提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法
2023-12-09 06:46:01
提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法
【專利摘要】本發明提供一種提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，包括：（1）用基礎緩衝液配製含有非蛋白質封閉組分的第一種封閉液；（2）用與步驟（1）相同的基礎緩衝液配製含有蛋白質和胺基酸的第二種封閉液；（3）用第一種封閉液在37℃條件下對包被有抗原的硝酸纖維素膜第一次封閉；（4）棄去第一種封閉液；（5）用第二種封閉液在37℃條件下對完成第一次封閉的硝酸纖維素膜第二次封閉；（6）棄去第二種封閉液，完成封閉；通過使用兩種不同封閉液並兩次封閉，充分發揮封閉液中有效成分，徹底封閉抗原抗體反應區域以外間隙，最大限度地降低交叉反應和非特異結合，有效提升酶聯免疫斑點技術產品檢測結果準確性。
【專利說明】提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物體外診斷試劑的製備，尤其涉及一種提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法
【背景技術】
[0002]目前酶聯免疫斑點技術產品在體外診斷試劑中已有廣泛的應用，如風溼免疫科中各種自身免疫性疾病的檢測。酶聯免疫斑點技術是基於硝酸纖維素膜的酶聯免疫技術，該種技術產品的優點是可實現多種實驗室指標的同時檢測，並且無需藉助特殊儀器憑藉肉眼即可進行結果判斷。然而硝酸纖維素膜自身具有吸附性強這個特點使得基於其基礎上建立起來的酶聯免疫斑點法產品的特異性成為困擾該種技術產品的關鍵因素。本領域技術人員應了解該種技術產品特異性的好壞主要是由封閉過程來決定的。現有技術關於非特異反應的封閉是採用封閉液一次封閉的過程，封閉液主要是以蛋白質為基礎的封閉液以及近年來出現的部分非蛋白質封閉液。然而現有技術封閉方法要麼由於蛋白質組分導致出現部分的交叉反應，要麼由於大分子非蛋白質封閉組分間的間隙出現部分的非特異結合，導致最終的封閉效果並不十分理想，仍然會出現較多的非特異顯色，易於產生結果判讀的錯誤。
【發明內容】
[0003]本發明的主要目的在於克服現有產品存在的上述缺點，而提供一種提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其通過使用兩種不同的封閉液，並採用兩次封閉的技術方案，充分發揮封閉液中的有效成分，徹底封閉抗原抗體反應區域以外的其餘間隙，能夠最大限度地降低交叉反應和非特異結合，有效提升酶聯免疫斑點技術產品檢測結果的準確性。
[0004]本發明的目的是由以下技術方案實現的。
[0005]本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其特徵在於，包括以下步驟:
[0006](I)用基礎緩衝液配製含有非蛋白質封閉組分的第一種封閉液；(2)用與步驟(I)相同的基礎緩衝液配製含有蛋白質和胺基酸的第二種封閉液；(3)用前述第一種封閉液在溫度37°C條件下對包被有抗原的硝酸纖維素膜進行第一次封閉；(4)棄去第一種封閉液；
(5)用前述第二種封閉液在溫度37°C條件下對前述完成第一次封閉的硝酸纖維素膜進行第二次封閉；(6)棄去第二種封閉液,完成封閉過程。
[0007]前述的提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其中配製第一種封閉液使用的基礎緩衝液為磷酸鹽緩衝液或者Tris-Hcl緩衝液；所述非蛋白質封閉組分為聚乙烯醇或聚乙二醇，該非蛋白質封閉組分的加入濃度為2±0.5%。
[0008]前述的提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其中配製第二種封閉液使用的基礎緩衝液為磷酸鹽緩衝液或者Tris-Hcl緩衝液；所述蛋白質為低分子量蛋白質，該低分子量蛋白質為酪蛋白或者牛血清白蛋白，且低分子量蛋白質的加入濃度為1±0.5%;所述胺基酸為酪氨酸，該胺基酸的加入濃度為1±0.5%。
[0009]前述的提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其中硝酸纖維素膜的包被抗原優選Ul-nRNP或者SS-A。
[0010]前述的提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其中第一次封閉的時間為2至3小時；所述第二次封閉的時間為I至2小時。
[0011]本發明權利要求1所述提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法在酶聯免疫斑點技術中的應用。
[0012]本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法的有益效果，通過使用兩種不同的封閉液、採用兩次封閉的技術方案，充分發揮封閉液中的有效成分，徹底地封閉抗原抗體反應區域以外的其餘間隙，最大限度地降低交叉反應和非特異結合，克服現有技術封閉後仍會出現部分非特異顯色現象，有效提升酶聯免疫斑點技術產品檢測結果的準確性。
【專利附圖】
【附圖說明】
:
[0013]圖1為使用本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法和使用現有技術封閉後的非特異顯色檢測結果圖。
[0014]圖中主要標號說明:
[0015]1-5列是5份Ul-nRNP陽性樣本檢測結果。
[0016]6-10列是5份Ul-nRNP陰性樣本檢測結果。
[0017]A行是使用本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法封閉後的檢測結果O
[0018]B行是使用現有技術封閉後的檢測結果。
[0019]圖2為使用本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法和使用現有技術封閉後的非特異顯色檢測結果圖。
[0020]圖中主要標號說明:
[0021]11-15列是5份SS-A陽性樣本檢測結果。
[0022]16-20列是5份SS-A陰性樣本檢測結果。
[0023]C行是使用本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法封閉後的檢測結果O
[0024]D行是使用現有技術封閉後的檢測結果。
【具體實施方式】
[0025]本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其特徵在於，包括以下步驟:
(I)用基礎緩衝液配製含有非蛋白質封閉組分的第一種封閉液；(2)用與步驟(I)相同的基礎緩衝液配製含有蛋白質和胺基酸的第二種封閉液；(3)用前述第一種封閉液在溫度37°C條件下對包被有抗原的硝酸纖維素膜進行第一次封閉；(4)棄去第一種封閉液；(5)用前述第二種封閉液在溫度37°C條件下對前述完成第一次封閉的硝酸纖維素膜進行第二次封閉；
(6)棄去第二種封閉液,完成封閉過程。
[0026]本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其中，所述配製第一種封閉液使用的基礎緩衝液為磷酸鹽緩衝液或者Tris-Hcl緩衝液；所述非蛋白質封閉組分為聚乙烯醇或聚乙二醇，該非蛋白質封閉組分的加入濃度為2±0.5%。所述配製第二種封閉液使用的基礎緩衝液為磷酸鹽緩衝液或者Tris-Hcl緩衝液；所述蛋白質為低分子量蛋白質，該低分子量蛋白質為酪蛋白或者牛血清白蛋白，且低分子量蛋白質的加入濃度為1±0.5%；所述胺基酸為酪氨酸，該胺基酸的加入濃度為I ±0.5%。所述硝酸纖維素膜的包被抗原優選Ul-nRNP或者SS-A。所述第一次封閉的時間為2至3小時；所述第二次封閉的時間為I至2小時。
[0027]本發明權利要求1所述提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法在酶聯免疫斑點技術中的應用。
[0028]實施例1:
[0029]A配製第一種封閉液，具體配製方法為配製含有聚乙烯醇終濃度為2%的0.02mol/L磷酸鹽緩衝液，ρΗ7.2 ；
[0030]B配製第二種封閉液，具體配製方法為配製含有酪蛋白和酪氨酸終濃度各為1%的0.02 mol/L磷酸鹽緩衝液，ρΗ7.2 ；
[0031]C用前述第一種封閉液對包被有Ul-nRNP抗原的硝酸纖維素膜進行溫度37°C持續時間2小時的第一次封閉；
[0032]D棄去前述第一種封閉液；
[0033]E用前述第二種封閉液對前述完成第一次封閉的硝酸纖維素膜進行溫度37°C持續時間I小時的第二次封閉；
[0034]F棄去前述第二種封閉液，完成封閉過程。
[0035]如圖1所示，1-5列是5份Ul-nRNP陽性樣本檢測結果，6_10列是5份Ul-nRNP陰性樣本檢測結果。A行是使用本發明實施例封閉後的檢測結果，B行是使用現有技術封閉後的檢測結果。陰性樣本斑塊中間應無顯色條帶，陽性樣本斑塊中間應有顯色條帶，並且條帶顏色越深樣本的陽性程度越強。另外，斑塊背景顏色深，說明出現一定程度的非特異顯色，封閉效果不理想。由附圖可以清楚地看出，經過本發明實施例封閉後的檢測結果斑塊背景顏色淺，陰性樣本沒有出現非特異顯色現象。而現有技術封閉後的檢測結果斑塊背景顏色深，5份陰性樣本中有2份出現弱的非特異顯色條帶。結果說明，本發明實施例的封閉方法可有效地降低非特異顯色現象，提升了酶聯免疫斑點技術產品檢測結果的準確性。
[0036]實施例2:
[0037]A配製第一種封閉液，具體配製方法為配製含有聚乙二醇終濃度為2%的0.02mol/L Tris-Hcl 緩衝液，pH7.2 ；
[0038]B配製第二種封閉液，具體配製方法為配製含有牛血清白蛋白和酪氨酸終濃度各為 1% 的 0.02 mol/L Tris-Hcl 緩衝液，ρΗ7.2 ；
[0039]C用前述第一種封閉液對包被有SS-A抗原的硝酸纖維素膜進行溫度37°C持續時間3小時的第一次封閉；
[0040]D棄去前述第一種封閉液；
[0041]E用前述第二種封閉液對前述完成第一次封閉的硝酸纖維素膜進行溫度37°C持續時間2小時的第二次封閉；
[0042]F棄去前述第二種封閉液，完成封閉過程。
[0043]如圖2所示，11-15列是5份SS-A陽性樣本檢測結果，16-20列是5份SS-A陰性樣本檢測結果。C行是使用本發明實施例方法封閉後的檢測結果，D行是使用現有技術封閉後的檢測結果。陰性樣本斑塊中間應無顯色條帶，陽性樣本斑塊中間應有顯色條帶,並且條帶顏色越深樣本的陽性程度越強。另外，斑塊背景顏色深，說明出現一定程度的非特異顯色，封閉效果不理想。由附圖可以清楚地看出，經過本發明實施例封閉後的檢測結果斑塊背景顏色淺，陰性樣本沒有出現非特異顯色現象。而現有技術封閉後的檢測結果斑塊背景顏色深，5份陰性樣本中有2份出現弱的非特異顯色條帶。結果說明，本發明實施例封閉方法可有效地降低非特異顯色現象，提升了酶聯免疫斑點技術產品檢測結果的準確性。
[0044]本發明實施例中未進行說明的內容為現有技術，故，不再進行贅述。
[0045]本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法的優點:主要是克服現有技術產品存在的部分非特異顯色現象。該方法是採用兩次封閉的技術方案，首先使用第一種非蛋白質封閉液進行第一次封閉，非蛋白質封閉液的優點是可以避免產生交叉反應，單獨使用非蛋白質封閉液可以使其最高效率地吸附在硝酸纖維素膜表面，然而其較大的分子量會使封閉後的硝酸纖維素膜仍然殘留有部分間隙，這些間隙可以導致非特異結合的發生，因此在第一次封閉後用含有較低分子量蛋白質和胺基酸的第二種封閉液進行第二次封閉，以徹底覆蓋第一次封閉後殘留的間隙。這樣就形成了以第一次封閉為主，以第二次封閉為輔的兩次封閉方法。本發明提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法與現有技術同時使用蛋白質封閉液和非蛋白質封閉液的一次封閉方法相比，避免了多種成分同時存在時與硝酸纖維素膜的競爭吸附現象，最大程度地保證了非蛋白質封閉液在硝酸纖維素膜上的吸附，充分地發揮了其避免產生交叉反應的優點，同時又通過第二次封閉的方法彌補了其殘留間隙的缺點。
[0046]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明作任何形式上的限制，凡是依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。
【權利要求】
1.一種提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其特徵在於，包括以下步驟: (I)用基礎緩衝液配製含有非蛋白質封閉組分的第一種封閉液；(2)用與步驟(I)相同的基礎緩衝液配製含有蛋白質和胺基酸的第二種封閉液；(3)用前述第一種封閉液在溫度37°C條件下對包被有抗原的硝酸纖維素膜進行第一次封閉；(4)棄去第一種封閉液；(5)用前述第二種封閉液在溫度37°C條件下對前述完成第一次封閉的硝酸纖維素膜進行第二次封閉；(6)棄去第二種封閉液，完成封閉過程。
2.根據權利要求1所述的提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其特徵在於，所述配製第一種封閉液使用的基礎緩衝液為磷酸鹽緩衝液或者Tris-Hcl緩衝液；所述非蛋白質封閉組分為聚乙烯醇或聚乙二醇，該非蛋白質封閉組分的加入濃度為2±0.5%。
3.根據權利要求1所述的提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其特徵在於，所述配製第二種封閉液使用的基礎緩衝液為磷酸鹽緩衝液或者Tris-Hcl緩衝液；所述蛋白質為低分子量蛋白質，該低分子量蛋白質為酪蛋白或者牛血清白蛋白，且低分子量蛋白質的加入濃度為1±0.5% ;所述胺基酸為酪氨酸，該胺基酸的加入濃度為1±0.5%。
4.根據權利要求1所述的提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其特徵在於，所述硝酸纖維素膜的包被抗原優選Ul-nRNP或者SS-A。
5.根據權利要求1所述的提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法，其特徵在於，所述第一次封閉的時間為2至3小時；所述第二次封閉的時間為I至2小時。
6.權利要求1所述提高酶聯免疫斑點技術的特異性膜封閉方法在酶聯免疫斑點技術中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK104345151SQ201310343750
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月8日 優先權日:2013年8月8日
【發明者】孫正剛 申請人:北京和傑創新生物醫學科技有限公司