細胞毒性藥物結合物的製作方法

2023-12-09 02:10:56 3

專利名稱：細胞毒性藥物結合物的製作方法
技術領域：
本發明屬於有機化學、免疫學和藥物化學領域，並提供了細胞毒性藥物結合物，它們可用於將細胞毒性藥物定靶施用於需要這種治療的病人。藥物結合物的定靶是通過使用抗體達到的，所述抗體能識別與需用細胞毒性藥物治療的細胞相結合的抗原，從而將細胞毒性藥物傳遞給細胞。本發明還提供了用於合成結合物的中間體。
在醫療實踐中，已經確立了對癌症患者的化療方法。但所用藥物具有細胞毒性，對病人具有顯著的副作用，因此施用時必須極為謹慎。常用的氨甲蝶呤族藥物雖然有效，但特別危險。本發明使用一種特異性的細胞定向抗體，它能將藥物引導至應由該藥物殺傷的細胞，因此減少了患者的危險。由於藥物是定向於特異細胞的，所以減少了在病人體內循環的藥物，因此降低了副作用和總毒性。
本發明提供了具有下式的細胞毒性藥物結合物其中，m是一個從1至大約10的整數;
Ab是一種生理上可接受的抗體或其抗原識別片段，它能識別與不良細胞相結合的抗原;
X是具有下式的連接基團
R是氫、苯基、或由一個或兩個硝基、滷素、氰基或三氟甲基取代的苯基，Ar是
R1是氫、氨基、氨基-C1-C4烷基、羥基-C1-C4烷基或胍基-C1-C4烷基;
R2是(CH2)n，
n是0至5的整數;
M是具有下式的氨甲蝶呤藥物
R3是
、S或O;
R4是CO、SO2、CO-(CH2)s或CO-NH;
R5是氫或C1-C3烷基;
s是1或2;
Z是
t是1-6的整數;
u是1-22的整數;
R6是羥基或一個構成生理上可接受的鹽的半分子。
本發明還提供了一系列具有下式的衍生抗體Ab[CO-X＝R8]m其中，R8是O、(OCH3)2或(OCH2CH3)2，X和m的意義如上所述。
本發明還提供了控制不良細胞生長的方法，該方法包括給病人腸道外施用本發明的結合物;還提供了含有本發明結合物的藥物組合物，其中的結合物分散於可非腸道施用的介質中。
本發明還提供了製備式Ⅰ結合物的方法，該方法包括使上述衍生抗體與化學式為H2NHN-M的藥物醯肼反應。
本發明的藥物結合物由抗體、連接基團和醯肼型的氨甲蝶呤藥物組成。所期望的結合物的治療性質主要是通過連接基團達到的，它被設計成當藥物被抗體傳遞至靶細胞附近後，能夠由抗體釋放氨甲蝶呤藥物。下面將分別討論結合物的三個主要成分，然後說明結合物的合成，最後給出結合物合成及生物測試的實例。
抗體結合物中抗體部分的基本性質是它能夠識別與不良細胞結合的抗原。應當知道，氨甲蝶呤藥物對許多種細胞都有高度的細胞毒性，並且當它們內在化至靶細胞中後，這些藥物能表現其總藥效。因此，在用氨甲蝶呤藥物殺傷或控制細胞時，優先選擇能識別這些細胞、與之結合併能被細胞內在化的抗體。
抗體的來源對於本發明不是關鍵的，可以從任一類或亞類的免疫球蛋白中選擇，包括IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。同樣，抗體來源的生物種也不是關鍵的，只要抗體能定靶於氨甲蝶呤藥物對其有效的細胞就行。
在現有技術中，藥物結合物中主要使用單克隆抗體，本發明也優先使用單克隆抗體。但並不排除多克隆抗體。一種更新型的抗體是嵌合抗體，它是通過重組技術在實驗室中製備的，該技術能夠表達修飾的DNA，該DNA編碼任意所需抗體的抗原結合區，還編碼其他任意所需胺基酸順序。因此，本發明可以得到並使用其中一部分得自一個種，另一部分得自另一個種的嵌合抗體。
抗體的來源和本質不是關鍵的，只要它能定靶於待治療的細胞，並且本身對病人沒有毒性就行。普通專業人員能很容易地用候選抗體製備結合物並對其作出評價。為方便起見，將提供一些評價抗體和結合物的方法的討論。首先，抗體應當由雜交瘤產生，雜交瘤的穩定性應足以允許製備出一定量的抗體。抗體本身應當能夠經受純化過程，尤其是應當有足夠的水溶性，使其能夠在一定濃度下進行化學操作。
首先評價由候選抗體製備的結合物的抗原結合能力。預計結合能力比游離抗體有所下降，這是可以接受的。然後測試結合物，確定其針對抗原陽性細胞的體外細胞毒性。在同樣的檢測中，有效結合物的細胞毒性可以比游離藥物略低一些。然後，根據Johnson和Laguzza(CancerRes.47∶3118-22，1987)的方法，利用裸鼠人腫瘤異種移植模型，評價通過了前兩項測試的結合物。候選結合物應在裸鼠中與游離藥物、游離藥物和游離抗體的混合物以及藥物與非定靶免疫球蛋白的結合物作對比測試，它相比所有這些都應表現出改進的藥效和安全性。應當在異種移植模型中進行劑量範圍的研究。
用在異種移植模型中有效的結合物進行動物試驗，所用動物已知能表達與人相似類型的所需抗原。在這種試驗中，如果結合物產生明顯程度的抗原結合性，並且在由異種移植模型預測有療效的劑量下沒有明顯的毒性，則可以認為候選結合物有療效。
目前已知的許多抗體都能用於本發明。優選的特異性抗體是L/1C2，它是由寄存於美國典型培養物收集中心(ATCC，Rockville，MD.)的HB9682號雜交瘤產生的。
由ATCC雜交瘤HB21產生的抗體5E9C11識別鐵傳遞蛋白受體，許多腫瘤都表達這種受體。可由國立癌症研究所得到的稱為B72.3的抗體，識別由乳腺癌和結腸癌二者表達的抗原。
OKT3和OKT4這兩種有趣的抗體具有針對非腫瘤抗原的反應活性，它們分別與外周T細胞和人T輔助細胞結合。它們分別由寄存於ATCC的雜交瘤CRL8001和CRL8002產生。
可用於不同治療目的的抗體來源還有下列來源。可用於免疫調節和腫瘤治療的抗人淋巴細胞和單核細胞抗體，它們由ATCC培養物HB2、HB22、HB44、HB78和HB136產生。可用於腫瘤治療的抗鐵傳遞蛋白受體抗體，由ATCC培養物HB84產生。ATCC培養物HB8059產生針對結腸直腸癌單唾液酸神經節苷脂的抗體，培養物HB8136產生針對成熟的人T細胞表面抗原的抗體，它們可用於免疫調節和T細胞白血病的治療。
本領域專業人員很容易確定另一些候選抗體。關於易得抗體的特別有用的資料來源是《Linscott′sDirectoryofImmunologicalandBiologicalReagents》(由Linscott′sDirectory出版，40GlenDrive，MillValley，California94941)。該書的1984年版列出了60多種腫瘤相關單克隆抗體，每種至少有一個商業來源。
應當理解，用本發明的結合物可治療多種不良細胞。眾所周知，氨甲蝶呤藥物具有針對各類癌細胞的活性，癌細胞被認為是由本發明結合物定靶的優選細胞。
尤其是，還可考慮支持惡性腫瘤持續發育的細胞，以及免疫系統中控制抗腫瘤免疫作用發生的細胞。作為靶子的具體類型的癌相關細胞包括鱗狀上皮細胞癌細胞、腺癌細胞、小細胞癌細胞、神經膠質瘤細胞、黑素瘤細胞、腎細胞癌細胞、移行細胞癌細胞、肉瘤細胞、支持腫瘤脈管系統的細胞、以及類淋巴腫瘤如白血病和淋巴瘤的細胞。
但是，氨甲蝶呤藥物對許多其他類型的細胞也有細胞毒性。因此，可通過選擇合適的抗體而用結合物殺傷或調節這種不良細胞，例如被病毒顆粒感染的細胞，被各種有害因子感染的T細胞，以及免疫系統中促進或控制自身免疫疾病發生的細胞。
應當理解，正確選擇的抗體片段具有與完整抗體相同的效應。因此，在實施本發明時，能夠識別待處理細胞結合抗原的抗體片段(優選F(ab′)2片段)，也可象完整抗體一樣使用。
式Ⅰ中沒有給出連接基團與抗體反應和連接的確切機理，對於這一點尚不完全了解。正如下面所證實的那樣，該反應可能是醯化反應，抗體分子上有若干位點可進行醯化反應。在大多數情況下，抗體的醯化反應被認為是在賴氨醯殘基的游離氨基上進行的。但是，醯化反應也能攻擊羥基、酚羥基、咪唑環等，可能還有其他基團。
式Ⅰ表明，每個抗體分子上連有1至大約10個連接基團-藥物半分子。當然，每個抗體分子的這種半分子數目是平均數，因為一批給定的結合物所含的分子必然有不同的藥物-連接基團與抗體的比例。當然，如果每個抗體分子上連有多個藥物分子，則可使昂貴的抗體得到最有效的利用。但是，連接過多數目的藥物-連接基團半分子，通常會對抗體識別和結合其抗原的能力產生不利影響，因此，必須找到一個折衷的m值。一般說來，m的優選值是大約4至大約10，另一優選值是大約3至大約8。
氨甲蝶呤藥物用於本發明結合物中的細胞毒性藥物是氨甲蝶呤、氨基蝶呤或其式Ⅵ衍生物，這些化合物在本文件中統稱為氨甲蝶呤藥物。氨甲蝶呤藥物以醯肼形式使用。沒有指出各種藥物不對稱中心的立體特異型。普通專業人員將會理解，藥物的立體化學可能影響其活性，這一點已在本領域中清楚闡明。在製備本發明結合物的中間體時，優選使用氨甲蝶呤藥物的通常的立體異構體，但式Ⅵ包括所有的立體異構型。
氨甲蝶呤藥物醯肼和連接基團間的連鍵是亞烷基醯肼鍵。但應當理解，此鍵可以其他形式存在於溶液尤其是生理溶液中。雙鍵可以被打開，使官能團或質子與氮或碳原子鍵合。結果，羥基或其他氧連接基團可能連在原有雙鍵的一側，氨基連接基團也可以這樣。水能夠微弱地與其中一個原子鍵合。抗體半分子也能與其中一個原子形成弱鍵，可能發生不止一個這類反應，從而形成混合物。但這種產物是暫時性的，在整個本文件中，結合物將以亞烷基醯肼型進行描述，因為這是其普遍和穩定的形式。
在式Ⅵ中，術語C1-C3烷基包括甲基、乙基、丙基和異丙基，優選甲基或氫。
在式Ⅵ的藥物中可以變化的不同基團將分別予以討論，並將對每一基團給出一些優選限定。應當理解，優選的氨甲蝶呤藥物醯肼是由優選的組成基團構成的，具有相關文獻知識的藥物化學家能夠製備任一種這類藥物醯肼。
R3基團是一個橋鍵基團，它可以是硫、氧、氨基或亞甲基，其中後兩個基團可能被C1-C3烷基取代。典型的這種基團是氨基、亞甲基、甲氨基、丙氨基、1，1-亞丙基和1，1-亞異丁基。優選的R3基團是氨基和甲氨基。
R4基團是橋鍵基團，它可以是羰基、磺醯基、乙醯基、丙醯基或甲醯胺基。在後三個例子中，羰基與Z基團相鄰。最優選的R4基團是羰基，乙醯基和丙醯基也是優選的。
Z基團在其一端有一個氨基，它與R4基團相連;在其另一端有一個羰基或磺醯基，它與＝N-HN基團相連。式Ⅶ的Z基團是由穀氨酸衍生的，當t不是1時，它構成聚穀氨酸殘基。但式Ⅶ中的優選Z基團是t等於1的Z基團。
式Ⅷ的Z基團終止於磺醯基，因此是相應磺酸的殘基。式Ⅷ的基團有一或二個亞甲基，優選二個。
式Ⅸ的Z基團是一個長度可變的胺基酸，它可含有1-22個亞甲基。優選的一類式Ⅸ基團含有1-10個亞甲基，更為優選的是3-8個亞甲基。
最優選的Z基團是式Ⅶ中t等於1的基團，以及式Ⅸ中u是3-8的基團。
在式Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ的基團中，有一個游離或鹽形式的羧基R6。鹽是與任一種能形成生理上可接受的羧酸鹽的半分子形成的。鹼金屬和氫滷酸鹽尤其合適。因此，鈉、鉀和鋰鹽，以及鹽酸、氫溴酸和氫氟酸鹽尤其可用於實施本發明。但也可使用其他藥物化學中可接受的鹽類。例如，可以使用胺鹽如三乙基胺、三乙醇胺、乙基二甲基胺等，還有季銨鹽，包括四烷基銨鹽、(苄基或苯基)三烷基銨鹽等。在銨鹽中，四丁基銨、苄基三甲基銨和四甲基銨鹽是典型的優選鹽類。但藥物化學家總是使用羧酸鹽類，而本發明的鹽類(其中R6是一個能形成鹽的半分子)可用任一種形成生理上可接受鹽的鹼來製備。
衍生式Ⅵ基團所必需的中間體是藥物化學領域已有的，本領域普通專業人員能夠得到任一種中間體。關於氨甲蝶呤藥物的合成，Rahman和Chhabra寫過一篇有益的綜述文章「氨甲蝶呤及其類似物的化學」(MedicinalRes.Rev.8(1)∶95-155，1988)。
連接基團連接基團X是一個有機基團，它的一端與羰基鍵合，另一端與醯肼鍵合。
式Ⅱ中的連接基團是一個亞烷基，其中的(CH2)n部分是例如亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞戊基等。
R基團是氫或苯基，它可被一個或兩個吸電子基團取代。因此，R基團可以是苯基、3-硝基苯基、2，4-二氯苯基、3-溴-5-氟苯基、4-氰基苯基、3-三氟甲基苯基、2-氯-4-三氟甲基苯基、3-硝基-4-三氟甲基苯基等。本文件中所用的術語滷素是指氯、溴和氟。氫是優選的R基團;未取代的苯基是另一個優選的R基團，第三個優選的R基團是單取代的苯基。
式Ⅲ中的基團是一個烷芳基半分子，其中的橋接芳基Ar是苯基或吡咯基。苯基Ar基團連接於間位或對位，優選對位。式Ⅲ基團中的(CH2)n半分子與式Ⅱ中的相應基團相同;因此，如果n是0，則該基團只是一個鍵，它也可以是如上所述的亞烷基。n優選為0，還優選為2-4。
式Ⅳ的基團是一個醯胺鍵合的連接基團，它可含有一個或兩個亞烷基橋。式Ⅳ基團中的亞烷基(CH2)n與上述對式Ⅱ基團所討論的基團相同。設計式Ⅳ基團時，兩個可有可無的亞烷基橋可以分別考慮，也就是說，n在兩種情況中都可以是0，一個可以是0，而另一個可以是1-5的整數，或者二者都可以是1-5的整數。兩個(CH2)n基團都優選n為1-4的亞烷基，更優選n為2-3的亞烷基。
式Ⅴ的基團是一個更為複雜的連有醯胺的基團，通常摻有一個胺基酸半分子。基團(CH2)n與式Ⅱ中討論的同樣基團相似。側基可以是被氨基、羥基或胍基(NH-C(＝NH)-NH2)取代的C1-C4烷基。因此，它包括的基團有例如氨甲基、2-氨基乙基、4-氨基丁基、2-羥基乙基、3-羥基丙基、4-羥基丁基、胍基甲基、2-胍基乙基和4-胍基丁基。R1也可以是氫或氨基。優選的R1基團是氨基、羥甲基、氨基烷基，尤其是4-氨基丁基和胍基烷基，尤其是4-胍基丁基。
基團R2當n為0時是一個鍵，它也可以是1-5個碳原子的亞烷基、苯基或吡咯基。苯基R3基團連接於間位或對位。(CH2)n基團與對式Ⅱ基團所述的相應的亞烷基相同，並可具有相同的意義。
式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ中最優選的連接基團是4-亞苄基、4-甲基亞苄基和2-乙氨基羰基-4-亞苄基。
衍生抗體衍生抗體是合成結合物的中間體，也就是通過與連接基團中間體反應而被修飾的抗體。連接基團終止於羰基或其二(甲基或乙基)縮醛，氨甲蝶呤藥物醯肼在最終步驟中與其反應。因此，連接基團中的X基團在衍生抗體中終止於＝O或(OCH3)2或(OCH2CH3)2。優選羰基形式，但縮醛類也是令人滿意的反應物，方便時也可以使用。
變量X和m在衍生抗體中具有與上述相同的意義。優選的衍生抗體相應於優選結合物，即它們由優選的抗體組成，並結合有連接基團的優選m值，該連接基團由優選X基團構成。
合成用以製備本發明結合物的方法一般說來與目前本領域所用的方法相似。最好首先使連接基團與抗體反應，然後在最終步驟中使連接基團與氨甲蝶呤藥物醯肼反應。這種合成法的優點在於最容易保留氨甲蝶呤藥物的立體特異構型。
因此，合成中最初的一個或多個步驟是製備合適形式的連接基團，使其一端能與抗體反應，另一端能與氨甲蝶呤藥物反應。然後使連接基團連在抗體上以製備衍生抗體，最後使氨甲蝶呤藥物連接於連接基團的羰基或縮醛端。應當理解，只要抗體存在於反應混合物中，則反應必須在適度溫和的條件下進行，以防止抗體的損傷。
合成過程可以圖示如下。
Ab+m[R7-CO-X＝R8]→Ab[CO-X＝R8]mAb[CO-X＝R8]m+m[H2NHN-M]→Ab[CO-X＝N-HN-M]m其中R7是羧酸活化基團;Ab、X、R8和m如上所限定。
在上式中，R7基團從公知的常用於活化羧酸以用作醯化劑的基團中選擇。例如，常用作這種活化基團的有琥珀醯亞胺氧基、苯二甲醯亞氨氧基、甲磺醯氧基、甲苯磺醯氧基、苯磺醯氧基、苯並三唑氧基、氯、溴、迭氮基等。優選的活化基團是琥珀醯亞胺氧基、苯二甲醯亞氨氧基和苯並三唑氧基。
在進行反應時，用常規而易除去的保護基封閉作為側鏈R1取代基一部分的游離氨基。Green所著的《Protective Groups in Organic Synthesis》一書(John Wiley Sons，New York，1981)詳細討論了這種基團。此處所用的基團必須能在相當溫和的條件下除去，以避免損傷抗體。這種保護基是化學家已知的;尤其可用的保護基有乙醯乙酸乙酯、檸康酸酯和二甲基馬來酸乙酯。
連接基團中間產物R7-CO-X＝R8是比較簡單的化合物，它們能夠買到或易於用常規方法製備。這些具有甲醯胺連鍵的連接基團中間體最方便的製備方法是使形成連接基團中間體一端的伯胺與形成該中間體另一端的活化羧酸反應。這種反應可以在室溫和比室溫略高的溫度下，在溫和的鹼性水溶液中進行，在幾小時內即可得到良好的產率。
本發明結合物的各合成步驟能夠以兩種方式進行，即，使進行反應的設備達到最大的生產能力或使產率最高。在大多數(如果不是所有)情形下，反應中抗體本身的費用最大，因此，該反應的最佳化應是使以抗體計算的產率達到最大。因此，確切的最佳操作條件將取決於所用的具體抗體的最大穩定性的條件。因此，最佳操作條件可能要求使用相當過量的氨甲蝶呤藥物，以最大程度地利用抗體，同時使抗體接觸反應混合物的時間縮至最短。
通過使用(例如)二環己基碳二亞胺或其他酯化劑，易於將羧酸活化基團置於連接基團中間體的羧酸上。這種反應在惰性有機溶劑例如二噁烷、四氫呋喃、氯化烴等中進行，並可在大約0-50℃範圍內的適中溫度下進行。下面的「製備」部分進一步說明了連接基團中間體的製備方法。
選擇連接基團中間體與抗體反應的條件時，主要應當考慮的是保持抗體的穩定性。反應必須在其組成對抗體無害的水溶液介質中進行。特別合適的水溶液介質是硼酸緩衝液，其中，硼酸根離子的濃度在大約0.1-0.5摩爾濃度的範圍內。另一種進行反應的合適的水溶液介質是生理緩衝鹽溶液。反應介質的pH應略呈鹼性，在大約7-9的範圍內。雖然反應介質應當是水溶液，但存在少量有機溶劑也不會有害，並可能相當有益。例如，可將連接基團中間體溶於少量有機溶劑例如二甲基甲醯胺、乙腈、四氫呋喃、二噁烷或乙二醇醚中，並將有機溶液加至水溶液介質中的抗體溶液中，這可能是極為有利的。
一般說來，有必要在相對較低的濃度下進行反應，因為抗體的溶解度一般不是很大。例如，抗體濃度通常在每毫升水溶液介質大約5-25毫克的範圍內。
如上所述，有1至大約10摩爾的連接基團和藥物與1摩爾抗體連接。為了達到該結合比例，通常有必要使用過量的連接基團中間體。抗體與活化酯在醯化條件下的反應性有某種程度的可變性，但一般說來，在反應中對於每摩爾抗體使用大約5至大約15摩爾的連接基團中間體。
使醯化反應進行幾分鐘至幾小時，反應溫度範圍為大約0℃至大約40℃。顯而易見，提高溫度可能對抗體有害，更為可取的是在低溫下進行反應，這主要是因為反應本身的速率較快。
製備出結合有連接基團中間體基團的衍生抗體後，可以如下面的實例所述，通過常規方法對反應混合物進行層析，以從未反應的連接基團中間體中分離出衍生抗體。如果不在這時進行純化，則將浪費氨甲蝶呤藥物，因為它將與第一步反應混合物中過量的連接基團中間體反應。
最後使氨甲蝶呤藥物的γ-醯肼與衍生抗體反應，這樣便構成了藥物結合物。這是一個簡單的反應，即由作為連接基團中間體末端基團的酮或醛或其縮醛與藥物醯肼反應。這是一個快速反應，在大約室溫下和水溶液介質中就能正常進行。醯化的抗體最好通過層析純化，用構成氨甲蝶呤藥物反應的良好的反應介質的溶液洗脫，並通過層析進行有效的分離。稀的含水緩衝液對於這兩個目的都是合適的。
例如，特別有用的反應介質是稀的乙酸緩衝液，更有用的是略呈酸性pH的0.1M乙酸鈉，其pH範圍是大約5至大約7。但反應也可在硼酸緩衝液、略呈酸性的磷酸緩衝液、生理緩衝鹽水等中進行，只要其pH略呈酸性就行。如上所述，反應介質中有少量有機溶劑並無害處，只要該溶劑不會損傷抗體就行。
與氨甲蝶呤醯肼進行反應的時間範圍是大約1小時至大約一天。所用的反應溫度在大約0-40℃的範圍內，根據反應混合物中抗體的量選擇能得到最高產率的溫度。
最後，通過常規層析法分離純化本發明的藥物結合物。用生理緩衝鹽水洗脫藥物結合物特別方便。有可能以適於施用於病人的濃度洗脫藥物結合物，但通常有必要通過真空透析來濃縮結合物。
下面的具體「製備」和「實例」進一步說明了本發明藥物結合物的合成。
製備1氨甲蝶呤-γ-醯肼在100ml燒瓶中加入1.61g(10毫摩爾)L-穀氨酸5-甲基酯。在其中加入60ml乙酸叔丁酯，短暫攪拌混合物。然後在充分攪拌下，向其中滴加1.58g(11毫摩爾)70%高氯酸。使混合物在氮氣中攪動兩天，然後用100ml0.5N鹽酸分三部分萃取。合併水層，用30g碳酸氫鈉中和。該中性溶液用總量為150ml的乙醚分三部分萃取，合併有機層並用鹽水洗滌。然後用硫酸鈉乾燥洗過的有機溶液，並於室溫下真空蒸發，得到1.18g(5.4毫摩爾)澄清的油狀物，它被鑑別為L-穀氨酸5-甲基-1-叔丁基二酯。
在烘箱乾燥的100ml燒瓶中加入新從氧化鋇中真空蒸出的0.92ml(6.6毫摩爾)三乙胺、1ml(6.6毫摩爾)氰基膦酸二乙酯和49ml二甲基甲醯胺。在攪拌的溶液中加入506mg(1.3毫摩爾)2，4-二氨基-6-〔N-甲基-N-(4-羧基苯基)氨基〕蝶啶三水合物。當此中間體在攪拌下溶解後，將混合物加熱至80℃，然後在1ml二甲基甲醯胺中加入0.20ml(1.4毫摩爾)三乙胺和342mg上述製備的L-穀氨酸二酯。將混合物於80℃下攪拌2小時，然後冷卻，真空除去溶劑。殘渣用300ml氯仿溶解，並用5%碳酸氫鈉溶液洗滌。用氯仿萃取水層，合併有機層，用硫酸鈉乾燥，真空濃縮，得到1.35g橙色油狀物，在150g矽膠上層析，用10%甲醇的氯仿溶液洗脫。合併含有產品的級分，濃縮後得到645mg氨甲蝶呤二酯，其中，γ-羧基是甲酯形式，而α-羧基是叔丁酯形式。
將上述中間體與另一批中間體合併，總共得到697mg(1.3毫摩爾)，使其溶於12ml甲醇中。在其中加入170mg(5.3毫摩爾)無水醯肼，混合物在室溫下於氮氣中攪拌6天。然後真空除去溶劑，殘渣在150g矽膠上層析，用15%甲醇的氯仿溶液洗脫，得到470mg(0.9毫摩爾)氨甲蝶呤-α-叔丁酯-γ-醯肼。
將上述中間產物溶於120ml1N鹽酸中，於55℃加熱50分鐘。然後真空濃縮成固體，將殘渣溶於80mlpH8的0.01M乙酸銨中。溶液於4℃下貯存3天，然後在300mlSepharoseFastFlowQ(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ)上層析，用上面剛用過的同樣緩衝液(緩衝液A)和pH8的1.0M乙酸銨(緩衝液B)以梯度方式洗脫。合併用100%緩衝液B洗脫出的含有產品的級分，反覆進行冷凍乾燥以去除微量乙酸銨。產率為326mg(0.7毫摩爾)氨甲蝶呤-γ-醯肼。
製備2L/1C2抗體的產生L/1C2雜交瘤的凍幹瓶得自美國典型培養物收集中心，寄存號為HB9682。使小瓶在37℃水浴中旋轉，使其內容物觸化而復原活性胞。然後用平衡鹽溶液(GrandIslandBiologicalCompany(GIBCO)，3175StaleyRoad，GrandIsland，NewYork14072)以1∶2稀釋細胞懸浮液，將懸浮液鋪在血清上離心，使細胞從低溫介質中分離出來。吸出上清液，將沉澱中的細胞在5%二氧化碳中和37℃下懸浮於T75組織培養瓶中的培養基(VentrexHL-1，VentrexLaboratories，Portland，ME)中，該培養基中補充有10%胎牛血清、2mML-穀氨醯胺(GIBCO)和50μg/ml硫酸慶大黴素(GIBCO)。由幾乎匯合的培養物中收集上清液，離心除去殘留的細胞。使無細胞上清液通過蛋白ASepharose柱(Pharmacia)，從中純化出抗體。在pH8.0的0.01M磷酸鈉中，抗體與柱結合，而培養基被洗出。然後用pH3.5的0.1M磷酸鈉緩衝液由柱中洗脫抗體。洗脫出的抗體立即用pH7.4的1MTrizma緩衝液(Sigma，St.Louis，MO)中和，並在裝有pH7.4的0.01M磷酸鈉和0.15M氯化鈉的真空透析儀(Bio-MolecularDynamics，Beaverton，OR)中透析和濃縮。抗體製備物通過0.2μm孔徑過濾滅菌，於4℃貯存備用。
製備33-(4-甲醯基苯基羰基氨基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯在250ml燒瓶中加入100ml二噁烷中的3g(20毫摩爾)4-羧基苯甲醛和2.3g(20毫摩爾)N-羥基琥珀醯亞胺。將混合物攪拌5-10分鐘，然後加入4.1g(20毫摩爾)二環己基碳二亞胺。將混合物在室溫下攪拌1小時，然後過濾。真空蒸發濾液，得到9.4g白色固體，用25ml熱的異丙醇重結晶。用異丙醇研製此中間產物，得到2.1g(8.5毫摩爾)所需的4-羧基苯甲醛的N-琥珀醯亞胺酯。
再另外製備幾批中間體，將總量為10g(40毫摩爾)的N-琥珀醯亞胺酯加至3.6g(40毫摩爾)β-丙氨酸在40ml1N氫氧化鈉和大約100ml水中的溶液中。在pH保持在8以上的條件下攪拌混合物1.5小時。然後過濾混合物，濾液用2N鹽酸調至pH1.9的酸性。用總量為150ml的乙酸乙酯萃取3次，合併有機層並用鹽水洗滌。然後用硫酸鈉乾燥有機層，真空蒸發後得到4.6g(21毫摩爾)白色固體，即3-(4-甲醯基苯基羰基氨基)丙酸。
在一個小燒瓶中加入100mg(0.45毫摩爾)上述中間體、103mg(0.5毫摩爾)二環己基碳二亞胺、57.5mg(0.5毫摩爾)N-羥基琥珀醯亞胺和10ml二噁烷，於室溫下在氮氣中攪拌混合物。通過薄層層析觀察反應進程，再另外加入75mg(0.36毫摩爾)二環己基碳二亞胺和45mg(0.4毫摩爾)N-羥基琥珀醯亞胺。4小時後，過濾反應混合物，將濾液真空蒸發成固體。得到大約200mg不純的產物，在30g矽膠上層析，用5%異丙醇的二氯甲烷溶液洗脫。合併含有產物的級分，蒸發後得到81mg(0.25毫摩爾)所需的不太純的中間體。
製備4抗體L/1C2丙醯基-3-氨基羰基-4-苯甲醛在100ml燒瓶中於室溫下加入1026mg(6.8微摩爾)抗體L/1C2在76.1mlpH8.6的0.34M硼酸緩衝液中的溶液，然後加入在3.3ml乙腈中的14.1mg(44微摩爾)「製備3」得到的活化酯。將混合物在室溫下攪拌1小時。然後在90gSephadexG25(Pharmacia)上層析，用pH5.6的0.1M乙酸鈉洗脫。由紫外分析在258和280nm處監測各級分，合併含有產物的級分，得到948mg(6.3微摩爾)所需產物，產物形式為111.5ml濃度為8.5mg/ml的溶液。衍生抗體的結合比是每摩爾抗體4.8摩爾連接基團。
實例1抗體L/1C2丙醯基-3-氨基羰基-4-苯甲醛與氨甲蝶呤-γ-醯肼的結合物取55.6ml「製備4」的產物，其中含有472mg(3.1微摩爾)衍生抗體。再用87mlpH5.6的0.1M乙酸鈉進行稀釋。
將101mg(216微摩爾)氨甲蝶呤-γ-醯肼溶於7.2ml乙腈和21.6ml1M磷酸二氫鉀緩衝液中。在溶液中加入少量5N氫氧化鈉，然後將此溶液加至抗體溶液中。用冰醋酸將反應混合物調至pH5.8的酸性，在室溫下攪拌16小時。然後離心，上清液在兩個90gSephadexG25層析柱上層析，用生理緩衝鹽水洗脫。
通過層析收集到總共202.8ml溶液，進行紫外光譜分析，觀察280和370nm處的光譜。分析結果顯示，溶液中含有0.018mg/ml氨甲蝶呤和1.87mg/ml抗體。因此，結合比以摩爾比計為3.0。
產物溶液通過在低溫下在生理緩衝鹽水中真空透析而濃縮，將此實例的產物溶液與來自同樣操作的212ml產物溶液合併。通過透析使體積降至108ml。
測定產物針對人腫瘤T222的效應(Masui等人，Cancer44∶1002-07，1984)，該腫瘤是作為異種移植物而在雌性裸鼠中建立的。在給小鼠植入腫瘤後的第3、6和9天，通過靜脈注射以下表給出的劑量(以氨甲蝶呤醯肼的含量計)給小鼠施用結合物。在植入腫瘤後的第2、3和4周測量腫瘤，結果以處理小鼠體內腫瘤生長的抑制百分比表示如下，以未處理的對照動物體內的生長情況作為比較。陽性對照動物用未結合形式的氨甲蝶呤-γ-醯肼處理，以與經結合物處理的動物進行比較。處理組的毒性表示為每5隻小鼠的處理組中呈現有毒性跡象的動物數。結果如下。
實例2抗體L/1C2丙醯基-3-氨基羰基-4-苯甲醛與氨甲蝶呤-γ-醯肼的結合物在下述不同的條件下，重複實例1的方法4次。
A.將0.67mg氨甲蝶呤-γ-醯肼溶於67μlpH5.6的0.1M乙酸鈉和33μl乙腈中，與1ml含有2.2mg「製備4」的中間體的0.1M乙酸鈉溶液合併，使混合物靜置11小時。然後在5.9gBiogelP6(Bio-RadLaboratorles，Richmond，CA94804)上層析，得到5ml結合物溶液，發現其中含有0.6mg所需結合物，結合比為每摩爾抗體3.2摩爾氨甲蝶呤。
B.將與A中所用等量的氨甲蝶呤-γ-醯肼溶液與0.95ml含有0.42mg「製備4」的中間體的溶液合併，使混合物靜置11小時。如A進行層析，得到4.75ml結合物溶液，其中含有0.11mg結合物，結合比為每摩爾5.4摩爾。
C.將0.7mg氨甲蝶呤-γ-醯肼溶於50μl乙腈和100μlpH5.8的1M磷酸緩衝液中，與1ml含有2.2mg「製備4」的中間體的pH5.6的0.1M乙酸鈉溶液合併。使混合物靜置11小時，然後如A進行層析，得到5.3ml含有1.3mg結合物的結合物溶液，結合比為每摩爾3.3摩爾。
D.將0.7mg氨甲蝶呤-γ-醯肼溶於50μl乙腈和150μlpH5.8的1M磷酸緩衝液中，與2.2mg實例4中間產物在1ml0.1M乙酸鈉中的溶液合併。使混合物靜置14小時，然後如A進行層析，得到5.3ml結合物溶液，其中含有1.7mg結合物，結合比為3.3。
將一定濃度的結合物加至培養基中，測定上述C和D方法的產物抑制組織培養中的T222腫瘤細胞生長的能力。用作對照的游離抗體L/1C2，在16μg/ml時抑制37%的細胞生長，在160μg/ml時抑制98%。以氨甲蝶呤-γ-醯肼的含量計，上述實例C結合物在0.0013μg/ml時抑制13%的生長，在0.013μg/ml時抑制87%。
以氨甲蝶呤-γ-醯肼的含量計，上述實例D結合物在0.0016μg/ml時抑制21%的細胞生長，在0.016μg/ml時抑制92%。
製備5抗體L/1C2羰基-4-苯甲醛如上述「製備3」所述，製備0.31mg4-羧基苯甲醛N-琥珀醯亞胺酯。將其溶於100μl二甲基甲醯胺中，並加至18.9mg在2.1mlpH8.6的0.34M硼酸緩衝液中的抗體L/1C2中。混合物於室溫下攪拌1.5小時，然後在6gBiogelP6上層析，用pH5.6的0.1M乙酸鈉洗脫。得到6.2ml溶液，進行紫外分析，觀察256和280nm處的光譜。分析結果顯示，得到了16.1mg衍生抗體，濃度為2.6mg/ml，結合比為每摩爾抗體5.2摩爾連接基團。
實例3抗體L/1C2羰基-4-苯甲醛與氨甲蝶呤-γ-醯肼的結合物將4ml含有10.4mg(0.069微摩爾)衍生抗體的來自「製備5」的溶液，與在250μl二甲基甲醯胺中的3.2mg(6.8微摩爾)氨甲蝶呤-γ-醯肼合併。使混合物於室溫下靜置6小時，然後置於冰箱中。兩天後離心混合物，上清液在Bio-GelP6上層析，用生理緩衝鹽水洗脫，得到8.5ml溶液，進行紫外分析，觀察280和370nm處的光譜。分析結果顯示，產物的結合比為每摩爾抗體6.4摩爾藥物，溶液中含有0.64mg/ml結合物。
測定產物抑制組織培養中的T222腫瘤細胞生長的能力。以氨甲蝶呤的含量計，發現結合物在濃度為0.035μg/ml時抑制70%的細胞生長。
製備6 抗體L/1C2F(ab′)2片段抗體L/1C2的F(ab′)2片段如下進行製備將2.4ml含有12.6mg胃蛋白酶/ml的胃蛋白酶溶液，加至在270ml生理緩衝鹽水中的1.5g L/1C2抗體中。混合物於37℃下放置2小時20分鐘，然後加入三乙醇胺終止反應。然後通過在Sepharose Fast Flow柱上層析而濃縮產物，用0.15M乙酸鈉洗脫。合併含有F(ab′)2的級分，透析濃縮，得到100ml含有992mg抗體L/1C2F(ab′)2片段的產物溶液。
製備7 抗體L/1C2 F(ab′)2片段丙醯基-3-氨基羰基-4-苯甲醛使「製備6」中製備的L/1C2 F(ab′)2片段透析至pH8.6的0.34M硼酸緩衝液中，得到3.8ml溶液狀態的23mg(0.23微摩爾)F(ab′)2片段。將此溶液與在102μl乙腈中的0.44mg(1.4微摩爾)3-(4-甲醯基苯基羰基氨基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯合併。混合物於室溫下攪拌1小時，然後溶液在11g Sephadex G25柱上層析，用pH5.6的0.1M乙酸鈉洗脫。合併含有產物的級分，得到在9.6ml溶液中的19mg(0.19微摩爾)衍生抗體片段，結合比為每摩爾2.8摩爾。
實例4 L/1C2 F(ab′)2片段丙醯基-3-氨基羰基-4-苯甲醛與氨甲蝶呤-γ-醯肼的結合物在2.7ml含有8mg(0.08微摩爾)由「製備7」得到的衍生抗體片段的衍生抗體片段溶液中，加入0.47mlpH5.6的1M磷酸緩衝液。在此溶液中加入溶於最少量0.1M乙酸鈉中的3.7mg(7.9微摩爾)氨甲蝶呤-γ-醯肼。用稀鹽酸將混合物的pH調回至5.6，混合物於室溫下攪拌17小時。然後離心，上清液在11gSephadexG25柱上層析，用生理緩衝鹽水洗脫。紫外分析顯示，得到了5.8mg結合物，其狀態為含有0.95mg/ml的溶液，結合比為每摩爾2.1摩爾。
測試結合物對組織培養中的T222腫瘤細胞的效應，發現如以氨甲蝶呤-γ-醯肼的含量計，在濃度為0.0046μg/ml時抑制22%的細胞生長，在濃度為0.046μg/ml時抑制83%的生長。
製備83-(5-甲醯基吡咯-2-基羰基氨基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯在燒瓶中加入139mg5-甲醯基吡咯-2-基羧酸、247mg二環己基碳二亞胺、138mgN-羥基琥珀醯亞胺和10ml二甲基甲醯胺。混合物於室溫下在氮氣中攪拌2小時，真空除去溶劑，得到394mg粗製活化酯。
將上述殘渣溶於1ml乙腈中。並不是所有殘渣都進入溶液中。將此不均一混合物緩慢加至89mgβ-丙氨酸在2ml0.5N氫氧化鈉中的溶液中。同時加入1N氫氧化鈉，使pH保持在7.5和8.0之間。然後將混合物於室溫下攪拌1小時，過濾。濾液用稀鹽酸酸化，用氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取。然後乾燥並濃縮成橙色油狀物，在矽膠柱上層析，用10%甲醇的二氯甲烷溶液洗脫。真空濃縮含有產物的級分，得到49mg3-(5-甲醯基吡咯-2-基羰基氨基)丙酸。
將31mg上述中間體溶於3ml二噁烷中，在其中加入35mg二環己基碳二亞胺和19mgN-羥基琥珀醯亞胺。混合物於室溫下在氮氣中攪拌2小時，然後過濾並真空濃縮。殘渣在矽膠上層析，用5%甲醇的二氯甲烷溶液洗脫，得到大約6mg所需的中間體活化酯。
製備9抗體007B丙醯基-3-氨基羰基-2-吡咯-5-甲醛抗體007B是由一種雜交瘤產生的，此雜交瘤是由產生抗體KS1/4的雜交瘤衍生的亞克隆，Varki等人對此有過描述(CancerResearch44∶681-86，1984)。將0.34M硼酸緩衝液中濃度為15mg/ml的105mg抗體007B的溶液，與300μl含有1.29mg「製備8」的中間體活化酯的乙腈溶液合併。混合物於室溫下攪拌1小時，然後在10gSephadexG25柱上層析，用pH5.6的0.1M乙酸鈉洗脫。合併含有產物的級分，進行紫外光譜分析，觀察280和300nm處的曲線。產物含有14.6ml溶液，濃度為5.7mg/ml，總計有83.2mg上述中間體。結合比為3.6。
實例5抗體007B丙醯基-3-氨基羰基-2-吡咯-5-甲醛與氨甲蝶呤-γ-醯肼的結合物取15mg「製備9」的中間體，其狀態為3.1mlpH5.6的濃度為4.8mg/ml的緩衝液，該緩衝液含有0.1M乙酸鈉和0.15M磷酸根離子。將此溶液與0.2ml乙酸鈉緩衝液中的4.7mg氨甲蝶呤-γ-醯肼合併。合併後將pH調至5.6，混合物於室溫下攪拌大約24小時。然後離心，上清液在10gSephadexG25柱上層析，用生理緩衝鹽水洗脫。合併含有產物的級分，用0.22微米濾膜過濾，得到6.05ml含有9.9mg所需結合物的產物溶液，用紫外光譜法在250和280nm處觀察曲線，測得結合比為2.3。通過放射免疫檢測測定結合物的結合能力，並與未結合的007B抗體比較。結合物和抗體的滴定曲線基本相似，表明抗體與連接基團和藥物結合後，其結合能力基本上沒有改變。
製備10抗體KS1/4丙醯基-3-氨基羰基丁醛二乙基縮醛使抗體KS1/4透析至pH8.6的0.34M硼酸緩衝液中，使其濃度為20mg/ml。使1ml抗體溶液與3-(4，4-二乙氧基丁基氨基羰基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯反應，後者是以濃度為20mg/ml的二甲基甲醯胺溶液加入的。在一個例子中活化酯的量為0.24mg，另一例子中其量為0.48mg。兩種反應混合物都攪拌2小時，然後在BiogelP6柱上層析，用生理緩衝鹽水洗脫。
第一個反應的產物是17.8mg所需的中間體，第二個反應的產物是15.6mg所需的中間體。
實例6抗體KS1/4丙醯基-3-氨基羰基丁醛二乙基縮醛與氨甲蝶呤-γ-醯肼的結合物使1ml上述「製備10」得到的衍生抗體與在pH8.6的0.34M硼酸緩衝液中的氨甲蝶呤-γ-醯肼反應。對於「製備10」中的第一個產物，使3.5mg上述產物與2.3mg氨甲蝶呤-γ-醯肼的二甲基甲醯胺溶液反應。對於第二個產物，其用量是2.9mg，而氨甲蝶呤-γ-醯肼的用量是2.0mg。然後將兩種反應混合物的pH都調至4.9。然後使反應於37℃下進行18小時，產物在BiogelP6上層析，用生理緩衝鹽水洗脫。
合併每個反應中含有產物的級分，進行紫外光譜分析，觀察279和370nm處的曲線。第一個反應的產物是2.7mg所需的結合物，結合比為2.0。第二個反應的產物是2.6mg，結合比為3.9。
本發明的結合物可用於抑制不良細胞生長的方法中，這是本發明的一個重要部分。因此，本發明還包括一種藥物組合物，最優選的是非腸道組合物，適用於注射入病人體內。這種組合物是用藥物化學中常用的方法配製的。本發明的結合物能以可接受的方式溶於生理上可接受的液體，例如生理鹽水和其他能夠安全地非腸道施用的水溶液。
非腸道施用的產品通常配製和分裝於固體中，優選凍幹固體，在使用前臨時配製。這種製劑是本發明的有用組合物。它們的製備方法是藥物化學家非常熟悉的。一般說來，它們含有無機鹽的混合物以達到等滲性，還含有分散劑例如乳糖，以使幹製備物在配製時迅速溶解。用高純水來配製這些製劑使其達到已知的以氨甲蝶呤藥物計的濃度。
本發明結合物的最佳劑量和施用方案必須由主治醫生根據病情來確定。
當然，一般的習慣是，細胞毒性藥物要以分劑量形式施用，在每組劑量之間間隔幾天或幾周。本發明的結合物在很寬的劑量範圍內都有效，每周劑量通常落入大約50至大約1000mg/m2氨甲蝶呤藥物的範圍內，更優選的範圍是大約200至大約400mg/m2。
下面是用於施用本發明結合物的典型製劑，作為指導而提供給讀者。
實例1實例中的結合物100mg生理鹽水10ml貯存在低溫下，靜脈內施用。
製劑2實例3的結合物1g乳糖10mg生理鹽水100mg在低溫下冷凍乾燥，貯存於室溫或低於室溫，用純水配製後施用。
製劑3實例4的結合物1g分散劑25mg生理鹽水100ml在低溫下冷凍乾燥，貯存於室溫或低於室溫，用純水配製後施用。
製劑4實例5的結合物100mg生理鹽水10ml貯存於低溫下，靜脈內施用。
製劑5實例6的結合物5g分散劑80mg生理鹽水500ml在低溫下冷凍乾燥，貯存於室溫或低於室溫，用純水配製後施用。
權利要求
1.一種製備具有下式的細胞毒性藥物結合物的方法其中m是1至大約10的整數；Ab是生理上可接受的抗體或其抗原識別片段，它能識別與不良細胞結合的抗原；X是一個具有下式的連接基團
R是氫、苯基或被一個或兩個硝基、滷素、氰基或三氟甲基取代的苯基；
R1是氫、氨基、氨基-C1-C4烷基，羥基-C1-C4烷基或胍基-C1-C4烷基；
n是0-5的整數；M是具有下式的氨甲蝶呤藥物
R3是
S或O；R4是CO、SO2、CO-(CH2)s或CO-NH；R5是氫或C1-C3烷基；s是1或2；Z是
t是1-6的整數；u是1-22的整數；R6是羥基或一個構成生理上可接受鹽的半分子；該方法包括使下式的衍生抗體與式H2NHN-M的藥物醯肼反應。其中R8是O、(OCH3)2或(OCH2CH3)2
2.一種權利要求1的方法，其特徵在於，其中的抗體是單克隆或嵌合抗體，或其抗原識別片段。
3.一種權利要求1或2的方法，其特徵在於，其中的X是或
4.一種權利要求1、2或3的方法，其特徵在於，其中的Z是
，t是1。
5.一種權利要求4的方法，其特徵在於，其中的R3是N(R5)，R4是CO。
6.一種權利要求1-5中任一項的方法，其特徵在於，其中的m是大約3至大約8。
7.一種製備藥物組合物的方法，該方法包括將權利要求1限定的藥物結合物與其一種或多種藥學上可接受的賦形劑混合。
全文摘要
抗體和細胞毒性氨甲蝶呤藥物的結合物利用了藥物和抗體之間的連接基團，它是簡單的有機基團，其中，與抗體的連鍵是一醯基，與藥物的連鍵是一亞烷基醯肼。
文檔編號C07K19/00GK1040204SQ8910647
公開日1990年3月7日 申請日期1989年8月7日 優先權日1988年8月8日
發明者戴維·阿瑟·詹森, 本納特·科爾曼·拉古扎, 威廉·倫納德·斯科特 申請人:伊萊利利公司