六甲蜜胺脂質體及其製備方法
2023-12-09 02:12:36 3
專利名稱：六甲蜜胺脂質體及其製備方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，涉及抗腫瘤藥物六甲蜜胺的脂質體製劑及六 甲蜜胺脂質體的製備方法。
背景技術：
六甲蜜胺(Altretamine, Hexamethytmelamine, H固)是需要代謝活化
的細胞毒類抗腫瘤藥物，其代謝中間產物可作為烷化劑而產生抗腫瘤作用。 然而六甲蜜胺與傳統的烷化劑並沒有交叉耐藥。近幾年來的臨床研究發現, 六甲蜜胺對卵巢癌、肺癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤有肯定的治療效果，特別 是對晚期卵巢癌的研究，發現六甲蜜胺具有較好的臨床應用價值。
六甲蜜胺的抗腫瘤作用機制，目前並不完全清楚。藥理研究表明，此 藥為嘧啶類抗代謝藥物，可以抑制二氫葉酸還原酶，幹擾葉酸代謝，選擇 性抑制DNA、 RNA以及蛋白質的生物合成。大多數作者認為，六甲蜜胺在體 內實驗中並沒有顯示烷化劑的活性，其N-去甲基中間代謝產物可作為烷化 劑而發揮抗腫瘤作用。臨床證明，對烷化劑產生耐藥的患者，對六甲蜜胺 仍然有反應，提示六甲蜜胺與烷化劑之間沒有交叉耐藥性。六甲蜜胺具有 脂溶性的特點，它的水溶性差，因此現在臨床上一般只能口服。口服六甲 蜜胺後，血液中藥物濃度在1~3小時後達到高峰，在血漿中的半衰期為 13小時。六甲蜜胺的組織濃度在脂肪組織中最高。腫瘤原發部位的濃度與 血漿中的濃度相似，而六甲蜜胺在轉移瘤中的濃度高於原發瘤，直徑小於 3cm的轉移瘤中的濃度是直徑大於3cm的轉移瘤的2 10倍。六甲蜜胺在 肝內經過N-去甲基化後，發生一系列代謝反應，代謝產物主要由尿排出。
近幾年來，六甲蜜胺單藥治療復發或耐藥的卵巢癌的研究較多，均取 得了較好的療效，顯示出六甲蜜胺在卵巢癌的二線治療中較樂觀的應用前 景。一經過鉑類化療藥治療後，復發的卵巢癌按復發時間可分為兩種情況， 治療6個月以後復發的稱為對鉑類藥敏感；治療6個月以內復發或治療過 程中腫瘤進展的稱為鉑類耐藥。對於這些產生耐藥的卵巢癌患者，六甲蜜 胺、異環磷醯胺、拓撲特肯鬼臼乙叉甙和阿黴素脂質體均有較好的療效， 而獲得美國FDA批准的只有六甲蜜胺和拓撲特肯兩種。
六甲蜜胺在服用中會產生一些毒副作用，包括①胃腸道反應，這是 六甲蜜胺的主要劑量限制性毒性，發生率為33%~75%,其中嚴重的嘔吐發 生率約為2%。與其他化療藥物聯合使用嘔吐發生率更高。②血液學毒性， 口服六甲蜜胺l周后，血象有可能開始下降，3~4周下降到最低點，1~2 級白細胞的發生率為5%~32%， 1~2級血小板減少症的發生率為9%左右，中 度貧血的發生率為33%。③神經毒性，5%~31%的患者服藥後會有周圍神經
的異常，有的還會出現頭昏、眩暈等，主要出現在連續用藥3個月以上的患 者中。與順鉑聯合用藥時，神經毒性的發生率可達47%。 口服六甲蜜胺的其
它毒副作用有嗜睡、虛弱、疲勞和厭食等。
脂質體(liposome)作為近年來研究較為廣泛的一種藥物載體，其主 要特點是可以保護被包封藥物，增加藥物穩定性，改變藥物在體內的分布 行為，攜載藥物被動或主動靶向到病變部位。近年來隨著生物技術的發展, 各種不同的脂質體藥物轉運系統也逐漸被設計、建立，例如長循環脂質體、 靶向脂質體、PH敏感脂質體、熱敏脂質體、磁敏脂質體等，脂質體的製備 工藝也更加成熟、完善。脂質體的研究愈來愈受到重視，且發展迅速，其 誘人的巿場前景和良好的技術性已經滲透到製藥、生物技術、免疫調節、 基因藥物、化妝品開發等各個領域。
脂質體作為先進藥物載體應用於臨床主要優勢體現在①增強藥物的 溶解性；②降低藥物毒性；③賦予藥物靶向性；④增加藥物的緩釋作用； ⑤提高對藥物的保護作用；⑥通過融合作用將藥物送入細胞漿或細胞核中。 從1988年第一個脂質體藥物在美國進入臨床試驗，到目前世界上已有多
種脂質體藥物工業化生產並上巿銷售，如脂質體阿黴素、脂質體柔紅黴素、 脂質體兩性黴素、脂質體A肝疫苗和脂質體B肝疫苗等。而且經過幾十年 的不斷努力，脂質體傳遞技術也從最初的普通脂質體發展為長效脂質體、 靶向脂質體和智能脂質體作為抗癌藥物載體，脂質體具有能增加與癌細胞 的親和力、克服耐藥性、增加藥物被癌細胞的攝取率，降低用藥劑量，提 高療效和降低毒副作用等特點，脂質體化療藥物製劑理所當然的成為當今 研究的熱點。
目前國外上巿的脂質體抗癌藥物有PEG長循環脂質體(Caelyx)、長 循環阿黴素脂質體(Doxil)、常規阿黴素脂質體(Evacet, Myocet )、柔 紅黴素脂質體(DaunoXome)和阿糖胞苷脂質體(DepoCyt)。還有約30種
脂質體抗癌藥物正在臨床試驗或等待批准上巿。
六甲蜜胺為脂溶性藥物，可以插在脂質雙層膜之間，進而將其在水中 增溶，同時脂質體包裹藥物可降低藥物的毒副作用，還可以增加藥物分子 在腫瘤部位的分布，減少其對其他正常組織的毒性。六甲蜜胺主要經肝臟 代謝，並代謝成同樣有藥理活性的代謝產物，將其脂質體製劑製成適當粒 徑，可使其富集於巨噬細胞豐富的肝臟。將六甲蜜胺製成脂質體給藥，可 以提高藥物的穩定性，增強靶向性，適當延緩藥物釋放，具有較高的應用 價值。
發明內容
本發明的目的是為了解決六甲蜜胺水不溶性和毒副作用而製備了六甲
蜜胺脂質體。
本發明也相應提供了六甲蜜胺脂質體的製備方法。 本發明通過以下措施實現
六甲蜜胺脂質體的配方包括六甲蜜胺、磷脂、膽固醇以及殼聚糖的 重量比為l: 5-80: 0-20: 0-30，並含有適量抗氧劑和緩衝鹽。
本發明中所述的磷脂採用現已上巿的商品磷脂，包括天然提取的磷脂, 或者半合成或者全合成的磷脂，或者天然磷脂和半合成或全合成磷脂的混 合物。
本發明中所述的商品天然磷脂源於大豆、蛋黃、動物腦或臟器中的天 然磷脂。
本發明中所述的商品半合成活全合成磷脂包括二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷 脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、二 鯨蠟磷酸酯、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二月桂醯磷 脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯膽鹼。
本發明中所述的殼聚糖包括分子量為1000-1000000的水溶性脫乙醯基 甲殼素、殼聚糖鹽酸鹽、氯化殼聚糖、殼聚糖寡糖、類透明質酸殼聚糖。
本發明中所述的抗氧劑為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫 酸鈉、抗壞血酸、沒食子酸丙酯、抗壞血酸棕櫚酸酯、叔丁基對羥基茴香 醚、二叔丁基對甲酚、維生素E、半胱氨酸、蛋氨酸中的一種或一種以上 混合物；丁羥基茴香醚、丁羥基甲苯、硫二丙酸、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、 二碌代氨基苯甲酸類、抗壞血酸、枸櫞酸、蘋果酸、山梨醇、甘油、丙二 醇、抗壞血酸棕櫚酸酯、氫醌、羥基香豆素、維生素E、乙醇胺、磷酸及 其鹽、亞磷酸及其鹽中的一種或幾種。
本發明中所述的緩衝液為乙醇-醋酸緩衝液、三羥甲基氨基甲烷緩衝液、 巴比妥緩衝液、甲酸鈉緩衝液、鄰苯二甲酸鹽緩衝液、枸櫞酸鹽緩衝液、 枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩衝液、氨-氯化銨緩衝液、硼砂-氯化鈣緩衝液、醋酸 鹽緩衝液、醋酸-鋰鹽緩衝液、醋酸-醋酸鈉緩衝液、醋酸-醋酸銨緩衝液、 磷酸-三乙胺緩衝液、磷酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液等，且pH範圍為3-10。
一種六甲蜜胺脂質體的製備方法，其特徵在於經下述步驟製備，
1)按重量比取六甲蜜胺l份與磷脂5-80份及膽固醇0-20份，溶於氯 仿和/或甲醇溶劑中，除去溶劑；再加入pH6-8的磷酸鹽緩衝液；形
-成脂質體混懸液，勻化；加入等體積殼聚糖0-30份的溶液或者
2 )按重量比取六曱蜜胺1份與磷脂5-80份及膽固醇0-20份，溶於低 極性有機溶劑中，混合入pH6-8的磷酸鹽緩衝液中；除去有機溶劑； 形成脂質體混懸液，勻化；加入等體積殼聚糖0-30份的溶液或者
3)按重量比取六甲蜜胺1份與磷脂5-80份及膽固醇0-20份，加入 pH6-8的磷酸鹽緩衝液中，混合乳化，勻化；加入等體積殼聚糖0-30 份的溶液。
較好的六甲蜜胺脂質體的製備方法，其特徵在於
1) 按重量比取六甲蜜胺1份與磷脂20-60份及膽固醇5-10份，溶於 氯仿和/或甲醇溶劑中，加熱除去溶劑；再加入pH7-8的磷酸鹽緩 衝液；形成脂質體混懸液，勻化；加入等體積殼聚糖10-20份的溶 液或者
2) 按重量比取六甲蜜胺l份與磷脂20-60份及膽固醇5-10份，溶於 乙醇和/乙醚中，混合入pH7-8的磷酸鹽緩衝液中；減壓除去有機溶 劑；形成脂質體混懸液，勻化；加入等體積殼聚糖10-20份的溶液 或者
-3)按重量比取六甲蜜胺l份與磷脂20-60份及膽固醇5-10份，加入 pH7-8的磷酸鹽緩衝液中，混合乳化，勻化；加入等體積殼聚糖10-20 份的溶液。
本發明的脂質體可用薄膜分散法、逆向蒸發法、高壓乳勻法、注入法、 pH梯度法等方法製備。
本發明六甲蜜胺脂質體的配方與工藝可使脂質體達到較高的包封率， 且在放置過程中粒徑均一穩定，不易沉降聚集，提高了脂質體液體製劑的 貯存穩定性。
圖1為六甲蜜胺脂質體大鼠體內藥動學經時曲線圖。
具體實施方式
一實施例1
稱取10mg六甲蜜胺、400mg大豆嫌脂(純度>90%磷脂醯膽鹼)和20mg 膽固醇溶解於氯仿/甲醇(1: 0-2)混合溶劑中，將該溶液置於磨口圓底燒 瓶中，於35-45。C恆溫水浴上用旋轉蒸發儀在50rpm並減壓條件下蒸去有
機溶劑，使藥物和磷脂等在燒瓶底部形成一均勻類脂膜，置於真空乾燥箱 內繼續除有機溶劑(4-12h),再將5mLpH7.4的磷酸鹽緩衝液加入上述圓底 燒瓶中，在4(TC下旋轉蒸發水化脂膜，直至瓶壁上的薄膜全部水化脫落形 成乳白色脂質體混懸液，通過擠出儀擠出勻化減小粒徑(微孔濾膜0.22n m, 5次)。將含200mg殼聚糖的溶液等體積與上述脂質體混懸液混合，並 再次擠出即得。
將該脂質體在室溫(20-25°C)貯存3個月後，包封率仍在80U乂上， 粒徑變化微小仍為200nm左右，再用緩衝鹽溶液稀釋無沉澱析出。
實施例2
稱取lOmg六甲蜜胺、400mg大豆磷脂(純度〉90°/。磷脂醯膽鹼)和20mg 膽固醇溶解於乙醇中，同時將5mLpH7.4磷酸鹽緩衝液置於三頸瓶中，於 4(TC恆溫水洛上保溫，在磁力攪拌下緩緩將有機相注入到水相中，形成的 乳白色混懸液在50rpm撹拌4(TC恆溫水洛減壓條件下蒸去有機溶劑，待有 機溶劑除淨，通過擠出儀擠出勻化減小粒徑(微孔濾膜0.22Mm, 5次)。 將含200mg殼聚糖的溶液等體積與上述脂質體混懸液混合，並再次擠出即 得。
將該脂質體在室溫(20-25°C)貯存3個月後，包封率仍在80。/。以上， 粒徑變化微小仍為200nm左右，再用緩衝鹽溶液稀釋無沉澱析出。 實施例3
稱取10mg六甲蜜胺、400mg大豆磷脂(純度>90°/。磷脂醯膽鹼)和20mg 膽固醇溶解於乙醚中，將該溶液置於磨口圓底燒瓶中，同時加入少量pH7.4 磷酸鹽緩衝液，於35-45。C恆溫水洛上用旋轉蒸發儀在lQrpm條件下蒸有 機溶劑，待呈凝膠態物質時，向圓底燒瓶中加入其餘PH7.4的磷酸鹽緩衝 液^化，得乳白色脂質體混懸液，通過擠出儀擠出勻化減小粒徑(微孔濾 膜0.22nm， 5次)。將含200mg殼聚糖的溶液等體積與上述脂質體混懸液
混合，並再次擠出即得。
將該脂質體在室溫(20-25°C)貯存3個月後，包封率仍在80%以上， 粒徑變化微小仍為200nm左右，再用緩衝鹽溶液稀釋無沉澱析出。
實施例4
六甲蜜胺脂質體穩定性考察，通過測定脂質體在室溫下存放的包封率 及粒徑來評價其穩定性，有關數據如下
l個月2個月3個月4個月5個月6個月
包封率89. 388. 988. 288. 087. 586. 8
(%).-
粒 徑183183184. 5186188. 4191
(nm)
可見，六甲蜜胺脂質體具有較好的穩定性。
實施例5
__六甲蜜胺脂質體大鼠體內藥動學考察 將15隻清潔級大鼠按體重隨機分為三組，分別為原料藥混懸液U),普 通脂質體組(B),殼聚糖包覆的脂質體組(C),灌胃前禁食12小時(飲水 自由)。三組大鼠分別給藥後於min眼眶取血O. 5mL,置肝素抗凝化離心管 中，離心(3000rpm， 10min)分離血漿樣本，處理過的血樣用HPLC測定其
藥物濃度，得經時曲線如附圖1。
有關藥動參數如下
AUC (p g，min'm1/1)CL (mL*min_1)
■460 ±3382 ±1
普通H畫脂質體584±5163±7
殼聚糖包H醒脂質體649 ±5451±權利要求
1、六甲蜜胺脂質體，其特徵在於，處方中各組分組成比例如下六甲蜜胺、磷脂、膽固醇以及殼聚糖的重量比為1∶5-80∶0-20∶0-30，並含有適量抗氧劑和緩衝鹽。
2、 根據權利要求l所述的六甲蜜胺脂質體，其特徵在於所述的磷脂 釆用現已上巿的商品磷脂，包括天然提取的磷脂，或者半合成或者全合成 的磷脂，或者天然磷脂和半合成或全合成磷脂的混合物。
3、 根據權力要求2所述的六甲蜜胺脂質體，其特徵在於所述的商品天然磷脂源於大豆、蛋黃、動物腦或臟器中的天然磷脂。
4、 根據權利要求2所述的六甲蜜胺脂質體，其特徵在於所述的商品半合成、全合成磷脂包括二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌 醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、二鯨蠟嫌酸酯、二肉豆蔻 醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二月桂醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂
5、 根據權利要求1所述的六甲蜜胺脂質體，其特徵在於所述的殼聚 糖為分子量為1000-1000000的水溶性脫乙醯基甲殼素、殼聚糖鹽酸鹽、氯 化殼聚糖、殼聚糖寡糖、類透明質酸殼聚糖。
6、 根據權利要求1所述的六甲蜜胺脂質體，其特徵在於所述的抗氧 劑為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、沒食 子酸丙酯、抗壞血酸棕櫚酸酯、叔丁基對羥基茴香醚、二叔丁基對甲酚、 維生素E、半胱氨酸、蛋氨酸中的一種或一種以上混合物；丁羥基茴香醚、 丁羥基甲苯、硫二丙酸、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、二硫代氨基苯甲酸類、 抗壞血酸、枸櫞酸、蘋果酸、山梨醇、甘油、丙二醇、抗壞血酸棕櫚酸酯、 氫醌、羥基香豆素、維生素E、乙醇胺、磷酸及其鹽、亞磷酸及其鹽中的 一種或幾種。
7、 根據權利要求1所述的六甲蜜胺脂質體，其特徵在於所述的緩衝 液為乙醇-醋酸緩衝液、三羥甲基氨基甲烷緩衝液、巴比妥緩衝液、甲酸鈉 緩衝液、鄰苯二甲酸鹽緩衝液、枸櫞酸鹽緩衝液、枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩衝 液、氨-氯化銨緩衝液、硼砂-氯化鈣緩衝液、醋酸鹽緩衝液、醋酸-鋰鹽緩 衝液、醋酸-醋酸鈉緩衝液、醋酸-醋酸銨緩衝液、磷酸-三乙胺緩衝液、磷 酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液等，且pH範圍為3-10。
8、如權利要求l所述的六甲蜜胺脂質體的製備方法，其特徵在於經 下述步驟製備，J)按重量比取六甲蜜胺l份與磷脂5-80份及膽固醇0-20份，溶於氯仿和/或甲醇溶劑中，除去溶劑；再加入pH6-8的磷酸鹽緩衝液；形 成脂質體混懸液，勻化；加入等體積殼聚糖0-30份的溶液或者2) 按重量比取六甲蜜胺l份與磷脂5-80份及腳固醇0-20份，溶於低 極性有機溶劑中，混合入pH6-8的磷酸鹽緩衝液中；除去有機溶劑； 形成脂質體混懸液，勻化；加入等體積殼聚糖0-30份的溶液或者3) 按重量比取六甲蜜胺l份與磷脂5-80份及膽固醇0-20份，加入 pH6-8的磷酸鹽緩衝液中，混合乳化，勻化；加入等體積殼聚糖0-30 份的溶液。
9、如權利要求l所述的六甲蜜胺脂質體的製備方法，其特徵在於 1)按重量比取六甲蜜胺l份與磷脂20-60份及膽固醇5-10份，溶於氯 仿和/或甲醇溶劑中，加熱除去溶劑；再加入pH7-8的磷酸鹽緩衝液；形 成脂質體混懸液，勻化；加入等體積殼聚糖10-20份的溶液或者 2一)按重量比取六甲蜜胺1份與磷脂20-60份及膽固醇5-IO份，溶於乙醇和/乙醚中，混合入pH7-8的磷酸鹽緩衝液中；減壓除去有機溶劑；形成脂質體混懸液，勻化；加入等體積殼聚糖10-20份的溶液或者3)按重量比取六甲蜜胺1份與磷脂20-60份及膽固醇5-10份，加入pH7-8的磷酸鹽緩衝液中，混合乳化，勻化；加入等體積殼聚糖10-20份的溶液。
全文摘要
本發明屬於醫藥技術領域，公開了六甲蜜胺脂質體及其製備方法。六甲蜜胺與磷脂類物質的重量比為1∶5-80份，亦可加入1-20份的膽固醇，0-30份殼聚糖類物質。製備工藝如下取六甲蜜胺與磷脂及膽固醇，溶於溶劑中，除去溶劑；再加入磷酸鹽緩衝液；形成脂質體混懸液；加入等體積殼聚糖的溶液；取六甲蜜胺與磷脂及膽固醇，溶於低極性有機溶劑中，混合入pH6-8的磷酸鹽緩衝液中；形成脂質體混懸液；加入等體積殼聚糖的溶液；按重量比取六甲蜜胺與磷脂及膽固醇份，加入的磷酸鹽緩衝液中，混合乳化；加入等體積殼聚糖份的溶液。將六甲蜜胺包裹入脂質體可降低其毒副作用，並具有肝被動靶向，有利於藥物在肝代謝為活性藥物。
文檔編號A61K9/127GK101176721SQ20071015866
公開日2008年5月14日 申請日期2007年12月3日 優先權日2007年12月3日
發明者鄧英傑, 高曉非 申請人:瀋陽藥科大學