一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法
2023-12-09 02:04:26
專利名稱：一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法。
背景技術：
腫瘤的侵襲和轉移是一個複雜的多步驟多因素過程，包括腫瘤細胞分泌酶解周圍基質，從原發灶解離，進入血液循環，在血流中存活並穿出血管壁，繼而形成轉移灶的一系列過程。腫瘤細胞在血液循環中不可避免地與血液中的成分相互作用，而血液中的免疫細胞可清除腫瘤細胞，但血小板則能促進腫瘤細胞的轉移。有研究發現，腫瘤患者常伴有血小板升高，抗血小板治療可抑制腫瘤轉移。腫瘤細胞與血小板的相互作用在腫瘤轉移過程中的作用主要體現在以下幾方面:
1、血小板粘附於腫瘤細胞表面，遮擋由血流剪切力引起的機械損傷，並幫助腫瘤細胞逃避機體免疫系統的攻擊，從而促進腫瘤細胞在血流中存活；2、粘附於腫瘤細胞表面的血小板，可同時粘附血管內皮細胞並導致血管內皮細胞收縮，從而促進腫瘤細胞在遠隔部位的血管中停留下來，並穿出血管到達轉移部位；3、血小板可釋放血小板衍生生長因子、血管內皮細胞生長因子等細胞因子，可刺激腫瘤細胞的生長，以及腫瘤血供的形成。因此，檢測抗腫瘤藥物對腫瘤細胞與血小板的粘附能力的影響程度對於評價其是否具有抑制腫瘤細胞轉移和侵襲能力至關重要。目前常用的方法主要是，將腫瘤細胞種於細胞培養板中，待細胞完全貼壁，並完全融合後用待檢測的抗腫瘤藥物處理，將螢光或同位素標記過的血小板加入培養板中，孵育一定時間後，漂洗去除未粘附於腫瘤細胞的血小板，加入裂解液裂解細胞和血小板後，檢測培養板中的螢光或同位素水平相對於未經抗腫瘤藥物處理的螢光或同位素水平是否有所降低，反映待檢測藥物是否具有抑制腫瘤細胞與血小板粘附的活性，從而評價其在抑制腫瘤細胞侵襲和轉移中的作用。但目這種檢測技術存在一定的局限性，主要體現在以下幾方面:⑴無法模擬腫瘤細胞與血小板粘附的真實過程，腫瘤細胞處於貼壁狀態，而在體內的血流環境中，腫瘤細胞處於懸浮狀態，因此該方法不能反應真實的腫瘤細胞與血小板粘附過程；⑵實驗操作複雜，需預先將細胞種於培養板，並使細胞生長至完全融合，實驗周期較長；⑶難以定量檢測，某些抗腫瘤藥物能夠殺死腫瘤細胞或使腫瘤細胞無法貼壁，如此造成藥物處理組和對照組的腫瘤細胞數目不一致，無法真實反映是否是由於抑制腫瘤細胞和血小板粘附而達到的效果M)採用放射性同位素進行檢查，造成輻射傷害和環境汙染。因此需要開發一種準確、簡便、安全,並能模擬真實體內粘附過程的實驗技術。
發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法，使所述方法更加安全、準確、簡便。
為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案:一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法，其特徵在於，包括以下步驟:步驟1、將螢光標記探針與富血小板血漿孵育，然後離心並吸取底層的血小板沉澱用血小板洗滌液洗滌，然後用血小板懸浮液重懸洗滌後的血小板，接著向血小板重懸液中加入CaCl2，然後調整血小板濃度為10-100 X IO6個/mL以及CaCl2濃度為ImM備用；步驟2、將未經待檢測抗腫瘤藥物處理的腫瘤細胞設為對照組，經待檢測的抗腫瘤藥物處理後的腫瘤細胞為藥物處理組，兩組細胞分別經胰酶消化處理後用PBS洗滌，然後用腫瘤細胞懸浮液重懸得到對照組腫瘤細胞重懸液和藥物處理組腫瘤細胞重懸液，調整兩組腫瘤細胞密度為5 X IO6個/mL備用；步驟3、將步驟2得到的兩組腫瘤細胞重懸液分別和步驟I得到的血小板重懸液孵育，用多聚甲醛固定後於流式細胞儀上採用FLl通道檢測腫瘤細胞螢光率獲得藥物處理組螢光率以及對照組螢光率；將試驗組螢光率和對照組螢光率進行統計學顯著性差異分析得到檢測結果。其中，步驟I所述血小板濃度優選為30 X IO6個/mL。本發明所述將試驗組螢光率和對照組螢光率進行統計學顯著性差異分析得到最終結果，是指兩者進行顯著性差異分析，如果藥物處理組的螢光率降低且相對於對照組螢光率具有顯著性差異則說明待測抗腫瘤藥物具有抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性，能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。本發明所述腫瘤細胞在未經待測抗腫瘤藥物處理前和對照組腫瘤細胞一樣按照正常的培養方法培養，所述處理是向腫瘤細胞培養液中加入藥物，這屬於本領域公知處理方式。本發明步驟I所述富血小板血漿(PRP)可按照常規方法從血液中提取，在本發明實施例中按照如下方法提取:抽取靜脈血IOmL,置於質量百分數為3.8%枸櫞酸三鈉抗凝劑(抗凝劑與血樣的體積比為1:9)的試管中。在室溫下離心1000rpm、10min。待離心機自然停止後取出，小心吸取上層血漿即為富血小板血漿(PRP )。針對現有檢測技術無法真實模擬腫瘤細胞和血小板粘附過程以及檢測過程中易出現較大誤差的缺陷，本發明採用懸浮狀態的腫瘤細胞和未活化的血小板進行粘附實驗，並通過流式細胞儀檢測技術消除因腫瘤細胞的殺傷作用導致的試驗組和對照組細胞數量不一致的問題，符合真實的腫瘤細胞與血小板粘附過程。優選地，所述血小板洗滌液由以下方法製備獲得:3.60g NaCl，1.90g檸檬酸三鈉，3.0Og葡萄糖，溶於500ml雙蒸水中，溶解後調整pH值至6.5即得。優選地，所述血小板懸浮液由以下方法製備獲得:血小板懸浮液原液5ml，IM HEPES125 μ L，20% 葡萄糖 250 μ L，IM MgCl250 μ L,
0.05g BSA，用雙蒸水定溶至50ml，溶解後調整pH值至7.4即得；所述血小板懸浮液原液由8.0Og NaCl，1.02g NaHCO3,0.195g KCl溶於IOOml雙蒸水中配製而成。
優選地，所述螢光標記探針為ΙΟμΜ的CFDA-SE、5_10yM的Dil、0.1_5 μ M的Calcein-AM或3 μ M的BCECF-AM，更優選為10 μ M的CFDA-SE。為方便配製，CFDA-SE可溶於二甲基亞碸(DMSO)配成IOmM母液，在實際應用中在再進行稀釋使用，其他螢光標記探針均可以如此。本發明採用CFDA-SE標記血小板，相對螢光抗體或同位素標記血小板的技術，CFDA-SE的價格遠比抗體和同位素低廉，而且CFDA-SE標記操作方便。如果採用抗體標記血小板,需在洗滌血小板製備完成後再進行抗體標記,抗體標記後需再次洗滌以去除多餘的抗體,避免抗體直接結合腫瘤細胞。而採用CFDA-SE標記血小板，標記的步驟在洗滌血小板之前，在洗滌血小板的同時將多餘的CFDA-SE去除，無需增加洗滌次數，簡化了實驗步驟，減少了過多操作導致血小板活化的可能性。另外，CFDA-SE標記時間短，僅需5-10min即可完成突光標記，避免標記時間過長導致的血小板活化。同時CFDA-SE無毒,避免同位素標記造成的環境汙染。作為優選，本發明所述腫瘤細胞懸浮液由以下方法製備獲得:IM CaCl250 μ L, IM MgCl250 μ L, 0.05g BSA,用 RPM1-1640 培養液定溶至 50ml，溶解後調整pH值至7.4即得。優選地，步驟I和步驟3所述孵育的時間均為10_15min。優選地，步驟2所述PBS由以下方法製備獲得:稱取8.0Og NaCl, 0.20g KCl, 1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4溶於 1000ml 雙蒸水中，
溶解後調整PH值至7.4，高壓滅菌後即得。 優選地，步驟2所述胰酶為質量百分比為0.25%的胰酶溶液。優選地，所述腫瘤細胞為乳腺癌細胞。優選地，步驟3所述腫瘤細胞重懸液和血小板重懸液的體積比為1:4。在準確度對比試驗中，按照現有技術檢測的藥物處理組螢光值與對照組螢光值無明顯差異，通過螢光顯微鏡的觀察可見培養板中出現了一些沒有細胞的空隙，這些空隙處在光鏡下可見到血小板，表明現有技術檢測的結果出現誤差，而採用本發明檢測方法檢測，細胞與血小板孵育後於流式細胞儀檢測，可見加抗腫瘤藥物處理組細胞的螢光率下降，說明粘附於細胞上的血小板減少。本發明採用懸浮狀態的腫瘤細胞和未活化的血小板進行粘附實驗，符合真實的腫瘤細胞與血小板粘附過程，由於採用懸浮狀態細胞進行粘附實驗，可在粘附實驗前通過細胞計數調整細胞密度，能保證加藥處理的細胞與對照組細胞密度一致，且通過流式分析軟體設定檢測細胞數目，保證不同預處理組檢測的細胞數目一致，避免不同預處理對腫瘤細胞數目的影響，結果更加準確。同時，本發明在檢測過程中無需培養板，細胞也不需要生長至完全融合，檢測周期大大縮短，所採用的螢光標記探針相對放射性同位素更加安全。
圖1所示為實施例1的流式細胞儀檢測圖譜；其中，圖1-A為對照組流式細胞儀檢測圖譜；圖1-B為整合素α 2β i封閉性抗體處理組流式細胞儀檢測圖譜；圖譜左上角為螢光率數值；圖2所示為實施例2的流式細胞儀檢測圖譜；
其中，圖2-A為對照組流式細胞儀檢測圖譜，圖2-B為藥物處理組(斑蝥素處理組)流式細胞儀檢測圖譜；圖2-C為藥物處理組(去甲斑蝥素處理組)流式細胞儀檢測圖譜；圖譜左上角為螢光率數值；圖3所示為實施例3現有技術螢光鏡檢圖；其中，圖3-A為對照組螢光鏡檢圖，圖3-B為藥物處理組(20 μ M斑蝥素處理組)光學顯微鏡鏡檢圖；圖3-C為藥物處理組(斑蝥素處理組)光學顯微鏡鏡檢圖矩形框放大部分；圖3-D為藥物處理組(200μΜ去甲斑蝥素處理組)光學顯微鏡鏡檢圖；圖3-Ε為藥物處理組(去甲斑蝥素處理組)光學顯微鏡鏡檢圖矩形框放大部分；圖4為實施例3本發明所述方法的流式細胞儀檢測圖譜；其中，圖4-Α為對照組流式細胞儀檢測圖譜，圖4-Β為藥物處理組(20 μ M斑蝥素處理組)流式細胞儀檢測圖譜；圖4-C為藥物處理組(200 μ M去甲斑蝥素處理組)流式細胞儀檢測圖譜；圖譜左上角為螢光率數值；圖5為實施例3本發明所述檢測方法不同藥物處理後的腫瘤細胞螢光率柱形圖(基於圖4結果獲得)；其中柱形I為對照組，柱形2為20 μ M斑蝥素處理組，柱形3為200 μ M去甲斑蝥
素處理組。
具體實施例方式本發明公開了一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述方法及試劑盒已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。以下就本發明所提供的一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法做進一步說明。實施例1:檢測整合素Ci2P1封閉性抗體抑制乳腺癌細胞MCF-7和血小板粘附的活性為了驗證本發明檢測方法對抗腫瘤藥物抑制血小板和腫瘤細胞粘附的活性的結果準確性，本實施例選用整合素Ci2P1封閉性抗體對於重懸後的腫瘤細胞處理來驗證(整合素α 2β i封閉性抗體與抗腫瘤藥物處理腫瘤細胞的階段不同，其是在腫瘤細胞重懸後加入處理，而抗腫瘤藥物是在腫瘤細胞培養時加入處理，這是試劑本身性質帶來的差異，仍是基於本發明檢測方法的核心原理)。1、相關試劑配製腫瘤細胞懸浮液:1MCaCl250 μ L, IM MgCl250 μ L，0.05g BSA，用 RPM1-1640 培養液定溶至50ml，溶解後調整pH值至7.4即得血小板洗漆液:3.60g NaCl, 1.90g朽1檬酸三鈉,3.0Og葡萄糖,溶於500ml雙蒸水中，溶解後調整PH值至6.5即得；血小板懸浮液:血小板懸浮液原液5ml，IM HEPES125 μ L, 20%葡萄糖250 μ L，IMMgCl250 yL,0.05g BSA，用雙蒸水定溶至50ml，溶解後調整pH值至7.4即得；血小板懸浮液原液:8.0Og NaCl，1.02g NaHCO3,0.195g KCl 溶於 IOOml 雙蒸水中配製而成；CFDA-SE母液:CFDA_SE溶於二甲基亞碸(DMSO)配成IOmM母液；PBS:稱取 8.0Og NaCl, 0.20g KCl，1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4 溶於 1000ml 雙蒸水中，溶解後調整PH值至7.4，高壓滅菌後即得。2、檢測方法抽取健康志願者靜脈血10ml，所有志願者兩周內均未服用任何抗凝藥及影響血小板功能的藥物。置於含3.8% (質量分數)枸櫞酸三鈉抗凝劑(抗凝劑與血樣的體積比為1:9)的試管中，在室溫下離心lOOOrpm、IOmin。待離心機自然停止後取出，小心吸取上層血漿即為富血小板血漿(PRP)。PRP中加入1000 X CFDA-SE母液至終濃度為10 μ Μ，室溫孵育lOmin。將CFDA-SE標記後的PRP以2500rpm、IOmin再次離心，待離心機自然停止後取出，小心吸取底層的血小板沉澱，用血小板洗滌液洗滌兩次，洗滌過程中避免血小板活化，動作輕柔。然後將血小板再懸浮於血小板懸浮液中，接著向血小板重懸液中加入IM CaCl2，然後調整血小板濃度為30 X IO6個/mL以及CaCl2濃度為ImM備用；取對數生長期乳腺癌細胞MCF-7，0.25%的胰酶溶液消化後PBS洗滌，腫瘤細胞懸浮液重懸，計數細胞，調整腫瘤細胞密度至5 X IO6個/mL備用。 100 μ L5 X IO6個/mL濃度腫瘤細胞與30 X IO6個/mL濃度的洗滌血小板400 μ L孵育15min作為對照組，100 μ L5X IO6個/mL濃度腫瘤細胞重懸液經整合素Ct2P1封閉性抗體處理後，與30 X IO6個/mL濃度的血小板重懸液400 μ L孵育15min作為藥物處理組；分別向藥物處理組和對照組中加入500 μ L4%多聚甲醛(多聚甲醛終濃度為2%)固定15min。然後分別於流式細胞儀上採用FLl通道檢測螢光率，每組重複3_5次，統計學顯著性差異分析兩組數據是否具有顯著性差異。3、結果結果見圖1 (其他重複結果圖略)，由圖1可知,乳腺癌細胞MCF-7與血小板重懸液孵育後，帶螢光的細胞佔41.9% (螢光率)。整合素Q2P1是腫瘤細胞表面介導細胞與血小板粘附的關鍵分子，乳腺癌細胞MCF-7用整合素α 2β I的封閉性抗體處理後，再與血小板重懸液孵育，孵育後帶螢光的細胞佔31.8% (螢光率)，經顯著性差異分析後兩者具有顯著性差異(Ρ〈0.05)。說明用整合素α2β I的封閉性抗體阻斷腫瘤細胞整合素Cij1的功能後，腫瘤細胞與血小板粘附的能力下降，本發明檢測結果與預期結果一致，表明本發明檢測方法準確度高。實施例2:檢測斑蝥素以及去甲斑蝥素抑制乳腺癌細胞MCF-7和血小板粘附的活性1、相關試劑配製相關試劑配製參照實施例1。2、檢測方法抽取健康志願者靜脈血10ml，所有志願者兩周內均未服用任何抗凝藥及影響血小板功能的藥物。置於含3.8% (質量分數)枸櫞酸三鈉抗凝劑(抗凝劑與血樣的體積比為1:9)的試管中，在室溫下離心lOOOrpm、IOmin。待離心機自然停止後取出，小心吸取上層血漿即為富血小板血漿(PRP)。PRP中加入1000 X CFDA-SE母液至終濃度為10 μ Μ，室溫孵育lOmin。將CFDA-SE標記後的PRP以2500rpm、IOmin再次離心，待離心機自然停止後取出，小心吸取底層的血小板沉澱，用血小板洗滌液洗滌兩次，洗滌過程中避免血小板活化，動作輕柔。然後將血小板再懸浮於血小板懸浮液中，接著向血小板重懸液中加入IM CaCl2，然後調整血小板濃度為30 X IO6個/mL以及CaCl2濃度為ImM備用；取對數生長期乳腺癌細胞MCF-7設為對照組，將經斑蝥素以及去甲斑蝥素處理後的腫瘤細胞為藥物處理組，三組細胞分別經胰酶消化處理後用PBS洗滌，然後用腫瘤細胞懸浮液重懸得到對照組腫瘤細胞重懸液和兩個藥物處理組腫瘤細胞重懸液，調整三組腫瘤細胞密度為5 X IO6個/mL備用將上述得到的三組腫瘤細胞重懸液各取100 μ L分別和400 μ L血小板重懸液孵育15π η，500μ 4%多聚甲醛(多聚甲醛終濃度為2%)固定15min，然後於流式細胞儀上採用FLl通道檢測腫瘤細胞螢光率獲得藥物處理組螢光率以及對照組螢光率，每組重複3-5次，統計學顯著性差異分析兩組數據是否具有顯著性差異。3、結果結果見圖2 (其他重複結果圖略)，乳腺癌細胞MCF-7與血小板重懸液孵育後，帶螢光的細胞佔41.9%(螢光率)。斑蝥素以及去甲斑蝥素是已知能夠抑制腫瘤侵襲和轉移的抗腫瘤藥物，乳腺癌細胞MCF-7分別用斑蝥素和去甲斑蝥素處理後，再與血小板重懸液孵育，孵育後帶螢光的細胞分別佔25.6 %和29.7% (螢光率)，經顯著性差異分析後和對照組具有顯著性差異(P〈0.05)。表明本發明檢測結果與預期結果一致。實施例3:本發明檢測方法和現有技術的對比試驗現有技術:將腫瘤細胞種於細胞培養板中，待細胞完全貼壁，並完全融合後用待檢測的抗腫瘤藥物處理，將螢光標記過的血小板加入培養板中，孵育一定時間後，漂洗去除未粘附於腫瘤細胞的血小板，加入裂解液裂解細胞和血小板後，檢測培養板中的螢光水平相對於未經抗腫瘤藥物處理的螢光水平是否有所降低，抗腫瘤藥物為斑蝥素和去甲斑蝥素，腫瘤細胞為乳腺癌細胞MCF-7，結果見圖3 ；本發明:相關試劑配製和檢測方法參照實施例2，抗腫瘤藥物為斑蝥素和去甲斑蝥素，腫瘤細胞為乳腺癌細胞MCF-7，結果見圖4和圖5 ；由圖3可知，採用現有技術進行的腫瘤細胞與血小板粘附的檢測，與對照組相比，當採用抗腫瘤藥物斑蝥素(CAN)和去甲斑蝥素(NCTD)處理後，細胞變圓，粘附力下降，培養板中出現了一些沒有細胞的空隙(詳見矩形框放大部分鏡檢圖)，這些空隙處在光鏡下可見到血小板，螢光顯微鏡下可見綠色螢光，說明血小板直接粘附到了培養板上的空隙處。經檢測各組間的總螢光強度無明顯差別，無法證實藥物對腫瘤細胞與血小板的粘附有抑制活性，結果出現偏差。由圖4和圖5可知，腫瘤細胞與血小板孵育後於流式細胞儀檢測，可見加斑蝥素和去甲斑蝥素處理組的細胞的螢光率下降，說明粘附於細胞上的血小板減少，與對照組結果具有顯著性差異(P〈0.05)，表明斑蝥素和去甲斑蝥素具有對腫瘤細胞與血小板的粘附有抑制活性，能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，與預期結果是一致的，結果準確。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟1、將螢光標記探針與富血小板血漿孵育，然後離心並吸取底層的血小板沉澱用血小板洗滌液洗滌，然後用血小板懸浮液重懸洗滌後的血小板，接著向血小板重懸液中加入CaCl2，然後調整血小板濃度為10-100 X IO6個/mL以及CaCl2濃度為ImM備用； 步驟2、將未經待檢測抗腫瘤藥物處理的腫瘤細胞設為對照組，經待檢測的抗腫瘤藥物處理後的腫瘤細胞為藥物處理組，兩組細胞分別經胰酶消化處理後用PBS洗滌，然後用腫瘤細胞懸浮液重懸得到對照組腫瘤細胞重懸液和藥物處理組腫瘤細胞重懸液，調整兩組腫瘤細胞密度為5 X IO6個/mL備用； 步驟3、將步驟2得到的兩組腫瘤細胞重懸液分別和步驟I得到的血小板重懸液孵育，用多聚甲醛固定後於流式細胞儀上採用FLl通道檢測腫瘤細胞螢光率獲得藥物處理組螢光率以及對照組螢光率； 將藥物處理組螢光率和對照組螢光率進行統計學顯著性差異分析得到檢測結果。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述血小板洗滌液由以下方法製備獲得: 3.60g NaCl，1.90g檸檬酸三鈉，3.0Og葡萄糖，溶於500ml雙蒸水中，溶解後調整pH值至6.5即得。
3.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述血小板懸浮液由以下方法製備獲得: 血小板懸浮液原液 5ml，IM HEPES125y L,20% 葡萄糖 250 μ L，IM MgCl250 y L,0.05gBSA，用雙蒸水定溶至50ml，溶解後調整pH值至7.4即得； 所述血小板懸浮液原液由8.0Og NaCl，1.02g NaHCO3,0.195g KCl溶於IOOml雙蒸水中配製而成。`
4.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述螢光標記探針為ΙΟμΜ的CFDA-SE、5-10 μ M 的 Dil、0.1-5 μ M 的 Calcein-ΑΜ 或 3 μ M 的 BCECF-AM。
5.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述腫瘤細胞懸浮液由以下方法製備獲得: IM CaCl250 μ L, IM MgCl250 μ L，0.05g BSA，用 RPM1-1640 培養液定溶至 50ml，溶解後調整pH值至7.4即得。
6.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，步驟I和步驟3所述孵育的時間均為10_15mino
7.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，步驟2所述PBS由以下方法製備獲得:稱取8.0Og NaCl, 0.20g KCl，1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4溶於 1000ml 雙蒸水中，溶解後調整pH值至7.4，高壓滅菌後即得。
8.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，步驟2所述胰酶為質量百分比為0.25%的胰酶溶液。
9.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述腫瘤細胞為乳腺癌細胞。
10.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，步驟3所述腫瘤細胞重懸液和血小板重懸液的體積比為1:4。
全文摘要
本發明涉及生物化學領域，公開了一種檢測抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞和血小板粘附的活性的方法。該方法用螢光標記探針標記血小板，然後分別與未經抗腫瘤藥物處理的腫瘤細胞和經抗腫瘤藥物處理的腫瘤細胞孵育，於流式細胞儀上採用FL1通道檢測腫瘤細胞螢光率獲得對照組螢光率和藥物處理組螢光率，將兩者進行顯著性差異分析獲得檢測結果。本發明採用懸浮狀態的腫瘤細胞和未活化的血小板進行檢測，符合真實的腫瘤細胞與血小板粘附過程，在粘附實驗前通過細胞計數調整細胞密度保證加藥處理的細胞與對照組細胞密度一致，且通過流式分析軟體設定檢測細胞數目，保證不同預處理組檢測的細胞數目一致，避免不同預處理對腫瘤細胞數目的影響，結果更加準確。
文檔編號G01N21/64GK103175817SQ20131008610
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者李偉, 陶敏, 張瓊妍 申請人:蘇州大學附屬第一醫院