結合所述多肽或所迷第一抗體、並與可檢測試劑連接的 第二種不同的抗體.
對於基於寡核苷酸的試劑盒，所述試劑盒可以包括U)寡核苷 酸，例如，可檢測地標記的寡核苷酸，其與編碼相應於本發明的標記 物的多肽的核苷酸序列雜交，或(2)對於擴增相應於本發明的標記物 的核酸分子有用的引物對。所述試劑盒還可以包括緩衝劑、防腐劑或 蛋白穩定劑.所述試劑盒還可以包括檢測所述可檢測試劑(例如，酶 或底物)所需的成分.所述試劑盒還可以含有對照樣品或一系列對照 樣品，其可以被分析並與所含的測試樣品比較.試劑盒的每種成分可 以封閉在單獨的容器內，所有各種容器可以在單個包裝內，伴有用於 解釋使用該試劑盒進行分析的結果的說明.
在此描述的診斷方法可以鑑定患有與Na+通道表達或活性有關的 疾病或失調、或有發展出所述疾病或失調的風險的受試者.如在此使 用的，術語"不需要的"包括在生物反應例如神經性疼痛中涉及的不 需要的現象。
在一個實施方式中，鑑定與Na+通道表達或活性有關的疾病或失 調.從受試者獲得測試樣品，評估一種或多種Na+通道蛋白或核酸(例 如，mRNA或基因組DNA)，其中Na+通道蛋白或核酸的水平，例如， 存在或不存在，是受試者患有與Na+通道表達或活性有關的疾病或失調、或有發展出所述疾病或失調的風險的診斷依據。如在此使用的， "測試樣品"是指從感興趣的受試者獲得的生物樣品，包括生物液體 (例如，血清)、細胞樣品、或組織，例如腦組織.
在此描述預後分析可用於確定受試者是否可以施用試劑(例如，
激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白、肽、核酸、小分子或其他藥物候
選者)來治療與mNav1.3 a亞基表達或活性有關的疾病或失調.例如， 這種方法可用於確定受試者是否可以用試劑有效地治療疼痛失調或外 傷性腦損傷.
在另一個方面，本發明表徵了具有大量數字編碼的數據記錄的計 算機媒介.每個數據記錄包括代表樣品中mNav1.3 a亞基通道的表達水 平或活性的值和對樣品的描述.對樣品的描述可以是樣品的標識符、 處理該樣品的化合物、得出該樣品的受試者(例如，患者)、診斷、 或治療(例如，優選的治療).在特定的實施方式中，所述數據記錄 進一步包括代表除mNavl,3a亞基通道以外的基因(例如，與失調相關 的其他基因，所述失調與mNa4,3a亞基通道的活性有關，或陣列上的 其他基因)的表達水平的值.所述數據記錄可以構造為表格，例如， 作為資料庫的部分的表格，所述資料庫例如關係資料庫(例如，Oracle 或Sybase資料庫環境中的SQL資料庫).
還表徵的是評估樣品的方法.所述方法包括提供樣品，例如來自 受試者的樣品，並測定該樣品的基因表達分布型，其中所述分布型包 括代表mNav1.3 a亞基通道表達或活性的水平的值，所述方法可進一步 包括與參考值或參考分布型比較所述值或所述分布型(即，多個值).
可以通過在此描述的任何方法獲得樣品的基因表達分布型(例如，通 過提供來自樣品的核酸並使核酸與陣列接觸，或通過分析樣品中 mNav1.3 a亞基通道的活性).所述方法可以用於診斷受試者中的失 調，其中mNav1.3 a亞基表達的變化是所述受試者患有或傾向於患有失 調的指示。所述方法可用於監視受試者中的治療，例如，疼痛的治療. 例如，可以確定來自經歷了治療的受試者的樣品的基因表達分布型. 所述分布型可以與參考分布型、或與從治療前或疾病發作前的受試者 獲得的分布型進行比較(參見，例如，Golub W "/ ， 5Wewce 286:531， 1999)
在又一個方面，本發明表徵了評估測試化合物的方法(也參見，上文的"篩選分析").所述方法包括提供細胞和測試化合物；用測 試化合物接觸細胞；獲得對於接觸的細胞的受試者表達分布型；和將 所述受試者表達分布型與 一個或多個參考分布型進行比較.所迷分布 型包括代表mNav1.3 a亞基活性或表達的水平的值.在特定的實施方式 中，將受試者活性或表達分布型與目標分布型比較，例如，標準細胞 的分布型或細胞的期望條件的分布型.扭比從未接觸的細胞獲得的表 達分布型，如果所述受試者表達分布型更類似於目標分布型，測試化 合物被好意地(favorably)評估.
在另一個方面，本發明表徵了評估受試者的方法.所述方法包括 a)從受試者獲得樣品，例如，從護理者獲得，例如，從受試者獲取樣 品的護理者；b)測定該樣品的受試者表達分布型.任選的，所述方法 進一步包括以下步驟之一或兩個c)將所述受試者表達分布型與一個 或多個參考表達分布型比較；和d)選擇與受試者參考分布型最相似的 參考分布型.受試者表達分布型和參考分布型包括代表mNav1.3 a亞基 活性或表達的水平的值.可以使用各種常規的統計度量來比較兩種參 考分布型. 一個可能的度規是作為兩種分布型之間的差異的距離向量 的長度.每個受試者和參考分布型被表示為多維的向量，其中每個維 度是分布型中的值。
所述方法可以進一步包括將結果傳送給護理者.所述結果可以是 受試者表達分布型、或受試者表達分布型與另一個分布型比較的結 果、或任何上述的描述.所述結果可以在計算機網絡上傳送，例如， 所述結果可以處於計算機傳輸的形式，例如，嵌入在栽波中的計算機 數據信號.
還表徵的是具有可執行代碼的計算機媒介，所述可執行代碼實現 以下步驟接收受試者表達分布型(例如，在此描述的任何受試者表 達分布型)；訪問參考表達分布型的資料庫；和i)選擇最相似於所述 受試者表達分布型的匹配參考分布型，或ii)為所述受試者表達分布型 與至少一個參考分布型的相似性確定至少一個比較分值。受試者表達 分布型和參考表達分布型各自包括包括代表mNav1.3 a亞基活性或表 達的水平的值。
陣列和其用途
在另一個方面，本發明表徵了包括具有多個地址的底物的陣列。所述多個地址(plurality)的至少一個地址包括俘獲探針，所述俘獲探 針特異性地結合相應於Na+通道a亞基的分子，例如mNavl,3 ot亞基 核酸或多肽，所述陣列可以具有至少10、 100、 l，OOO或10,000或更多 個地址/ 112的密度，並在這之間變動.所述底物可以是二維的底物， 例如玻璃栽片、薄片(例如，矽質或塑料的)、質譜平板，或是三維 底物例如凝膠墊.除了多個地址以外的地址可以布置在陣列上.
在特定的實施方式中，多個地址的至少一個地址包括核酸俘獲探 針，所述核酸俘獲探針與mNav1.3 oc亞基核酸，例如正義或反義鏈特 異性雜交.多個地址的地址子集可以是編碼mNav1.3 a亞基的Na+通 道基因的核酸俘獲探針.子集的每個地址包括與mNav1.3 oc亞基核酸 的不同區域雜交的俘獲探針。所述陣列可用於通過雜交來給基因測序 (參見，例如，美國專利No.5，695，940),
可以通過各種方法產生陣列，例如，通過光刻法(參見，例如， 美國專利Nos. 5,143,854; 5,510,270;和5，527，681)、機械方法(例如， 如美國專利No.5，384，261中描述的導向流動方法)、基於針的方法(例 如，如美國專利No.5，288，514描述的)，和基於珠子的技術(例如，在 PCT US/93/04145中描述的).
在另一個實施方式中，多個地址的至少一個地址包括多肽俘獲探 針，所述多肽俘獲探針與mNa4.3 a亞基多肽或其片段特異性結合。 所述多肽可以是mNav1.3 ot亞基多肽的天然發生的相互作用配偶體. 優選的，所述多肽是抗體，例如在此描述的抗體(參見"抗niNav1.3 cx 亞基抗體")，例如單克隆抗體或單鏈抗體.
在另一個方面，本發明表徵了分析mNa4.3 a亞基表達的方法. 所述方法包括提供如上所述的陣列；用樣品接觸所述陣列，並檢測 mNav1.3 a亞基分子(例如，核酸或多肽)與所述陣列的結合.任選 的所述方法進一步包括在與所述陣列接觸之前或期間從樣品擴增核 酸.
在另一個實施方式中，所述陣列可用於分析組織中的基因表達以 確定在所述陣列中基因的組織專一性，特別是mNav1.3 a亞基的表 達.如果分析了足夠數量的各種樣品，群集(clustering)(例如，分 級群集、k-means群集、Bayesian群集等等)可被用於鑑定與mNavl.3 a亞基共調節的基因.例如，所述可用於多個基因的表達的定量。因而，不僅是組織專一性，而且組織中基因套組(battery of genes)的表 達水平也被確定.定量數據可根據它們本身的組織表達和在該組織中 的表達水平用於給基因分組(例如，分群).
例如，基因表達的陣列分析可以用於評定細胞-細胞相互作用對 mNav1.3 ot亞基表達的影響.可以擾動笫一組織，可以分析來自笫二 組織、與笫一組織相互作用的核酸.關於這一點，可以測定響應於生
物學刺激一種細胞類型對另一種細胞類型的影響，例如，來監視細胞-細胞相互作用在基因表達水平的影響.
在另一個實施方式中，細胞與治療劑接觸，使用陣列測定細胞的 表達分布型，將該表達分布型與未與所述試刑接觸的類似細胞的分布 型進行比較.例如，所述分析可用於確定或分析治療試劑的不需要的 影響的分子基礎.如果治療性施用試劑來治療一種細胞類型，但對另 一種細胞類型具有不需要的影響，本發明提供了一種分析來確定這種 不需要的影響的分子基礎，因而提供了共施用抵抗試刑或治療不需要 的影響的機會。類似地，即使在單個細胞類型中，可以在分子水平測 定不需要的生物學影響.因而，可以確定和抵消試劑對目標基因以外 的基因的表達的影響.
在另 一 個實施方式中，所述陣列可以用於監視在陣列中與時間有 關的一個或多個基因的表達。例如，從不同時點獲得的樣品可以用所 述陣列探察。這種分析可以鑑定和/或表徵與Na+通道活性有關的疾病 或失調的發展.這種方法也可以評估Na+通道相關疾病或失調的治療和 /或發展，
這種陣列對於確定一個或多個基因在正常和異常的細胞中的差別
表達模式也是有用的.這提供了可以充當診斷或治療介入的分子靶點 的基因的套組(例如，包括編碼mNav1.3 a亞基的基因).
在另一個方面，本發明表徵了包括具有多個地址的陣列.多個地 址的每一個地址包括獨特的多肽.多個地址的至少一個地址之上已經 布置了 mNav1.3 a亞基多肽或其片段。本領域描述了產生多肽陣列的 方法，例如在De Wildt" a/" 7Vfl似re醜/Wed 18: 989-994， 2000; Lueking W a/" ^iwfl/.醜,oc/^肌270:103-111， 1999; Ge， H.， A^iic/e/c 28:e3， I-VII， 2000; MacBeath， G.， and Schreiber， S丄.，5W潔e 289:1760-1763， 2000;和WO 99/51773A1中.在特定實施方式中，多個地址的每一個地址在其上已經布置了至少60%-99%相同於mNav1.3 ot亞基多肽或其片段的多肽，例如，mNav1.3 a亞基多肽的多種變體 (例如，等位變體編碼的、針對位點的突變體、隨機的突變體或組合 突變體)可被置於多個地址的單個地址上.
多肽陣列可用於檢測Na+結合化合物，例如，在來自受試者的樣 品中與mNav1.3 a亞基多肽有特異性的抗體，或檢測Na+通道結合蛋白 或配體的存在.
在另一個方面，本發明表徵了分析多種探針的方法.例如，對於 分析基因表達，所述方法是有用的.所述方法包括提供具有多個地 址的二維陣列，多個地址的每一個在位置上可以相互區分，多個地址 具有獨特的俘獲探針，例如，其中所述俘獲探針來自表達包含mNa4.3 a亞基的Na+通道的細胞或受試者，或來自在其中已經引發了 Na+通道 介導的反應的細胞或受試者，例如，通過用Na+通道mNav1.3 a亞基核 酸或蛋白接觸所述細胞，或向所述細胞或受試者施用Na+通道mNa4.3 a亞基核酸或蛋白；提供具有多個地址的二維陣列，多個地址的每一個 在位置上可以相互區分，多個地址具有獨特的俘獲探針，例如，其中 所述俘獲探針來自不表達Na+通道mNavl.3 a亞基s (或不象俘獲探針 的Na+通道mNavl.3a亞基陽性多個地址的情況下表達那麼高)的細胞 或受試者，或來自其中沒有引發了 Na+通道介導的反應的細胞或受試者 (或比笫一樣品引發了較小的程度)；用一個或多個查詢探針與陣列 接觸，(其優選的不同於Na+通道mNa4.3a亞基核酸、多肽或抗體)， 從而評估多個俘獲探針.結合，例如，對於核酸來說，在多個地址的 地址上與俘獲探針的雜交，通過例如附著於核酸、多肽或抗體的標記
產生的信號來檢測.
在另一個方面，本發明表徵了分析mNavl,:Ja亞基的方法，例如， 分析結構、功能、或與其他核酸或胺基酸序列的關係.所述方法包括 提供mNav1.3 a亞基核酸或胺基酸序列；將該序列與來自序列集合的一 個或多個，優選的多個序列進行比較，所述序列集合例如，核酸或蛋 白序列資料庫；從而來分析mNa4,3a亞基亞基.
麵俯
在此鑑定的cDNA序列的部分或片段(和相應的完整基因序列)可以在多種方面用作多核苷酸試劑.
例如，多核苷酸試劑可用於診斷分析、預後分析，監視臨床試驗 被用於預後(預測)目的從而來預防性地治療個體.因此，本發明的 一個方面涉及確定在生物樣品(例如，血液、血清、細胞、組織)的
環境中inNav1.3 a亞基蛋白和/或核酸表達以及mNav1.3 a亞基活性的 診斷分析，從而來確定個體是否患有疾病或失調，或存在發展出失調 的風險，所述疾病或失調與異常的或不需要的mNav1.3 a亞基表達或活 性有關.本發明還提供了預後(或預測)分析，用於確定個體是否存 在發展出與mNav1.3 a亞基蛋白、核酸表達或活性有關的失調的風險. 例如，可以分析生物樣品中編碼mNav:L3a亞基的基因中的突變，並用 於預後或預測目的.
本發明的另一個方面涉及監視試劑(例如，藥物、化合物)對體 內mNavl.3a亞基的表達或活性的影響.
監視試劑(例如，藥物)對mNavl.3 a亞基蛋白的表達或活性的 影響(例如，調節膜興奮性)不僅可應用於基礎藥物篩選，還可應用 於臨床試驗.例如，通過在此描述的篩選分析確定的試劑提高mNav1.3 a亞基基因表達、蛋白水平或上調mNavl.;3a亞基活性的有效性，可以 在對展現出降低或升高的mNav1.3 a亞基基因表達、蛋白水平，下調 mNavl.3 a亞基的受試者的臨床試驗中監視.與例如Na+通道相關的失 調有關的其他基因可用作特定細胞的表型的標記。
本發明的另一個方面涉及為了治療目的調節mNav1.3 a亞基表達 或活性的方法.因此，在示範性的實施方式中，本發明的調節方法包 括用mNav1.3 a亞基或試劑接觸細胞，所述試劑調節與細胞相關的 mNavl.3a亞基蛋白活性的一種或多種活性。調節mNa4.3a亞基蛋白 活性的試劑可以是在此描述的試劑，例如核酸或蛋白、mNav:L3a亞基 蛋白的天然發生的靶分子(例如，mNav1.3 a亞基底物)、mNav1.3 a 亞基抗體、mNav1.3 a亞基激動劑或拮抗劑、mNav1.3 a亞基激動劑或 拮抗劑的肽模擬物、或其他小分子.在一個實施方式中，所述試劑刺 激一種或多種mNav1.3 a亞基活性.這種刺激試劑的實例包括活性 mNav1.3 a亞基蛋白和已經被導入細胞、編碼mNav1.3 a亞基的核酸分子.在另一個實施方式中，所述試劑抑制一種或多種mNavl.3ot亞基活 性.這種抑制試刑的實例包括反義mNav1.3 a亞基核酸分子、抗mNav1.3 a亞基抗體和mNav1.3 ot亞基抑制物.這些調節方法可以在體外進賴例 如，通過培養細胞和所述試劑)，或作為選擇，在體內進行(例如， 通過向受試者施用所述試劑)。因而，本發明提供治療患有疾病或失 調的個體的方法，所述疾病或失調以mNav1.3 a亞基蛋白或核酸分子的 異常或不需要的表達或活性為特徵.在一個實施方式中，所述方法包 括施用試刑(例如，通過在此描述的篩選分析鑑定的試劑)、或調節 (例如，上調或下調)mNa4.3a亞基表達或活性的試劑的組合，在另 一個實施方式中，所述方法包括施用mNav1.3 a亞基蛋白或核酸分子作 為治療來補償降低的或異常的mNav1.3 a亞基表達或活性.
在mNav1.3 a亞基被異常地下調和/或在提高mNav1.3 a亞基活性 可能具有有益效果的情況下，剌激inNavlJa亞基活性是可取的。活性 的拮抗也可能是可取的.例如，對於疼痛，例如神經性疼痛、頭部外 傷和神經變性疾病的治療，調節物是可取的.神經變性疾病包括多發 性硬化、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、或其他形式的痴呆、肌萎縮 性側索硬化、Down's綜合症、Huntington舞蹈病和脊小腦變性'例如，
在治療伴隨著包括大腦出血的腦血管損傷或外傷的各種失調，所述大 腦出血例如高血壓腦內出血和蛛網膜下出血，短暫的腦缺血反應發 作，腦動脈硬化和它們的後遣症，以及心動停止後恢復時的腦損傷、 腦手術之前或之後的腦功能障礙、由於氧不足、低血糖、腦或脊損傷、 藥物或氣體中毒、糖尿病、抗癌試劑的施用、酒精等等造成的神經系 統的失調方面，調節NavL3通道可能是有用的.
秀炎逸合炎
如在此使用的，本發明的化合物，例如，通過在此描述的方法鑑 定的Na+通道調節物，被定義為包括其藥學上可接受的衍生物或前體藥 物。"藥學上可接受的衍生物或前體藥物"是指本發明的化合物的任何 藥學上可接受的鹽、酯、酯鹽或其他衍生物，在向受試者施用時能夠 提供(直接地或間接地)本發明的化合物.特別有利的衍生物和前體 藥物是，當將這種化合物施用給哺乳動物時提高本發明的化合物的生 物利用率的那些(例如，通過容許口服施用的化合物被更容易地吸收到血液中)，或相對於親本種類能增強親本化合物向生物代謝區(例 如，腦或淋巴系統)的遞送的那些.前體藥物包括衍生物，其中增強 水溶性或穿腸膜主動轉運的基團被附加到在此描述的化學式的結構 上.
本發明的化合物可以通過附加合適的功能進行修改來增強選定的 生物學性質。這種修改是本領域已知的，包括提高對給定生物代謝區 (例如，血液、淋巴系統、中樞神經系統)的生物學穿透性、提高口 服利用率、提高溶解性以容許通過注射施用、改變新陳代謝和改變排 出速率的那些修改.
本發明的化合物的藥學上可接受的鹽包括來源於藥學上可接受的 無機的和有機的酸和鹼的那些.適合的酸性鹽的實例包括醋酸鹽、己 二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁
酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、digluconate、十二烷基硫酸 鹽、乙烷碌酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、glucoheptanoate、羥乙酸鹽、 半硫酸鹽、heptanoate、已酸鹽、氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸 鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、palmoate、 pectinate、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、 碑酸鹽、苦酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、 酒石酸鹽、硫氛酸鹽、甲苯磺酸鹽和imdecanoate.其他酸，例如草酸， 雖然本身不是藥學上可接受的，可以用於鹽的製備，所述鹽作為中間 物在獲得本發明的化合物和它們藥學上可接受的加酸鹽方面是有用 的.來源於合適的鹼的鹽包括鹼金屬鹽(例如，鈉)、鹼土金屬(鹽 例如，鎂)、銨鹽和N-(烷基)4+鹽.本發明還預想了在此公開的化 合物的含鹼性氮基團的季銨反應.通過這種季銨反應可以獲得水溶或 油溶或可分散的產物.此處任何化學式的化合物的鹽形式可以是羧基 的胺基酸鹽(例如，L-精氨酸鹽、L-賴氨酸鹽、L-組氨酸鹽).
在此描述的化學式的化合物可以，例如，通過靜脈內、動脈內、 真皮下、腹膜內、肌內內或皮下注射；或口頭地、口腔地、鼻地、穿 黏膜地、表面地、以眼用製品的形式，或通過吸入，劑量範圍約0.5到 約100 mg/kg體重，做為選擇的劑量在1 mg和1000 mg/劑之間，每4 到120小時，或根據特定藥物的要求來施用。此處的方法考慮施用有 效量的化合物或化合物組合物來實現期望的或聲明的效果. 一般地，本發明的藥物組合物每天約1次到約6次地施用，或作為選擇，作為 連續輸注來施用.這種施用可以用作慢性的或急性的治療。與栽體物 質組合產生單個劑量形式的活性成分的數量可以取決於治療的宿主和 施用的特定模式而變化。典型的製品將含有約5%到約95%的活性化 合物(w/w).做為選擇，這種製備含有約20%到約80%的活性化合 物.
比以上敘述的更低或更高的劑量可能是所需的.對於任何特定患 者的特定劑量和治療服法取決於各種因素，包括採用的特定化合物的 活性、年齡、體重、 一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、排出速 率、藥物組合、疾病、狀況或症狀的嚴重程度和病程、疾病、狀況或 症狀的患者分布、和治療醫師的判斷.
在改善患者狀況時，如果必要，可以施用維持劑量的本發明的化 合物、組合物、或組合.隨後，當症狀被減輕到期望的水平時，施用 的劑量或頻率、或這兩者，可以作為症狀的函數被降低到維持改善的 狀況的水平.然而，根據疾病症狀的任何復發，患者可能需要長期的 間歇性治療.
在此描繪的組合物包括有效實現調節疾病或疾病症狀的數量的此 處描繪的化學式的化合物，以及如果存在的話其他的治療試劑，所述 疾病或疾病症狀包括離子通道介導的失調或其症狀，
術語"藥學上可接受的栽體或佐劑"是指可以與本發明的化合物 一同施用給患者的栽體或佐劑，當以足夠遞送治療數量的所述化合物 的劑量施用時，不破壞其藥理學活性並且是無毒的，
可用於本發明的藥物組合物的藥學上可接受的栽體、佐劑和賦形 劑包括但不限於，離子交換刑、礬土、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥 物遞送系統(SEDDS)例如d-a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽、用於 藥物劑型的表面活性劑例如Tweens或其他類似的聚合遞送基質、血清 蛋白例如人血清白蛋白、緩衝劑例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨 酸鍾、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質，例如硫 酸魚精蛋白、褲酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、矽膠、三矽酸 鎂、聚乙烯基吡咯烷稱、基於纖維素的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維 素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧化丙烯-塊多聚體、聚乙二醇和羊 毛脂。環糊精例如a-、 P-和Y-環糊精，或化學上修飾的衍生物例如羥基烷基環糊精，包括2-和3-羥基丙基-P-環糊精，或其他增溶的衍生 物，也可以有利地用於增強在此描述的化學式的化合物的遞送.
本發明的藥物組合物可以口頭地、胃腸外地、通過吸入噴霧、表 面地、直腸地、鼻地、口腔地、陰道地、或通過植入的儲庫來施用， 優選的通過口服施用或通過注射施用.本發明的藥物組合物要是可以 含有任何常規的無毒的藥學上可接受的栽體、佐劑或賦形劑.在某些 情況下，可以用藥學上可接受的酸、鹼或緩衝液調節製劑的pH值，來 增加配製的化合物或它的遞送形式的穩定性.如在此使用的術語胃腸 外的包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、 胸骨內、鞘內、病灶內和顱內的注射或輸注技術.
所述藥物組合物可以是無菌可注射製品的形式，例如，為無菌可 注射的水性或油性懸浮液.這些懸浮液可以根據本領域已知的技術使 用適合的分散刑或潤溼劑(例如，Tween糾)和懸浮刑來配製，無菌 可注射製劑也可以是處於無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑，例 如，1,3-丁二醇溶液中的無菌可注射溶液或懸浮液。在可接受的賦形劑 和溶劑之中，可以使用的有甘露醇、水、Ringer，s溶液和等滲氯化鈉溶 液.此外，無菌的不揮發性油通常用作溶劑或懸浮介質.為此，可以 使用任何溫和的不揮發性油，包括合成的單甘油醋或二甘油酯。脂肪 酸，例如油酸和它的甘油酯衍生物在注射劑的製備中是有用的，天然 的藥學上可接受的油，例如橄欖油或蓖麻油，特別是它們的聚氧乙撐
化型式也是一樣.這些油溶液或懸浮液也可以含有長鏈的醇稀釋劑或 分散劑，或羧甲基纖維素或類似的分散劑，它們通常用於藥學上可接 受的劑型例如乳劑和或懸浮液的配製，通常用於藥學上可接受的固 體、液體或其他劑型的製造的其他常用的表面活性劑，例如Tweens或 Spans其他類似的乳化劑或生物利用率增強劑，也可以用於製劑目的.
本發明的藥物組合物可以以任何口服可接受的劑型，包括但不限 於，膠囊劑、片劑、乳劑和水懸浮液、分散體和溶液來口頭地施用， 對於口服用途的片劑來說，常用的栽體包括乳糖和玉米澱粉。 一般也 添加潤滑劑，例如硬脂酸鎂.對於以膠嚢劑形式口服施用，有用的稀 釋劑包括乳糖和乾燥的玉米澱粉.當口頭地施用水性懸浮液和/或乳劑 時，活性成分可以懸浮於或溶於油相，與乳化劑和/或懸浮劑組合，如 果需要，可以添加某些甜味劑和/或調味劑和/或著色劑.本發明的藥物組合物也可以以用於直腸施用的栓劑形式來施用. 可以通過將本發明的化合物與適合的無刺激性賦形劑混合來製備，所 迷賦形劑在室溫下是固體但在直腸溫度下是液體，因而將在直腸中融 化釋放活性組分.這種材料包括，但不限於，可可脂、蜂蠟和聚乙二 醇.
當希望的治療涉及通過表面施用容易達到的區域或器官時，本發 明的藥物組合物的表面施用是有用的.對於向皮膚的表面應用，藥物 組合物應配製為含有懸浮於或溶於栽體的活性組分的適合的軟骨劑. 用於表面施用本發明的化合物的栽體包括但不限於，礦物油、液體石 油、白石油、丙二醇、聚氣乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水.做為 選擇，藥物組合物可配製為適合的洗液或乳奮劑，其含有懸浮於或溶 於栽體的活性化合物，所述栽體有適合的乳化劑.適合的栽體包括但
不限於，礦物油、單硬脂酸山梨糖醇酐酯、聚山梨酸酯60、十六烷基 酯蠟、cetearyl alcohol、 2-辛基十二醇、苯甲醇和水，本發明的藥物組
低位腸i.表面地穿表皮貼片也包括在本發明中. -
本發明的藥物組合物可以通過真氣霧劑或吸入來施用。根據藥物 製劑領域公知的技術來製備這種組合物，可以製備為鹽水的溶液，採 用苯甲醇或其他適合的防腐劑，採用吸收促進劑來增強生物利用率， 和/或本領域已知的其他增溶劑或分散刑。
具有此處的化學式的化合物和其他試劑的組合物(例如，治療試 劑)可以使用可植入裝置來施用.可植入裝置和相關的技術是本領域 已知的，當希望連續的或定時釋放來遞送在此描繪的化合物或組合物 時作為遞送系統是有用的.另外，可植入裝置遞送系統對於靶向化合 物或組合物遞送的特定位點(例如，局部位置、器官)是有用的。Negrin et al" Biomaterials， 22 (6) :563 (2001 )。包括可選擇性的遞送方法的 定時釋放技術也可用於本發明.例如，基於多聚體技術、持續釋放技 術和密封技術的定時釋放製劑(例如，聚合物、脂質體)也可用於遞 送在此描繪的化合物和組合物。
還處在本發明的範閨內的是遞送此處的活性化學治療組合物的貼 片.貼片包括材料層(例如，聚合物、布、紗布、繃帶)和如在此描 繪的此處的化學式的化合物.材料層的一面可以具有附著於其上的保護層來抵抗化合物或組合物的通過，貼片可以另外包括粘附劑來將貼 片保持在受試者上.粘附劑是一種組合物，包括天然或合成來源的那 些，當與受試者的皮膚接觸時，暫時地附著到皮膚上.其可以是抗水 的。粘附劑可以置於貼片上，以保持貼片與受試者的皮膚接觸持續一 延長的時間。所述粘附劑被製成具有一定膠粘性或粘附強度，從而它 將裝置保持在進行了偶然接觸的部位，然而，在一定的積極行為時(例 如，撕、剝、或其他有意的去除)，所述粘附劑給施於該裝置或粘附劑 本身的外部壓力讓路，並允許粘附接觸的解除.粘附劑可以是壓力敏 感的，也就是說，這可以容許通過對粘附劑或裝置施加壓力(例如， 按、擦)將粘附劑(和要附著於皮膚的裝置)置於皮膚上.
當本發明的組合物包含在此描述的化學式的化合物和一種或多種 其他治療或預防試劑的組合時，所述化合物和所述其他試劑都應以約1
到100%的劑量水平存在，更優選的為單治療(monotherapy)服法中 通常施用的劑量的約5到95%之間.所述其他試劑可以獨立於本發明 的化合物作為多次劑量服法的部分來施用.做為選擇，這些試劑可以 是單個劑型的部分，在單個組合物中與本發明的化合物混合在一起。 以上描述的化合物和方法可以用於治療性調節Na+通道功能。 通過以下非限制性實施例進一步描述本發明的特定實施方式
實施例1:新的Na+通道a亞基的鑑定
1. 首先，4吏用用於RT-PCR的Superscript First-Strand Synthesis System (InVitrogen )從小鼠腦polyA RNA ( Stratagene and Clontech) 產生cDNA.設計引物用於擴增小鼠Navl,:3a亞基.相應於小鼠Na4.3 a亞基的部分序列的cDNA (GenBank Acc. No.NM_018732 )與公開 的大鼠cDNA序列的中部(NM—013119;從起始密碼子開始的核苷酸 2461 )進行比對.為了鑑定小鼠Nav1.3 a亞基的全長序列，使用BLAST
(Blake JA， et al. MGD: The Mouse Genome Database.池c/e/c J"Vfc 及es31: 193-195, 2003)將大鼠序列(NM_013199)與小鼠基因組進行 比較.
2. 設計5，引物與推定的起始密碼子上遊的7個核苷酸退火，設計3，引 物與推定的終止密碼子下遊的124個核苷酸退火.每個引物在末端含有NotI限制性位點。設計引物與非翻譯區退火.與非翻譯區退火的引 物較少可能擴增非Navl,3a亞基基因，即，小鼠Navl.l和Nav1.2 a亞 基基因.用於擴增mNav1.3的3，引物被設計為與相應於大鼠Navl.l、 Nav1.2和Nav1.3 a亞基3，非翻譯區之間的高變區域的非翻譯區退火， 來提高對mNav1.3的特異性.在大鼠Navl a亞基基因中的這個區域中， 大鼠Na4.1在32個核苷酸中有17個與大鼠Na4.2不同，大鼠Navl.2 在32個核苷酸中有13個與大鼠Na丄3不同.這個翻譯區在大鼠和小 鼠序列之間還具有高度的同源性；32個核苷酸中的僅29個是保守的.
3. 使用Herculase Hotstart DNA聚合酶(Stratagene; 30循環)從小 鼠腦cDNA擴增出編碼小鼠Nav1.3 a亞基的小鼠Navl.3 a亞基cDNA 的克隆.通過瓊脂糖凝膠電泳分辨PCR產物，使用Qiaquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen )從凝膠中提取RCP產物.使用TOPO XL PCR克隆試劑盒(Invitrogen )將提取的產物亞克隆到pCR-XbTOPO 栽體中，將產生的栽體轉化到XL10 Gold Ultracompetent細胞
(Stratagene)中'培養轉化的細菌.使用Aurum Miniprep ( Biorad) 從轉化的細菌分離DNA.
通過對未切的DNA和Notl (New England Biolabs)消化的DNA 進行瓊脂糖凝膠分析來鑑定含有小鼠Nav1.3 a亞基插入物的克隆.進 行兩個克隆的5，和3，末端的序列分析(A和B; SeqWright)來證實小 鼠Navl,3 a亞基插入物的存在.
通過maxi prep ( Qiagen)培養含有克隆A和B的細菌用於製備 更大量的DNA.
4. 進行克隆A和B的全長測序(SeqWright).確定克隆A和B中是 否存在PCR錯誤，將兩個克隆的核普酸序列相互比較、與小鼠Na4.3 a亞基基因組序列比較、與大鼠Nav1.3 a亞基cDNA的序列
(NM_013199 )比較，和與兩個人類Nav1.3 a亞基cDNAs( NM—006922 和AF225986)比較.此外，產生由克隆A和B的核苷酸序列編碼的預 測的胺基酸序列，並與大鼠和人類Nav1.3 a亞基蛋白序列進行比較。
克隆A含有相對於鼠基因組序列和人類Nav1.3 a亞基序列的一個 核苷酸改變.克隆A還含有相對於克隆B的83個核苷酸刪除.克隆A和克隆B都含有在一列六個A中的額外的A,這很可能是 由PCR錯誤導入的.在編碼序列中這個核苷酸的存在將移動閱讀框， 並編碼1504個胺基酸的蛋白(與已知的Nav a亞基多肽中大約1940氨 基酸個相對比).並且，額外的A不存在於基因組鼠序列中.大鼠和 人類序列在該位置也缺少額外的核苷酸.
克隆B含有不存在於克隆A或鼠、大鼠和人類基因組序列中相應 基因組區域中的兩個核苷酸改變，因而被確定為是錯誤.克隆B還具 有不存在於克隆A或鼠、大鼠和人類基因組序列中相應位置中的額外 核苷酸，其也被確定為是錯誤.
5. 使用以下步驟對小鼠Navl,3a亞基克隆中發現的突變進行修復，對 於修復的步驟l,通過用來自克隆B的相應片段替換突變的片段，來糾 正克隆A中的突變和83個核苷酸剁除，如下.用Xcml (New England Biolabs)消化克隆A和B。對克隆A的大片段(其沒有突變和刪除) 和克隆B的小片段(替換克隆A的片段)進行分辨，使用QiaquickGel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠中提取。使用T4 DNA連接酶(New England Biolabs)連接消化的片段.將連接的產物轉化入MAX Efficiency Stbl2感受態細胞(Invitrogen )'培養細菌，用Aurum miniprep分離DNA,通過對未切的DNA和用Smal和Narl (New England Biolabs)消化的DNA進行瓊脂糖凝膠分析，鑑定含有合適的 Xcml片段的克隆。
對幾個克隆進行序列分析(SeqWright),來鑑定其中突變和83 個核苷酸刪除被修復的DNA,並證實兩個額外核普酸的存在(一個額 外核苷酸存在於克隆A中， 一個隨克隆B的XcmI片段帶來).
6. 對於修復分離的小鼠Na4.3 a亞基cDNA的步驟2，使用了在其中 突變和83個核苷酸刪除已經修復了的克隆.用QiiickChange XL定點 誘變試劑盒(Stratagene)糾正了這個克隆中的一個額外的核苷酸。設 計定點誘變引物.進行誘變反應，將反應的產物轉化入XL10 Gold Ultracompetent細胞(Stratagene),培養轉化的細菌，通過Aurum miniprep分離DNA.用DNA的Smal消化來分析克隆.對幾個克隆進 行序列分析來鑑定其中額外的核苷酸被修復的DNA.重新生長來自正確克隆的細菌，從而含有額外核苷酸的插入物可以轉移到pcDNA6B並 被修復.
7. 為了將含有一個額外核苷酸的小鼠Nav1.3 a亞基cDNA從pCR-XL-TOPO轉移到pcDNA6B，用EcoRV和Spel( New England Biolabs) 消化該克隆.用EcoRV和Xbal( New England Biolabs )消化pcDNA6B. 對消化片段進行分辨，使用Quiaquick Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖 凝膠中提取，使用T4 DNA連接酶進行連接.將連接的產物轉化入XL10 Gold Ultracompetent細胞.培養細菌,用Aurum miniprep分離DNA。 通過對未切的DNA和Smal消化的DNA進行瓊脂糖凝膠分析來鑑定含 有小鼠Navl.3 a亞基插入物的克隆.重新生長一個克隆用於最後的修 復步驟.
8. 對於修復過程的步驟3,在pcDNA6B中在小鼠Nav1.3 a亞基中含有 額外核苷酸的片段用如下新擴增的片段進行替換.設計引物來擴增小 鼠Nav1.3 a亞基的內部片段(從起始密碼子開始的核苷酸3950-4675). 使用PfuTurbo Hotstart DNA聚合醃(Stratagene)從小鼠腦cDNA (在 步驟1產生)擴增這個片段，通過瓊脂糖凝膠電泳分辨，用Quiaquick Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠提取.將該片段亞克隆入pCR-XL-TOPO載體，並轉化入One Shot TOP10感受態細胞(Invitrogen )。 培養轉化的細菌，通過Aurum minipr印分離DNA.通過對用EcoRI 消化的和用ScaI和BglI (New England Biolabs)雙消化的DNA進行 瓊脂糖凝膠分析來鑑定含有小鼠Nthev1.3 a亞基片段的克隆。對幾個克 隆進行序列分析來鑑定沒有突變的DNA克隆。重新生長一個克隆.
用來自pCR-XL-TOPO的正確片段置換pcDNA6B中小鼠Nav1.3 a亞基中含有額外核苷酸的片段如下進行.用Hpal和BstEII (New England Biolabs)消化兩個克隆.對消化的片段進行分辨，使用 Quiaquick Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠中提取.使用T4 DNA 連接醉連接片段，將連接的產物轉化入MAX Efficiency Stbl2感受態細 胞，培養細菌，用Aurum miniprep分離DNA,通過用Hpal、 BstEII 和Smal限制消化來分析克隆.對幾個克隆的"交換"片段進行測序 (SeqWright)來鑑定其中額外的核苷酸被修復的克隆.進行單個克隆的全長測序來證實在定點誘變方法期間(修復的步驟2)沒有產生新的 突變.
實施例2:編碼序列的確定
表l.描繪了小鼠Nay1.3 a亞基的編碼序列.cDNA的編碼序列相 應於表l中所示序列的核苷酸8到核苷酸5947. SEQIDNO:l相應於 表l所示序列的編碼序列部分.SEQ ID NO:l的預測的胺基酸序列在 SEQ ID NO:2和表2中示出.SEQ ID NO:3相應於表1所示的完整序 列.核苷酸8-10的粗體、下劃線的ATG序列，和核苷酸5945-5947的 粗體、下劃線的TGA序列分別代表編碼序列的起始和終止密碼子.
Table l.小鼠Nav1.3 a亞基的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)
51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 9Q1 951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401 1451 1501 1551 1601 1651 1701 1751
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表2.mNavl.3a亞基的胺基酸序列(SEQIDNO:2)
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實施例3:新的Na+通道a亞基的表達
在非洲爪蟾卵母細胞表達系統中使用二電極電壓鉗技術分析實施 例1中分離的小鼠Nav1.3 a亞基的功能特徵.通過標準克隆方法擴增 Nav1.3 a亞基cDNA並亞克隆入pcDNA6栽體(Invitrogen)。將小鼠 Navl,3a亞基(2ng/nl) cDNA的約46納升注射到去濾泡的非洲爪簷 卵母細胞中，5天後測量電流，在1.8mMCaCl2、 5mMHEPES-Na、 2 mMKC1、1 mM MgCl和96 mMNaAc，pH 7.5的溶液中4吏用0.5-1.0 MQ 電阻(3M KC1)的電極記錄六個細胞的鈉電流.將卵母細胞保持在-100 mV,去極化到電壓-80 mV到50 mV.使用P/4洩漏減去(leak subtraction )方案得到數據.附困3顯示了在不同的去極化電壓下代表 性的鈉電流.六個細胞的標準化、平均化的峰值電流-電壓相互關係在 附圖4中顯示.在-40 mV通道開始打開，在0mV達到最大電流，這 些數據顯示，Na4,3acDNA編碼的通道是功能性的，它展現了這種通 道的預期的生物物理學性質.
在此引用的所有參考文獻，不論是印刷的、電子的、計算機可讀 存儲介質還是其他形式，特意地通過引用完全合併，包括但不限於， 摘要、論文、學報、出版物、文本、文集、網際網路網站、資料庫、軟 件包、專利和專利出版物.已經描述了本發明的許多實施方式.儘管 如此，要理解的是，可以進行各種修改而不背離本發明的精神和範閨. 因此，其他實施方式在以下的權利要求的範圍之內.
權利要求
1. 一種分離的鈉通道III型α亞基(mNav1.3α亞基)多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO2的胺基酸序列。
2. 權利要求l的多肽，其中該多肽基本上由SEQIDNO:2的氨基 酸序列組成.
3. 包含SEQ ID NO:2的至少10個連續胺基酸的分離的mNav1.3 a亞基多肽，其中所述多肽包括以下胺基酸中的一個或多個異亮氨酸 289、脯氨酸S18、絲氨酸728、絲氨酸1355、天冬酜胺l卯9、蘇氨酸 1910和纈氨酸1921.
4. 編碼權利要求1-3的任何一個的多肽的分離的mNav1.3 a亞基核 酸分子.
5. 權利要求4的核酸分子，其中所述核酸包含SEQIDNO:l的核 苷酸序列。
6. 權利要求5的核酸分子，其中所述核酸分子基本上由SEQ ID NO:l的核苷酸序列組成.
7. 權利要求4的核酸分子，其中所述核酸是SEQIDNO:l的核酸序列的等位基因.
8. 權利要求4的mNav1.3 a亞基核酸分子的片段，其中所述片段 編碼以下的胺基酸中的一個或多個異亮氨酸289、脯氨酸518、絲氨 酸728、絲氨酸1355、天冬醯胺1909、蘇氨酸1910和纈氨酸1921。
9. 一種表達栽體，包含與啟動子可操作連接的權利要求4的 mNav1.3 a亞基核酸分子，
10. 包含權利要求4的核酸的宿主細胞。
11. 優先地結合權利要求1的mNav1.3 ct亞基多肽的試劑.
12. —種試劑，其與權利要求l的mNavl.:3a亞基多肽選擇性地結 合，並且不與鈉通道I型或II型a亞基多肽結合.
13. 權利要求12的試劑，其中所述試劑是小分子、核酸或蛋白。
14. 權利要求12的試劑，其中所述試劑調節mN^1.3 a亞基多肽 活性.
15. 權利要求13的試劑，其中所述試劑是抗體或其抗原結合片段.
16. 權利要求15的試劑，其中所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
17. 包含權利要求12的試劑和藥學上可接受的栽體的藥物組合物.
18. 調節細胞中mNav:L3a亞基多肽活性的方法，所述方法包括 提供包含mNav1.3 a亞基多肽的鈉通道，其中所述mNav1.3 a亞基多肽是根據權利要求1 _ 3的任何一項的多肽；使所述通道與有效調節mNav1.3 a亞基多肽的活性的量的mNav1.3 a亞基多肽調節物接觸.
19. 權利要求18的方法，其中所述調節物是小分子、核酸或蛋白.
20. 鑑定調節mNavl.3a亞基多肽活性的試劑的方法，所述方法包括提供包含mNav1.3 a亞基多肽的第 一鈉通道，其中所述mNav1.3 a 亞基多肽是根據權利要求1 - 3的任何一項的多肽； 使所述通道與測試化合物接觸；以及評估所述鈉通道的活性，其中相對於參考值的活性變化是該化合物是調節所述通道的試劑的指示。
21. 權利要求20的方法，其中所述測試化合物是小分子、肽或核酸。
22. 權利要求20的方法，其中所述鈉通道被包含在生物樣品內.
23. 權利要求20的方法，其中所述通道與多種測試化合物接觸.
24. 權利要求20的方法，其中所述樣品包含細胞膜.
25. 權利要求24的方法，其中所述樣品包含細胞。
26. 權利要求25的方法，其中所述細胞是真核細胞，
27. 權利要求26的方法，其中所述細胞是非洲爪蟾卵母細胞。
28. 權利要求26的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞.
29. 權利要求20的方法，其中所述活性包含鈉濃度的調節.
30. 權利要求20的方法，其中所述評估包括檢測鈉排出'
31. 權利要求20的方法，其中所述接觸在不存在測試化合物，產生第一鈉排出量的條件下發生.
32. 權利要求20的方法，其中所述評估包括使用Na+流量分析。
33. 權利要求20的方法，其中所述分析使用膜片鉗電生理學.
34. 權利要求20的方法，其中所述分析使用二電極電壓鉗電生理學.
35. 權利要求20的方法，其中所述分析包括使用鈉敏感性染料.
36. 權利要求20的方法，其中所述分析是高通量分析.
37. 權利要求20的方法，進一步包括步驟提供包含mNavl,3a亞基多肽的第二鈉通道，其中所述mNavl.3a 亞基多肽不同於根據權利要求1 - 3的mNav1.3 a亞基多肽； 用測試化合物接觸所述第二鈉通道； 評估所述第二鈉通道的活性.
38. 權利要求37的方法，進一步包括比較存在測試化合物的情況 下第一鈉通道的活性和存在測試化合物的情況下笫二鈉通道的活性.
39. 權利要求37的方法，其中提供多個鈉通道.
40. 權利要求20的方法，其中所述mNav1.3 a亞基多肽包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列.
41. 鑑定在治療與鈉電流調節有關的失調中有用的試劑的方法，所 述方法包括提供包含根據權利要求1 一 3的任何一個的mNavl.3 a亞基多肽的 鈉通道；用測試化合物接觸所述通道；和評估所述通道的活性，其中相對於參考值的活性變化是測試化合 物是在與鈉電流有關的失調中有用的試劑的指示.
42. 權利要求41的方法，其中所述失調是疼痛、感覺異常、中風、頭部外傷、神經變性失調或與神經元的超興奮性有關的失調.
43. 權利要求41的方法，進一步包括體內施用所述化合物。
44. 權利要求41的方法，進一步包括為了體內使用而修飾所述化 合物.
45. 權利要求41的方法，進一步包括評估由所述化合物對相關的 人類NavL3a亞基多肽的調節.
46. 治療患有與鈉通道電流有關的失調的受試者的方法，所述方法 包括鑑定與mNav1.3 a亞基多肽選擇性結合的試劑，和 向需要這種治療的受試者施用藥理學試劑，所述藥理學試劑對於 包含mNav1.3 a亞基多肽的鈉通道有選擇性.
47.權利要求46的方法，其中所述失調是疼痛、感覺異常、中風、 頭部外傷、神經變性失調或與神經元的超興奮性有關的失調.
全文摘要
在此公開了新的鈉通道核酸和多肽。還公開了使用這種新的核酸和多肽的方法。
文檔編號C12NGK101421300SQ200480041649
公開日2009年4月29日 申請日期2004年12月10日 優先權日2003年12月12日
發明者A·霍恩斯滕, R·弗蘭科 申請人:塞恩藥品公司