來自紅花菸草的蘇氨酸合酶以及其方法和用途

2024-03-25 18:27:05

來自紅花菸草的蘇氨酸合酶以及其方法和用途
【專利摘要】本發明公開了突變、非天然存在的或轉基因植物細胞，包括(i)包含、由或基本上由這樣的序列所組成的多核苷酸，所述序列編碼蘇氨酸合酶、並且具有與SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:3至少90％的序列同一性、或者與SEQ?ID?NO:4、或SEQ?ID?NO:5至少87％的序列同一性；(ii)由(i)所示的所述多核苷酸中的任一個所編碼的多肽；或者(iii)具有與SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7或SEQ?ID?NO:8至少95％的序列同一性的多肽；或者(iv)含有如(i)所示多核苷酸的構建體、載體或表達載體。
【專利說明】來自紅花菸草的蘇氨酸合酶以及其方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明公開了來自紅花菸草(Nicotiana tabacum)的蘇氨酸合酶基因以及其變體、同源物和片段。特別地，本發明描述了改變這種基因表達、或由其編碼的蛋白的活性以增加植物中，如菸草植物中的游離蛋氨酸水平。通過提高菸草中甲硫基丙醛(Methional)的水平，這可用於在菸草中生成期望的味道(taste)和芳香(aroma)。
【背景技術】
[0002]增加菸草的香味，如增加產生芳香的物質，可在菸草被吸菸時生成期望的味道。這樣的香味可以，例如從進行美拉德反應的胺基酸中獲得。甲硫基丙醛(3_(甲硫基)丙醛)是負責「烤土豆」芳香的香味化合物。可熱誘導產生甲硫基丙醛，其中甲硫基丙醛源自蛋氨酸和蛋氨酸衍生物。蛋氨酸的斯特雷克降解(Strecker degradation)涉及與α -二羰基化合物的相互作用(α-二羰基化合物是美拉德反應的中間產物)，並導致形成甲硫基丙醛。
[0003]已經開發出各種用於增加植物中游離蛋氨酸量的方法，例如，可將外源胺基酸加入植物。然而，使用外源加入的胺基酸導致生產成本的顯著增加、以及安全和監管問題。
[0004]蛋氨酸和蘇氨酸的生物合成都與天冬氨酸途經相關。在植物中，其生物合成途徑在O-磷酸高絲氨酸(OPH)水平上出現分歧。胱硫醚Y-合酶(CGS)和蘇氨酸合酶(TS)競爭共同底物O-磷酸高絲氨酸。通過過表達或抑制涉及天冬氨酸生物合成途徑的酶的表達可能增加游離的蛋氨酸水平。
[0005]一個可能的方法是過表達胱硫醚Y-合成酶。另一方法是減少蘇氨酸合酶的表達。然而，迄今為止，所有這種針對改變蘇氨酸合酶基因的努力導致了對整株植物產生不利影響的表型。Bartlem 等(2000)Plant Physiol.，2000，123:101-110)描述了在擬南芥(Arabidopsis)植物的蘇氨酸合酶基因上的突變。在編碼蘇氨酸合酶的基因內攜帶單鹼基對突變的所述公開的突變體顯示出蛋氨酸的過量積累和蘇氨酸水平的顯著減少。然而，所公開的擬南芥突變體與野生型相比遭受降低的生長。只有通過添加蘇氨酸或異亮氨酸才能拯救生長障礙。
[0006]Zeh 等(2001)Plant Physiol.，2001，127:792-802 公開了轉基因土豆植物，其通過反義轉基因方法使用組成型花椰菜花葉病毒35S啟動子製備。雖然所述公開的轉基因土豆植物顯示出高水平的蛋氨酸，所述植物與野生型植物相比也遭受降低的生長。
[0007]Avraham 等(2005) Transgenic Research, 2005，14:299-311 描述了通過反義轉基因方法製備的轉基因擬南芥植物。雖然所述公開的轉基因植物顯示出升高水平的蛋氨酸，所述植物患有嚴重的表型異常，包括相當嚴重的生長遲緩，降低的蓮座葉尺寸和萎黃病的葉。
[0008]需要這樣的植物，如菸草植物，其聯合升高水平的游離蛋氨酸，同時保留某種農藝上期望的性質，如生長速率以及植物的整體尺寸，而無需添加任何外源成分。本發明的目的是滿足這種需要。
【發明內容】

[0009]本發明的方面和實施方案
[0010]本發明至少在部分上基於以下發現:在植物或植物細胞，如菸草植物或植物細胞中蘇氨酸合酶表達或活性的減少(例如，抑制)導致在植物細胞或植物的一個或更多部分與對照植物或植物細胞相比在蛋氨酸濃度上的增加。令人驚訝地，所述遺傳修飾植物在其整體外觀上與對照植物相比沒有顯示任何改變。鑑於在轉基因擬南芥或土豆植物中觀察到的各種不利表型，這種發現是未預料到的。因為植物可用於包括菸草在內的各種產物的商業生產，其中在外觀上的改變對產業是不可接受的或者導致不可接受的減少的產物產量，所以可以有利地利用所述發現。也不需要添加外源胺基酸。此外，通過加熱所述菸草釋放的氣霧與從對照植物製備的菸草相比含有升高水平的甲硫基丙醛。當使用所述菸草時，在煙霧或氣霧中的甲硫基丙醛的增加產生期望的香味、芳香、或香味和芳香兩者。
[0011]本發明的方面和實施方案如所附權利要求所示。
[0012]在一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼蘇氨酸合酶、並且具有與SEQ ID N0:USEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3至少90%的序列同一性的序列所組成。
[0013]在另一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼蘇氨酸合酶、並且具有與SEQ ID N0:4、或SEQ ID NO:5至少87%的序列同一性的序列所組成。
[0014]在又一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼蘇氨酸合酶並且具有與 SEQ ID N0:20 至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的序列同一性的序列所組成。
[0015]在還一方面，提供由本發明的多核苷酸中的任一個所編碼的分離多肽。
[0016]在再一方面，提供具有與SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8至少95%的序列同一性的分離多肽。
[0017]在另一方面，提供具有與SEQ ID N0:21 至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的分離多肽。
[0018]在又一方面，提供構建體、載體或表達載體，其含有本發明的多核苷酸的任一個(例如，一個或更多、兩個或更多、三個或更多、或者四個或更多)。
[0019]在另一方面，提供突變、非天然存在的植物細胞或轉基因植物細胞，其含有所述多核苷酸的至少一個(例如，一個或更多、兩個或更多、三個或更多、或者四個或更多)，或者所述多肽的至少一個(例如，一個或更多、兩個或更多、三個或更多、或者四個或更多)。在還一方面，提供含有根據本發明的植物細胞的突變、非天然存在的植物或轉基因植物。適宜地，一個或多個蘇氨酸合酶編碼序列的表達、或由其編碼的蘇氨酸合酶蛋白的活性減少，以及所述菸草植物的部分與對照菸草植物相比具有在蛋氨酸含量上至少5%的增加，其中在所述對照菸草植物中蘇氨酸合酶的表達或活性沒有減少；或者其中在煙霧或氣霧中的甲硫基丙醛濃度與來自對照菸草植物的煙霧或氣霧相比增加了至少5 %。
[0020]其 它方面涉及用於增加在菸草植物的至少部分中的蛋氨酸濃度的方法，包括以下步驟:(i)減少一個或更多蘇氨酸合酶(例如，兩個或更多、三個或更多、或者四個或更多)在菸草植物中的表達或活性，優選地，其中所述蘇氨酸合酶包含本文所述的多核苷酸序列或多肽序列；(ii)測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因菸草植物的至少部分中蛋氨酸的濃度；以及(iii)鑑定突變、非天然存在的植物或轉基因菸草植物，其中其蛋氨酸的濃度與對照植物相比已增加。優選地，在一段時間之後，例如在田間移植後3個月、或去稍後36天，所述突變、非天然存在的植物或轉基因菸草植物的整體外觀與對照菸草植物基本相同。
[0021]在一個實施方案中，不需要添加外源營養物，如胺基酸，例如蘇氨酸和/或異亮氨酸。
[0022]在另一方面，提供通過所述方法獲得的或可獲得的突變、非天然存在的菸草植物或轉基因菸草植物、或源自其或可源自其的菸草植物材料。
[0023]在另一方面，提供突變、非天然存在的菸草植物或轉基因菸草植物，其中一個或多個蘇氨酸合酶編碼序列(例如，兩個或更多、三個或更多、或者四個或更多)的表達、或由其編碼的蘇氨酸合酶蛋白的活性減少；以及所述菸草植物的部分與對照菸草植物相比具有在蛋氨酸含量上至少5%的增加，其中在所述對照菸草植物中蘇氨酸合酶的表達或活性沒有減少；或者其中在煙霧或氣霧中的甲硫基丙醛濃度與來自對照菸草植物的煙或煙霧相比增加了至少5%。
[0024]適宜地，在一段時間後，例如而非限制于田間移植後3個月或去稍後36天，所述植物的整體外觀與對照植物基本相似或視覺上不可區分。優選地，(i)在一段時間後，例如而非限制于田間移植後3個月或去稍後36天，所述突變、非天然存在的或轉基因菸草植物的莖高與對照菸草植物的莖高基本相同；(ii)在一段時間後，例如而非限制于田間移植後3個月或去稍後36天，所述突變、非天然存在的或轉基因菸草植物的葉綠素含量與對照菸草植物的葉綠素含量基本相同；或者(i)和(ii)兩者。
[0025]適宜地，在植物的部分(例如，葉)中的蘇氨酸濃度與對照植物相比是增加的；以及優選地，其中(a)在植物的部分(例如，葉)中的蛋氨酸濃度是至少約0.03mg/g;(b)在葉中的蘇氨酸濃度是至少約0.5mg/g ； (c)在通過加熱的煙霧或氣霧中的甲硫基丙醛濃度是至少約2000 μ g/g ;或(a)、(b)和(c)中的兩個或更多的組合。
[0026]還提供含有來自本文所述的突變、非天然存在的植物或轉基因植物的細胞或組織的生物質、種子或葉。還提供菸草產品，其含有本文所述的突變、非天然存在的植物或轉基因植物的部分、其生物質、或其葉、或其組合。
[0027]在又一方面，提供用於產生甲硫基丙醛的方法，包括以下步驟:
[0028](a)提供突變、非天然存在的或轉基因菸草植物的部分；生物質、種子或葉；或者如本文所述的菸草產品；以及(b)提供對其的加熱。
[0029]在另一方面，提供用以鑑定菸草材料的方法，其通過加熱釋放升高水平的甲硫基丙醛至氣霧中，所述方法包括以下步驟:(a)製備菸草材料的樣本；(b)確定樣本的分子量圖譜(profile);以及(C)在質量:電荷比率的一個或多個上比較分子量圖譜；其中與對照植物相比在特異質量:電荷比率上的增加是氣霧中的甲硫基丙醛水平將升高的指徵。
[0030]在本公開的其它方面還提供通過這種方法鑑定的或可鑑定的菸草材料。
[0031 ] 本發明的其它方面如下所示。
[0032]嵌合基因，其含有可操作地連接到一個或更多調節序列的多核苷酸。
[0033]NtTS多核苷酸構建體，其包含、由或基本上由至少15-30個核苷酸、30_50個核苷酸、50-100個核苷酸、100-150個核苷酸、150-200個核苷酸、200-300個核苷酸、300-400個核苷酸、400-500個核苷酸、500-600個核苷酸、或600-700個核苷酸所組成。[0034] 一種可消費產品，其整合或利用根據本發明的植物材料、生物質、種子或葉。
[0035]一種細胞系，其含有根據本發明的(例如，一個或更多、兩個或更多、三個或更多、或者四個或更多)分離多核苷酸、嵌合基因、多核苷酸構建體、雙鏈RNA、綴合物或表達載體
坐寸ο
[0036]用於在細胞中調節NtTS DNA的表達、或由其編碼的蛋白的活性的方法，所述方法包括施用根據本發明的(例如，一個或更多、兩個或更多、三個或更多、或者四個或更多)嵌合基因、多核苷酸構建體、雙鏈RNA、綴合物或表達載體。
[0037]用於檢測、分離、擴增或分析NtTS多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟:提供含有多核苷酸的樣本；以及使所述多核苷酸雜交至含有來自根據本發明的分離核苷酸序列的至少10個連續核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子。
[0038]試劑用於在植物的至少部分中與對照植物相比至少5%降低蛋氨酸含量的用途，所述試劑調節NtTS DNA的表達、或由其編碼的蛋白的活性、或由其編碼的蛋白活性。
[0039]根據本發明的方法或用途，其中所述試劑是或源自NtTS DNA、嵌合NtTS基因、含有NtTS多核苷酸的多核苷酸構建體、反義RNA、雙鏈RNA、cDNA、含有NtTS多核苷酸的綴合物、以及與其共價相聯的至少一種非核苷酸或非多核苷酸半體、核酶、誘變劑、鋅指、小分子或大範圍核酸酶。
[0040]在另一實施方案中，所述多核苷酸片段編碼反義核酸、核酶、影響剪接體介導的反式剪接的RNA、幹擾RNA(RNAi)、嚮導RNA、其它非翻譯RNA等。在另一實施方案中，所述多核苷酸片段編碼RNAi。
[0041]在再一方面，提供產生菸草產品的方法，包括以下步驟:(a)從所述突變、非天然存在的或轉基因菸草植物中獲得種子；(b)種植並使所述種子生長成植物；(c)收穫所述植物；以及(d)從收穫的植物中製備菸草產品。
[0042]上述實施方案作為上述各方面的實施方案而公開。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1說明VC-4、TN90-4、NtTSl-3、NtTS2_3、NtTS3_2的烤制葉經甲醇提取以及在WatersXBridge Shield RP18柱上的分離後的LC-MS圖譜(profile)。VC-4是僅有載體的對照植物；TN90是提供背景的未修飾的菸草植物；NtTSl-3、NtTS2-3和NtTS3_2是具有RNAi沉默的蘇氨酸合酶基因的紅花菸草植物。箭頭指出在約5、9、17和19分鐘的峰。
【具體實施方式】
[0044]定義
[0045]在本申請的範圍內，所用的技術術語和表達通常賦予普遍適用於植物和分子生物學相關領域中的含義。所有下列術語定義適用於本申請中的全部內容。措詞「包括」不排除其它元素或步驟，並且不定冠詞「一」或「一個」不排除複數。單個步驟可能實現權利要求中記載的幾個特徵的功能。一個給定數值或範圍的上下文中，術語「約」、「基本上」和「近似地」指給定值或範圍的20%、10%、或5%、4%、3%、2%或1%以內的值或範圍。
[0046]術語「分離的」是指取自其天然環境的任何實體，但是所述術語並不暗示任何程度的純化。[0047]「載體」是指核酸運載體，其包括能夠轉運核酸、核酸構建體和核酸綴合物等的核酸組分的組合。合適的載體包括能夠進行染色體外複製的附加體，如環形、雙鏈DNA質粒；線性化的雙鏈DNA質粒；以及任何來源的其它載體。
[0048]「表達載體」是指核酸載體，其包括能夠表達核酸、核酸構建體和核酸綴合物等等的DNA組分的組合。合適的表達載體包括能夠進行染色體外複製的附加體，如環形、雙鏈DNA質粒；線性化的雙鏈DNA質粒；以及其它任何來源的功能等同的表達載體。表達載體至少包括位於上遊的並且可操作地連接至如下所限定的核酸、核酸構建體或核酸綴合物的啟動子。
[0049]術語「構建體」是指雙鏈、重組DNA片段，其包括一個或多個核酸。構建體包括與互補的「正義或編碼鏈」鹼基配對的「模板鏈」。給定的構建體可以按兩個可能的方向插入到載體中，相對於位於載體(如表達載體) 中啟動子的方向相同(或正義)方向或相反(或反義)方向。
[0050]「啟動子」是指通常位於上遊並且可操作地連接至雙鏈DNA片段的核酸元件/序列。啟動子可完全源自靠近本地目標基因的區域，或可由源自不同於本地啟動子的或合成DNA節段的不同元件所組成。
[0051]術語「同源性、同一性或相似性」是指通過序列比對比較的兩個多肽之間或兩個核酸分子之間序列相似性的程度。待比較兩個離散核酸序列之間的同源性程度是在可比較的位置上相同的、或匹配的核苷酸數目的函數。百分比同一性可通過目測和數學計算來確定。或者，可以通過使用電腦程式如ClustalW、BLAST、FASTA或Smith-Waterman比較序列信息來確定兩個核酸序列的百分比同一性。
[0052]術語「植物」是指在其生命周期或發育的任何階段的任何植物及其後代。在一個實施方案中，植物是菸草植物，其是指屬於菸草屬的植物。本文描述了菸草植物優選的物種、栽培品種、雜種和品種。
[0053]「植物細胞」指植物的結構和生理單元。植物細胞可以是沒有細胞壁的原生質體的形式、分離的單細胞或培養細胞、或作為更高組織單元的部分，例如而不限於植物組織、植物器官或整個植物。
[0054]術語「植物材料」是指可獲自植物的任何固體、液體或氣體組合物、或其組合，其包括生物質、葉、葉片、中脈、莖、根、花或花部分、果實、花粉、卵細胞、受精卵、種子、插條、分泌物、提取物、細胞或組織培養物、或植物的任何其它部分或產品。在一個實施方案中，植物材料包括或由生物質、種子或葉組成。在另一個實施方案中，植物材料包括或由葉組成。
[0055]術語「品種」是指共享恆定特性的植物群體，所述特性將其從相同物種的其它植物中分離出來。當具有一個或多個獨特性狀時，品種進一步的特徵在於所述品種內個體間非常小的整體差異。品種往往是市售的。
[0056]本文所用術語「系」或「育種系」表示植物育種期間所使用的一組植物。系不同於品種，因為對一個或多個目標性狀其幾乎不表現個體間的差異，儘管對於其它性狀可能有一些個體間差異。
[0057]文中使用的術語「減少」或「減少的」是指減少約10%至約99%、減少約10%至約95%或更少、減少約10%至約90%或更少，或減少至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或至少100%、或減少更多的量或活性,例如但不限於多肽活性、轉錄活性、和/或蛋白表達的減少。
[0058]如本文所用，術語「抑制」或「抑制的」是指從約98%至約100%的減少，或至少98%、至少99%、但尤其是100%的量或活性的減少，例如但不限於多肽活性、轉錄活性和/或蛋白表達的減少。
[0059]本文所用術語「增加」或「增加的」是指從約10%至約99%的增加，或至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或至少100%、200%、300%、400%或500%或更多的量或活性的增加，例如但不限於多肽活性、轉錄活性、和/或蛋白表達的增加。
[0060]術語「對照」在對照植物或對照植物細胞的背景中是其中蘇氨酸合酶的表達或活性未經修飾(例如增加或減少的)的植物或植物細胞，因此可以提供其與蘇氨酸合酶的表達或活性已經過修飾的植物作比較。對照植物可包括空載體。對照植物可與野生型植物相對應。
[0061]發明詳述
[0062]在一方面,本發明提供分離多核苷酸,其包含、由或基本上由多核苷酸序列組成，所述多核苷酸序列與本文所述的任何序列具有至少60%序列同一性所述多核苷酸序列包括在序列表中顯示的任何多核苷酸。適宜地，所述分離多核苷酸包含、由或基本上由下列序列所組成:其中所述序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、99%或100%的序列同一性。
[0063]在一個實施方案中，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼蘇氨酸合酶且與SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO:3具有至少90%的序列同一性的多核苷酸序列所組成。合適地，所述分離多核苷酸包含、由或基本上由具有與SEQ ID NO: K SEQ IDN0:2或SEQ ID N0:3至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%序列同一性的序列所組成。SEQ ID NO:1是來自紅花菸草(N.tabacum)的蘇氨酸合酶的DNA序列。SEQ ID N0:2是通過反轉錄(RT)-PCR從來自紅花菸草(希克斯闊葉種(Hicks BroadLeaf))的分離RNA中擴增並測序的蘇氨酸合酶的DNA序列。如RT-PCR分析所示，這種序列存在於紅花菸草、林菸草(Nicotiana sylvestris)的兩個祖先之一。SEQ ID N0:3是通過RT-PCR從紅花菸草(希克斯闊葉種)中分離的RNA中擴增出的蘇氨酸合酶的DNA序列。
[0064]在另一個實施方案中，提供分離多核苷酸,其包含、由或基本上由編碼蘇氨酸合酶且具有與 SEQ ID N0:4或 SEQ ID NO: 5 至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性的多核苷酸序列所組成。SEQ ID N0:4對應於SEQ ID NO: 3的基因組DNA序列。相比於SEQID NO: l，137bp的內含子定位在從ATG起始密碼子的位置234。SEQ ID N0:5對應於來自擬鸞毛菸草(N.tomentosiformis)的蘇氨酸合酶的基因組DNA序列。
[0065]在另一個實施方案中，提供分離多核苷酸,其包含、由或基本上由編碼蘇氨酸合酶且具有與 SEQ ID N0:20 至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%或90 %序列同一性的多核苷酸序列所組成。適當地，所述分離多核苷酸包含、由或基本上由與SEQ ID N0:20 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%序列同一性的序列所組成。SEQ ID NO: 20是來自紅花菸草的蘇氨酸合酶的DNA序列、並且與SEQ ID NO:1具有85%序列同一性、與SEQ ID NO:2具有86%序列同一性、以及與SEQID NO:3具有86%序列同一性。
[0066]術語「NtTS多核苷酸」涉及編碼來自紅花菸草的蘇氨酸合酶的多核苷酸，其包含、由或基本上由與 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:5 或SEQ ID N0:20具有基本同源性(即，序列相似性)或基本同一性的多核苷酸組成；所述NtTS 多核苷酸的片段含有 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO: 5 或 SEQ ID NO: 20 的片段；以及具有與 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQID NO:4,SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:20基本同源性(即，序列相似性)或基本同一性的片段具有與對應的 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或SEQ ID N0:20片段至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或 100%的序列同一性。示例性片段如 SEQID N0:9至19所示。如本文所述，所述變體可具有與SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:20 的序列至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。NtTS多核苷酸還包括含有與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:20具有足夠或實質程度的同一性或相似性的序列，以編碼具有蘇氨酸合酶功能的多肽。在一個實施方案中，術語「NtTS多核苷酸」指核苷酸的聚合物，其包含、由或基本上由本文指定為SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:20 的多核苷酸所組成。
[0067]術語「多核苷酸」指核苷酸的聚合物，其可以是未修飾的或修飾的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。因此，多核苷酸可以是，但不限於，基因組DNA、互補DNA(cDNA)、mRNA、或反義RNA或其片段。此外，多核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA、是單鏈和雙鏈區的混合物的DNA、含有DNA和RNA的雜交分子、或具有單鏈和雙鏈區或其片段的混合物的雜交分子。
[0068]如本文所述，多核苷酸將通常含有磷酸二酯鍵，儘管在某些情況下包括可具有替代骨架的多核苷酸類似物，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或O-甲基氨基磷酸酯鍵；以及肽多核苷酸骨架和鍵。其它多核苷酸類似物包括具有陽性骨架；非離子型骨架和非核糖骨架的那些。核糖-磷酸骨架的修飾可以出於各種原因而進行，例如，為了增加這樣的分子在生理環境中的穩定性和半衰期、或在生物晶片上作為探針。可以製備天然存在的多核苷酸和類似物的混合物；或者，可以製備不同多核苷酸類似物的混合物，以及天然存在的多核苷酸和類似物的混合物。
[0069]已知各種 多核苷酸類似物，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基氨基磷酸酯鍵以及肽多核苷酸骨架和鍵。其它多核苷酸類似物包括具有陽性骨架、非離子型骨架和非核糖骨架的那些。也包括含有一個或多個碳環糖的多核苷酸。
[0070]其它類似物包括肽多核苷酸(PM)，其是肽多核苷酸類似物。這些骨架在中性條件下基本上是非離子型的，不同於天然存在的多核苷酸的高電荷磷酸二酯骨架。這可能會帶來優勢。首先，PNA骨架可能會表現出改善的雜交動力學。PNA在解鏈溫度(Tm)上，相對於完全匹配的鹼基對對於錯配的鹼基對具有更大的變化。DNA和RNA對於內部錯配通常在Tm上表現出2-4°C的下降。對於非離子型的PNA骨架，下降接近7-9°C。相似地，由於其非離子性質，鹼基附著至這些骨架的雜交對鹽濃度相對不敏感。此外，PNA可能不會被細胞酶降解或降解程度較小，並因此可能會更穩定。
[0071]在公開的多核苷酸和其片段的組合的用途中是使用片段作為核酸雜交分析的探針或在核酸擴增分析中的引物。這樣的片段一般含有DNA序列的至少約10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19或20或更多連續核苷酸。在另一實施方案中，DNA片段含有DNA序列的至少約10、15、20、30、40、50或60或更多連續核苷酸。因此，在一方面，提供用於檢測NtTS多核苷酸的方法，其包括使用所述探針和/或引物。示例引物如SEQ ID N0:10至14所示。任選地，所述引物可用作探針。示例引物或探針可雜交至在SEQ ID N0:l、2和3或者SEQID N0:20之間同源的區。示例引物或探針可雜交至SEQ ID NO: 1、2和3的核苷酸1_46 ;至SEQ ID NO:20 的核苷酸 1-52 ;至 SEQ ID NO:1 的核苷酸99-141 ;至 SEQ ID N0:2 和 SEQ IDNO:3 的核苷酸 102-144 ;至 SEQ ID NO:20 的核苷酸 102-153 ;至 SEQ ID N0:l、2 和 3 的核苷酸 1325-1362 ;或至 SEQ ID NO:20 的核苷酸 1334-1371。
[0072]影響雜交條件選擇的基本參數和制定合適條件的指南描述於Sambrook, J.，E.F.Fritsch 和 T.Maniatis(1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) ? 使用遺傳密碼子結合本文所述胺基酸序列的知識，可以製備簡併寡核苷酸的集合。這樣的寡核苷酸用作引物如在聚合酶鏈式反應(PCR)中，由此分離並擴增DNA片段。在某些實施方案中，可以用簡併引物作為遺傳文庫的探針。這種文庫包括但不限於cDNA文庫、基因組文庫、甚至電子EST (表達序列標籤)或DNA文庫。然後將通 過此方法鑑定的同源序列用作探針，來鑑定本文所鑑定NtTS序列的同源物。
[0073]潛在用途還有多核苷酸和寡核苷酸(例如，引物或探針)，其在降低的嚴謹條件下、通常中等嚴謹條件下、通常高度嚴謹條件下雜交至本文所述的NtTS多核苷酸。影響雜交條件選擇的基本參數和制定合適條件的指南描述於Sambrook等人，(1989，MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.),並且可以由本領域的普通技術人員基於如多核苷酸的長度或鹼基組成很容易地確定。
[0074]實現中等嚴謹條件的一種方法涉及使用含有5X標準檸檬酸鈉、0.5%十二烷基硫酸鈉、1.0mM乙二胺四乙酸(pH8.0)的預洗溶液，約50%甲醯胺、6X標準檸檬酸鈉的雜交緩衝液，以及約55°C的雜交溫度(或其它相似的雜交溶液，如含有約50%甲醯胺的雜交溶液，雜交溫度約42°C )，以及0.5X標準檸檬酸鈉、0.1 %十二烷基硫酸鈉中約60°C的洗滌條件。一般來說，高度嚴謹條件定義為如上雜交條件，但在約68°C、0.2X標準檸檬酸鈉、0.1 %十二烷基硫酸鈉中洗滌。SSPE (I X SSPE是0.15M氯化鈉、IOmM磷酸鈉和1.25mM乙二胺四乙酸，pH值7.4)在雜交以及洗滌緩衝液中可替代標準檸檬酸鈉(IX標準檸檬酸鈉是0.15M氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成後，進行15分鐘的洗滌。應當理解，洗滌溫度和洗滌鹽濃度，通過應用控制雜交反應和雙鏈體穩定性的基本原則，可以根據需要進行調整以實現所需的嚴謹程度，如本領域技術人員所知的並在下面進一步描述(見，例如Sambrook等人,見上)。當多核苷酸雜交至未知序列的祀多核苷酸時,雜交長度假定為雜交多核苷酸的長度。當已知序列的多核苷酸雜交時，雜交長度可通過比對多核苷酸的序列以及鑑定最佳序列互補性的一個區域或幾個區域來確定。對於期望小於50個鹼基對長度的雜交，雜交溫度應該是低於雜交的解鏈溫度^^至川^^其中根據下列公式確定!^對於小於18個鹼基對長的雜交，Tffl(°C ) = 2(A+T鹼基數目)+4(G+C鹼基數目)。對於18個鹼基對以上長度的雜交，Tm(°C ) = 81.5+16.6 (1glO [Na+])+0.41(% G+C) -(600/N)，其中 N是雜交鹼基數目，以及[Na+]是在雜交緩衝液中的鈉離子的濃度(對於IX標準檸檬酸鈉，[Na+] =0.165M)。一般來說，每個這種雜交多核苷酸具有這樣的長度，是其所雜交的多核苷酸的長度的至少25% (通常至少50%、60%、或70%，並最常用為至少80% )，並且與其所雜交的多核苷酸具有至少60 %的序列同一性(例如，至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95%,96%,97%,98%,99%^； 100% ) ?
[0075]本領域技術人員將理解，線性DNA具有兩個可能的方向:5』至3』方向和3』至5』方向。例如，如果參考序列處於5』至3』方向，並且如果第二序列在相同多核苷酸分子/鏈內處於5』至3』方向，那麼參考序列和第二序列取向相同的方向，或具有相同的方向。一般來說，在給定啟動子的調控下，目標基因和啟動子的序列處於相同的方向。然而，對於處於5』至3』方向的參考序列，如果第二序列在相同多核苷酸分子/鏈內處於3』至5』方向，那麼參考序列和第二序列取向反義方向，或具有反義的方向。如果參考序列(5』至3』方向)和參考序列的反向互補序列(參考序列處於5』至3』)位於相同多核苷酸分子/鏈內，相對於彼此具有反義方向的兩個序列可任選地被描述為具有相同的方向。本文所示序列以5』至3』方向顯示。
[0076]本文提供的重組構建體可用於轉化植物或植物細胞以調節NtTS蛋白表達水平。重組多核苷酸構建體可含有編碼如本文所述的NtTS多核苷酸的多核苷酸，其可操作地連接到適於在植物或細胞中 表達NtTS多肽的調控區。因此，多核苷酸可含有編碼本文所述的NtTS多肽的編碼序列。
[0077]由重組多核苷酸編碼的NtTS多肽可以是本地的NtTS多肽，也可以是對細胞異源的。在某些情況下，重組構建體含有減少或抑制NtTS-調節多肽表達的多核苷酸，其可操作地連接到調控區。合適的調控區的實例在本文描述。
[0078]還提供了含有如本文所述的那些重組多核苷酸構建體的載體。合適的載體骨架包括例如本領域常規使用的那些，比如質粒、病毒、人工染色體、BAC、YAC或PAC。合適的表達載體包括，但不限於，源自例如噬菌體、杆狀病毒和逆轉錄病毒的質粒和病毒載體。許多載體和表達系統是商業上可獲得的。
[0079]載體還可以包括例如複製起點、支架附著區(SAR)或標記物。標記物基因可以為植物細胞賦予可選擇的表型。例如，標記物可以賦予抗生物劑抗性，比如對抗生素(例如卡那黴素、G418、博來黴素或潮黴素)的抗性，或對除草劑(例如草甘膦、氯磺隆或草銨膦)的抗性。此外，表達載體可以包括設計用來促進操作或檢測(例如，純化或定位)所表達多肽的標籤序列。標籤序列，如螢光素酶、葡糖醛酸酶(⑶S)、綠色螢光蛋白(GFP)、穀胱甘肽S-轉移酶(GST)、多聚組氨酸、c-myc或血凝素序列，通常作為與所編碼多肽的融合體來表達。這樣的標籤可以插入多肽內的任何地方，包括在羧基末端或氨基末端。
[0080]可以通過使重組多核苷酸整合至其基因組中來轉化植物或植物細胞，從而形成穩定轉化。穩定轉化的細胞一般在每次細胞分裂時保留所引入的多核苷酸。也可以瞬時轉化植物或植物細胞，從而重組多核苷酸沒有整合到其基因組中。瞬時轉化的細胞通常在每次細胞分裂時失去所有或某些部分所引入的重組多核苷酸，從而在足夠次數的細胞分裂之後所引入的重組多核苷酸在子細胞中檢測不到。
[0081 ] 用於轉化植物細胞一些方法在本領域中是可用的，這些方法全部包括在本文中，包括生物浸取(biolistics)、基因槍技術、農桿菌介導的轉化、病毒載體介導的轉化和電穿孔法。用於向植物染色體中整合外源DNA的農桿菌系統已經針對植物遺傳工程進行了廣泛的研究、改進和探索。包括DNA序列的裸重組DNA分子通過常規方法被連接到適當的T-DNA序列上，其中DNA序列對應著目標純化菸草蛋白，並按正義或反義方向可操作地連接至調控序列。通過聚乙二醇技術或通過電穿孔技術將這些引入菸草原生質體，兩者都是標準的。或者，將這種含有編碼目標純化菸草蛋白的重組核酸分子的載體引入活的農桿菌細胞，隨後所述農桿菌細胞將核酸轉移到植物細胞中。可以通過菸草原生質體與含有DNA的脂質體進行融合或者通過電穿孔實現不伴有T-DNA載體序列的裸DNA的轉化。不伴有T-DNA載體序列的裸DNA也可通過惰性、高速微彈(microprojectile)用於轉化菸草細胞。 [0082]如果細胞或培養的組織用作接受轉化的組織，如果需要的話通過本領域技術人員已知的技術，可以從轉化的培養物中再生植物。
[0083]待納入重組構建體的調控區的選擇取決於若干因素，包括但不限於效率、可選擇性、可誘導性、所需的表達水平和細胞的或組織的優先表達。對於本領域技術人員而言，通過適當選擇和定位相對於編碼序列的調控區來調節編碼序列的表達是一個常規的事情。多核苷酸的轉錄可以以類似方式調節。一些合適的調控區僅僅或主要在某些細胞類型中起始轉錄。用於鑑定和表徵植物基因組DNA中調控區的方法是本領域已知的。
[0084]合適的啟動子包括組織特異性因子所識別的組織特異性啟動子，其存在於不同組織或細胞類型中(例如，根特異性啟動子、莖特異性啟動子、木質部特異性啟動子)、或存在於不同發育階段出現、或者響應不同環境條件而出現。合適的啟動子包括組成型啟動子，其可以在大多數細胞類型中被激活而無需特定的誘導物。用於控制NtTS RNAi多肽生產的合適啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒35S (CaMV/35S)、SSU、OCS、lib4、usp、STLSl、B33、nos或泛素啟動子或菜豆素啟動子。本領域技術人員能夠產生重組啟動子的多種變異。
[0085]組織特異性啟動子是轉錄控制元件，其僅在植物發育期間的特定時間中在特定細胞或組織中有活性，如在營養組織或繁殖組織中。例如，當優選在某些組織中表達多核苷酸時，組織特異性表達可以是有利的。發育控制下的組織特異性啟動子實例包括可以僅在(或主要僅在)某些組織(如營養組織例如根或葉，或生殖組織如果實、胚珠、種子、花粉、pistols (無對應中譯文)、花或任何胚胎組織)中起始轉錄的啟動子。生殖組織特異性啟動子可以是例如花葯特異性、胚珠特異性、胚特異性、胚乳特異性、珠被特異性、種子和種皮特異性、花粉特異性、花瓣特異性、萼片特異性的或其組合。
[0086]合適的葉特異性啟動子包括來自C4植物(玉米)的丙酮酸、正磷酸二激酶(ProK)啟動子、來自玉米的cab-mlCa+2啟動子、擬南芥myb相關基因的啟動子(Atmyb5)、核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)啟動子(例如，在葉和光照生長的幼苗中表達的番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因、在發育中的番茄果實中表達的RBCSl和RBCS2、或者幾乎只在葉片和葉鞘的葉肉細胞中高水平表達的核酮糖二磷酸羧化酶啟動子)。
[0087]合適的衰老特異性啟動子包括在果實成熟、衰老和葉脫落期間有活性的番茄啟動子，編碼半胱氨酸蛋白酶基因的玉米啟動子。可以使用合適的花葯特異性啟動子。可以選擇本領域技術人員已知合適的根優選啟動子。合適的種子優選啟動子包括種子特異性啟動子(在種子發育期間有活性的那些啟動子，比如種子貯藏蛋白的啟動子)和種子萌發啟動子(在種子萌發期間有活性的那些啟動子)。這樣的種子優選啟動子包括但不限於Ciml (細胞分裂素誘導的信息)；cZ19Bl (玉米19kDa的玉米醇溶蛋白)；milps (肌-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2也稱為Zm-40 ;nuclc ;以及celA (纖維素合酶)。Y-玉米醇溶蛋白是胚乳特異性啟動子。Glob-1是胚特異性啟動子。對於雙子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限於豆β菜豆素(bean beta-phaseolin)、油菜籽蛋白、β _伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。對於單子葉植物,種子特異性啟動子包括但不限於玉米15kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、22kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、27kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、g_玉米醇溶蛋白啟動子、27kDa的Y-玉米醇溶蛋白啟動子(如gzw64A啟動子，參閱GenBank登錄號S78780)、臘質(waxy)啟動子、短縮(shrunken) I啟動子、短縮2啟動子、球蛋白I啟動子(見GenBank登錄號L22344)、Itp2啟動子、ciml啟動子、玉米endl和end2啟動子、nucl啟動子、Zm40啟動子、eepl和eep2 ;lecl、硫氧還蛋白H啟動子；mlipl5啟動子、PCNA2啟動子；以及短縮2啟動子。
[0088]可誘導啟動子的實例包括響應病原體攻擊、厭氧條件、溫度升高、光、乾旱、低溫或高鹽濃度的啟動子。病原體可誘導的啟動子包括來自發病相關蛋白(PR蛋白)的那些，發病相關蛋白是病原體感染之後誘導的(例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶)。
[0089]除了植物啟動子，其它合適的啟動子可源自細菌來源，例如，章魚鹼合酶啟動子、胭脂鹼合酶啟動子和源於Ti質粒的其它啟動子)，或可以源自病毒啟動子(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19S RNA啟動子、菸草花葉病毒的組成型啟動子、花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S和35S啟動 子、或玄參花葉病毒35S啟動子)。
[0090]術語「NtTS多肽」指編碼來自紅花菸草蘇氨酸合酶的多肽、並且含有包含、由或基本上由為這樣的多核苷酸所編碼的胺基酸序列所組成的多肽，所述多核苷酸具有與SEQ IDNO: K SEQ ID N0:2 或 SEQ ID NO:3 至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性、或者所述多核苷酸具有與SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:20至少約60%、65%,70%,75%,80%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%或 100%的序列同一性；SEQ ID NO: USEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3,SEQID NO:4、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 20 的 NtTS 多核苷酸的片段；以及 SEQ ID NO: 1、SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:20 的片段，其具有與對應於 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:20的片段至少約 60%,65%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的序列同一性。示例片段如 SEQ ID N0:9 至 19所示。NtTS多肽還包括序列，其含有與SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8足夠或相當程度的同一性或相似性以發揮蘇氨酸合酶功能，NtTS多肽還包括具有與SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8 或 SEQ ID N0:21 至少 95%序列同一性的序列。SEQ ID N0:6 是SEQ ID NO:1 的翻譯序列。SEQ ID N0:7 是 SEQ ID N0:2 的翻譯序列。SEQ ID N0:8 是 SEQID N0:3的翻譯序列。SEQ ID N0:21是SEQ ID NO:20的翻譯序列，並且與SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9具有89%的序列同一性。
[0091]在一個實施方案中，所述NtTS多肽的片段保留蘇氨酸合酶活性。NtTS多肽還可包括通過引入任何類型的改變(例如，胺基酸的插入、刪除或取代；糖基化狀態的變化；影響再摺疊或異構化、三維結構或自我結合狀態的變化)所產生的變體和突變體，只要其仍能發揮蘇氨酸合酶功能，其可以經有意地工程化或是天然分離的。NtTS多肽可以處於線性形式或使用已知方法環化。術語「NtTS多肽」可以指包含、由或基本上由如SEQ ID N0:6、SEQID NO:7, SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:21所示的序列所組成的多肽。
[0092]在另一方面，提供分離多肽，其包含、由或基本上由與本文所述的任何序列具有至少60%序列同一性的多肽序列所組成，包括在序列表中顯示的多肽中的任何多肽。適宜地，所述分離多肽包含、由或基本上由與其具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的序列所組成。
[0093]NtTS多肽包括通過引入任何類型的改變所產生的變體(例如，胺基酸的插入、刪除或取代；糖基化狀態的變化；影響再摺疊或異構化、三維結構或自結合狀態的變化)，其可以經有意地工程化或是天然分離的。所述變體可具有產生沉默改變或導致功能等同蛋白的改變。只要保留底物的二級結合活性，基於在殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性上的相似性，可進行有意的胺基酸取代。例如，帶負電的胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸；帶正電的胺基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的具有不帶電極性頭部基團的胺基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可進行保守取代，例如根據下表。在第二列相同方框中的胺基酸以及優選在第三列相同行中的胺基酸可互相取代。
脂肪族胺基酸非極性GlyAlaPro
【權利要求】
1.一種突變、非天然存在的或轉基因植物細胞，其包含: (i)包含、由或基本上由這樣的序列所組成的多核苷酸，所述序列編碼蘇氨酸合酶並且具有與SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3至少90%的序列同一性、或與SEQ IDNO:4、或SEQ ID NO:5具有至少87%的序列同一性; (?)由(i)所示的所述多核苷酸中的任一個所編碼的多肽；或者 (iii)具有與SEQID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8至少95%的序列同一性的多肽；或者 (iv)含有如(i)所不的多核苷酸的構建體、載體或表達載體。
2.一種含有如權利要求1所述的植物細胞的突變、非天然存在的或轉基因植物。
3.一種用於在植物、優選菸草植物的至少部分中增加游離蛋氨酸濃度的方法，所述方法包括以下步驟: (a)減少蘇氨酸合酶在所述植物中的表達或活性，優選地，其中所述蘇氨酸合酶包括: (i)包含、由或基本上由這樣的序列所組成的多核苷酸，所述序列編碼蘇氨酸合酶並且具有與SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3至少90%的序列同一性、或與SEQ IDNO:4、或SEQ ID NO:5具有至少87%的序列同一性; (?)由如⑴所示的所述多核苷酸中的任一個所編碼的多肽；或者 (iii)具有與 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 至少 95%序列同一性的多肽； (b)測量獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分中游離蛋氨酸的濃度；以及 (c)鑑定突變、非天然存在的或轉基因植物，其中其游離蛋氨酸的濃度與對照植物相比已增加，所述對照植物中蘇氨酸合酶的表達或活性沒有減少，以及在田間移植後3個月或去稍後36天，其中所述突變、非天然存在的或轉基因植物的外觀與對照植物基本相同。
4.一種突變、非天然存在的或轉基因植物或植物材料，優選菸草植物或植物材料，其源自或可源自根據權利要求3所述的方法獲得的或可獲得的。
5.一種突變、非天然存在的或轉基因植物，優選菸草植物，其中蘇氨酸合酶的表達或由其編碼的蛋白的活性減少，且所述植物的部分與對照菸草植物相比具有在蛋氨酸含量上至少5%的增加，所述對照菸草植物中蘇氨酸合酶的表達或活性沒有減少；以及其中在氣霧中的甲硫基丙醛濃度與來自對照植物的氣霧相比增加了至少5% ;優選地，在田間移植後3個月或去稍後36天，其中所述植物的外觀與對照植物基本相同；優選地，在田間移植後3個月或去稍後36天，其中所述突變、非天然存在的或轉基因植物的莖高與對照植物的莖高基本相同；和/或在田間移植後3個月或去稍後36天，所述突變、非天然存在的或轉基因植物的葉綠素含量與對照植物的葉綠素含量基本相同。
6.根據權利要求5所述的突變、非天然存在的或轉基因植物，其中在所述植物的部分中的游離蘇氨酸濃度與對照植物相比是增加的；優選地，其中(i)在葉中的游離蛋氨酸濃度是至少約0.03mg/g ； (ii)在葉中的游離蘇氨酸濃度是至少約0.5mg/g ;以及(iii)在通過加熱的煙霧中的甲硫基丙醛濃度是至少約2000 μ g/g。
7.一種含有來自如權利要求2和4至6中任一項所述的植物的細胞或組織的種子。
8.一種植物材料，其包含生物質或葉，所述生物質或葉含有來自如權利要求2和4至6中任一項所述的植物的細胞或組織。
9.一種菸草產品，其含有如權利要求2和4至6中任一項所述的植物的部分、或如權利要求8所述的植物材料。
10.一種用於產生甲硫基丙醛的方法，所述方法包括以下步驟: (a)提供如權利要求2和4至6中任一項所述的突變、非天然存在的或轉基因植物的部分、如權利要求8所述的植物材料、或如權利要求9所述的菸草產品；以及 (b)提供對其的加熱。
11.一種用於檢測在樣本中的NtTS多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟: (a)提供含有、或疑似含有多核苷酸的樣本； (b)使所述樣本接觸特異性檢測NtTS多核苷酸的至少部分的多個引物之一、或一個或多個探針；以及 (c)檢測擴增產物的存在，其中擴增產物的存在指示樣本中存在NtTS多核苷酸。
12.—種分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼蘇氨酸合酶並且具有與SEQ IDNO:USEQ ID N0:2 或 SEQ ID NO:3 至少 90%的序列同一性、或具有與 SEQ ID N0:4、或 SEQID N0:5至少87%的序列同一性的序列所組成。
13.—種由如權利要 求12所述的多核苷酸中的任一個所編碼的分離多肽。
14.一種具有與SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8至少95%的序列同一性的分離多肽。
15.—種含有如權利要求12所述的多核苷酸的構建體、載體或表達載體。
【文檔編號】C12N9/88GK103946384SQ201280053702
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年8月31日 優先權日:2011年9月2日
【發明者】L·博韋, N·謝羅 申請人:菲利普莫裡斯產品有限公司