凍幹型血小板抗原譜細胞的製備方法

2023-12-09 07:05:46

專利名稱：凍幹型血小板抗原譜細胞的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。
背景技術：
血小板抗體是由異體或自身血小板抗原作用機體產生的，包括同種異體抗體、自 身抗體、同種抗體、藥物依賴性抗體和非特異性抗體五類，這些抗體作用於人體血小板可 導致血小板發生破壞並引起胎母同種異體免疫血小板減少症(FMAIT)、血小板輸注無效症 (PTR)、輸血後紫癜(PTP)等多種血小板免疫疾病。準確、快速、簡便的檢測和鑑定出血小板抗體對血小板免疫性疾病的診斷、治療等 方面起著重要的作用。然而，目前國際上尚缺乏標準化的血小板抗原譜細胞供臨床常規檢 測應用，主要原因是血小板在液態環境下極易發生聚集並丟失其抗原性。目前各實驗室在 檢測血小板抗體時只能採用自行製備的血小板抗原，因為不知道血小板的抗原，導致同一 份樣本在各實驗室檢測的結果很難一致。另外隨機選用的血小板進行血小板抗體檢測時極 易造成血小板抗體的漏檢，導致錯誤的檢測和診斷結果。

發明內容
本發明的目的是為了解決臨床缺乏血小板抗原譜細胞，易出現抗體漏檢和不能確 定抗體特異性的問題，組建ΗΡΑ-Γ6，15基因分型的血小板抗原譜細胞系，可廣泛應用於血 小板抗體的檢測和特異性鑑定的凍幹型血小板抗原譜細胞的製備方法。本發明步驟是
a、血小板抗原ΗΡΑ-Γ6和HPA-15系統基因分型的檢測
採集獻血員EDTA抗凝全血，通過鹽析法提取DNA，其純度應在1. 6以上；對獻血員樣本 進行HPA-廣6，15系統進行基因分型，擴增條件如下95°C預變性5min後，95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s，30 個循環，72°C延伸 5min ；
b、組建血小板抗原譜細胞系
血小板抗原譜細胞根據0型獻血員的血小板抗原分型結果建立10組HPA-廣6，15系統 的抗原譜，其抗原分型見表1 ；
c、血小板懸液的製備採集篩選好的10名獻血員新鮮EDTA抗凝全血，900rpm離心 30min ；取上層富血小板血漿，3000rpm離心30min ；棄血漿，用凍幹保護液充分懸浮壓積血 小板，並調節血小板濃度為10(T150X107L ；
d、負載將血小板懸液置於37°C恆溫箱中負載4h，期間每隔30min振蕩混勻一次；
e、冷凍乾燥將負載後的血小板懸液分裝後，置於凍幹機中進行冷凍乾燥；其凍幹條 件見表2。本發明凍幹保護液包括0. 2M pH7. 0 PBS，0. 2M pH7. 0 PBS中含30 50 mmol/L的 海藻糖和廣3%的牛血清白蛋白。本發明將凍幹型血小板抗原譜細胞用生理鹽水溶解後，用來進行血小板抗體檢測及特異性鑑定實驗。本發明的優點用基因分型的0型血獻血員的血小板製備成穩定的血小板抗原譜 細胞凍幹品，為臨床提供可長期保存的抗原，防止臨床漏檢血小板抗體，也使得血小板抗體 檢測和鑑定易於常規化，標準化。本發明關鍵在於檢測0型獻血員HPA-廣6，15基因分型，根據分型的結果建立血小 板抗原譜。HPA基因分型的血小板抗原譜細胞，經冷凍乾燥製備成抗原性穩定的凍幹品，在 血小板抗體檢測時可確定抗體的特異性，同時解決了血小板抗原難以穩定保存的難題。


圖1是本發明固相凝集法反應格局圖----------陽性；
圖2是本發明固相凝集法反應格局圖----------弱陽性；
圖3是本發明固相凝集法反應格局圖----------陰性。
具體實施例方式本發明步驟是
a、血小板抗原ΗΡΑ-Γ6和HPA-15系統基因分型的檢測
採集獻血員EDTA抗凝全血，通過鹽析法提取DNA，其純度應在1. 6以上；對獻血員樣本 進行HPA-廣6，15系統進行基因分型，擴增條件如下95°C預變性5min後，95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s，30個循環，72°C延伸5min ；電泳後用凝膠成像系統觀察並記錄結果。b、組建血小板抗原譜細胞系
HPA是血小板上特異性抗原，具有多態性。在血小板輸血、妊娠、移植時易造成產生相應 抗體並引起相關的血小板相關免疫性疾病。血小板抗原譜細胞根據0型獻血員的血小板抗原分型結果建立10組HPA-廣6，15 系統的抗原譜，其抗原分型見表1 ；
表1. 10組血小板抗原譜細胞的HPA-廣6，15系統的抗原分型
權利要求
一種凍幹型血小板抗原譜細胞的製備方法，其特徵在於a、血小板抗原HPA 1~6和HPA 15系統基因分型的檢測採集獻血員EDTA抗凝全血，通過鹽析法提取DNA，其純度應在1.6以上；對獻血員樣本進行HPA 1~6，15系統進行基因分型，擴增條件如下95℃預變性5min後，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 50s，30個循環，72℃延伸5min ；b、組建血小板抗原譜細胞系血小板抗原譜細胞根據O型獻血員的血小板抗原分型結果建立10組HPA 1~6，15系統的抗原譜，其抗原分型見表1； c、血小板懸液的製備採集篩選好的10名獻血員新鮮EDTA抗凝全血，900rpm離心30min；取上層富血小板血漿，3000rpm離心30min；棄血漿，用凍幹保護液充分懸浮壓積血小板，並調節血小板濃度為100~150×109/L ；d、負載將血小板懸液置於37℃恆溫箱中負載4h，期間每隔30min振蕩混勻一次；e、冷凍乾燥將負載後的血小板懸液分裝後，置於凍幹機中進行冷凍乾燥；其凍幹條件見表2。
2.權利要求1所述的凍幹型血小板抗原譜細胞的製備方法，其特徵在於凍幹保護液 包括0. 2M pH7. 0 PBS，0. 2M ρΗ7· 0 PBS中含30 50 mmol/L的海藻糖和Γ3%的牛血清白蛋白。
3.權利要求1所獲得凍幹型血小板抗原譜細胞的用途，其特徵在於將凍幹型血小板 抗原譜細胞用生理鹽水溶解後，用來進行血小板抗體檢測及特異性鑑定實驗。
全文摘要
一種凍幹型血小板抗原譜細胞的製備方法，屬於生物技術領域。本發明的目的是為了解決臨床缺乏血小板抗原譜細胞，易出現抗體漏檢和不能確定抗體特異性的問題，組建HPA-1~6，15基因分型的血小板抗原譜細胞系，可廣泛應用於血小板抗體的檢測和特異性鑑定的凍幹型血小板抗原譜細胞的製備方法。本發明步驟是a、血小板抗原HPA-1~6和HPA-15系統基因分型的檢測；b、組建血小板抗原譜細胞系；c、血小板懸液的製備；d、負載；e、冷凍乾燥。本發明關鍵在於檢測O型獻血員HPA-1~6,15基因分型，根據分型的結果建立血小板抗原譜。HPA基因分型的血小板抗原譜細胞，經冷凍乾燥製備成抗原性穩定的凍幹品，在血小板抗體檢測時可確定抗體的特異性，同時解決了血小板抗原難以穩定保存的難題。
文檔編號G01N33/531GK101957364SQ201010285608
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月19日 優先權日2010年9月19日
發明者孔維臣, 楊文衝, 段生寶, 童軍, 邰慧波, 鞠海英 申請人:李勇