重組Wzt蛋白兔血清多克隆抗體及其製備方法與流程

2024-04-01 04:45:05

本發明涉及抗體製備技術領域，具體涉及一種重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體及其製備方法。

背景技術：

布魯氏菌病(brucellosis，簡稱布病)由布魯氏菌(brucella)引起，主要感染反芻動物和人類，也可感染鹿、犬類等，全球大部分地區均有布魯氏菌病感染的報導。

動物患布病會引起懷孕動物流產，產奶量下降和不育等一系列問題，對經濟影響非常大，特別是在發展中國家。絕大多數布魯氏菌都可以感染人，並引起嚴重的疾病，不僅需要配合抗生素的治療，而且治療時間相對較長，遺留下來的後遺症通常相對嚴重。布病的傳播使得畜牧業的發展和人類健康受到嚴重影響，全世界每年新發感染人數大約為50萬人，在世界二百多個國家和地區中報告有人畜疫情的國家有170多個，因此，在布病流行的國家，消除布病一直是人們一直以來都想要實現的目標。致病機理(包括胞內寄生機理)以及免疫機理尚不十分清楚是布魯氏菌病研究過程中的一個瓶頸，導致其防控存在一定的難度。

脂多糖(lipopolysaccharides，lps)廣泛存在於革蘭氏陰性細菌中，對於革蘭氏陰性細菌外膜的結構和功能完整性至關重要，可以引起哺乳動物免疫反應。布魯氏菌的lps是其主要的毒力因子。目前，布魯氏菌lps合成的途徑並不完全清晰，已經發現的與布魯氏菌lps合成相關的主要基因編碼產物有過骨胺合成酶(per)、磷酸甘露糖變位酶(pmm或mab)、甘露糖基轉移酶2(wbka，wbda，badc)、磷酸葡萄糖變位酶(pgm)和轉運載體(wzt和wzm)。其中wzt基因是布魯氏菌lps合成中的關鍵基因，與wzm等基因共同組成布魯氏菌abc轉運系統。abc轉運系統是細菌中由一系列同源基因編碼的操縱子組成的細胞轉運機器，所說的操縱子由atp結合蛋白、膜蛋白、亞基結合蛋白三部分構成。abc轉運系統參與胞外多糖的合成，並且能夠運輸膜外生物大分子。此外，abc轉運系統在細菌營養成分的運輸、毒力分子的外排等過程中也起著至關重要的作用。然而abc轉運系統對細菌毒力、免疫原性及蛋白質表達的影響尚不清楚。

genbank中記錄的wzt基因的功能為水解atp釋放出能量，同時將ops側鏈轉移到外膜上進而形成光滑型lps。研究發現，wzt基因的缺失會造成lps的合成受阻，但其性質及如何參與lps合成的機制尚未見報導。

技術實現要素：

為了填補應用重組wzt蛋白製備特異性多克隆抗體的空白，本發明提供一種重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體及其製備方法。

本發明為解決技術問題所採用的技術方案如下：

本發明的重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體，它是利用重組wzt蛋白作為抗原，對雌性家兔進行四次免疫後再經純化處理後獲得的。

本發明還提供了上述重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體的製備方法，包括以下步驟：

步驟一、初次免疫

將500μg重組wzt蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化後，在雌性家兔背部進行皮下多點注射，每點100μg重組wzt蛋白；

步驟二、二次免疫

在初次免疫的一周後進行二次免疫，將400μg重組wzt蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化後，在雌性家兔背部進行皮下多點注射，每點80μg重組wzt蛋白；

步驟三、三次免疫

在二次免疫的一周後進行二次免疫，將400μg重組wzt蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化後，在雌性家兔背部進行皮下多點注射，每點80μg重組wzt蛋白；

步驟四、四次免疫

在三次免疫的一周後進行二次免疫，將400μg重組wzt蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化後，在雌性家兔背部進行皮下多點注射，每點80μg重組wzt蛋白；

步驟五、每次免疫後採集雌性家兔耳靜脈血，以未進行免疫時的兔血清為對照、純化後重組wzt蛋白為抗原，應用間接elisa法檢測兔血清抗體效價，血清稀釋倍數分別為100、200、400、1600、3200、6400；

步驟六、第四次免疫一周後，採集兔全血，將收集的兔全血在37℃靜置2h，4℃靜置過夜，次日4000rpm、離心10min收集上清，得到兔血清；

步驟七、純化

(1)將上述所得兔血清與等體積的抗體結合緩衝液混合後過濾；

(2)用10倍柱體積的抗體結合緩衝液平衡proteina柱子，將上述過濾後的兔血清打入到柱子中；

(3)用抗體結合緩衝液清洗柱子，洗脫雜蛋白，直至流出的下液中不含有蛋白成分；

(4)用抗體洗脫液過柱，洗脫抗體，收集流出的下液，並用ph9.0的tris-hcl調節ph至中性，收集重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體。

作為優選的實施例，所述重組wzt蛋白採用以下方法製備：

步驟一、構建重組克隆質粒pmd-19t-wzt

(1)對genbank中記錄的wzt基因序列進行優化處理，將目的基因片段與克隆載體pmd-19t(simple)連接，構建重組克隆質粒pmd-19t-wzt；

(2)對重組克隆質粒pmd-19t-wzt進行轉化處理；

(3)對轉化後的重組克隆質粒pmd-19t-wzt進行提取；

(4)採用pcr、雙酶切、測序對重組克隆質粒pmd-19t-wzt進行鑑定；

步驟二、構建重組表達載體pet-21b-wzt

(1)挑選測序結果正確的重組克隆質粒pmd-19t-wzt進行ndei和xhoi雙酶切、凝膠回收後得到目的基因片段，目的基因片段與克隆載體pet-21b用t4dna連接酶進行連接，4℃過夜孵育，構建重組表達載體pet-21b-wzt；

(2)對重組表達載體pet-21b-wzt進行轉化；

(3)對轉化後的重組表達載體pet-21b-wzt進行提取；

(4)採用pcr、雙酶切對重組表達載體pet-21b-wzt進行鑑定；

步驟三、重組wzt蛋白的誘導表達

在菌液od600＝1時，加入終濃度為lmm的iptg，33℃誘導14h後，獲得含有重組wzt蛋白的菌液，wzt蛋白分子量為27kda；

步驟四、目的蛋白的純化

收集誘導表達後的菌體，超聲破碎後，在4℃、12000rpm離心45min，過濾上清，用histrapff親和層析柱純化目的蛋白，依次經洗脫、洗滌、平衡、上蛋白、洗脫雜蛋白、洗脫目的蛋白後得到純化的重組wzt蛋白，純化後重組wzt蛋白的純度為93％，回收率為2％；對純化的重組wzt蛋白進行sds-page和westernblot分析；

步驟五、純化後重組wzt蛋白的n端測序鑑定

採用基於edman降解法的n端序列分析方法對純化後重組wzt蛋白進行n端分析，測得純化後重組wzt蛋白n端序列為：

nh2-met-ile-gln-pro-ser-ile-thr-leu-ser-asn，與目標蛋白n端序列一致。

本發明的有益效果是：

本發明對wzt基因的密碼子進行了優化，將優化後的基因片段與克隆載體pmd-19t(simple)相連，經測序和酶切驗證正確後，將雙酶切後獲得的目的基因片段與同樣經雙酶切的表達載體pet-21b相連構建重組表達質粒，轉化至表達大腸桿菌bl21(de3)感受態細胞中，表達重組wzt蛋白，其大小約為27kda；應用親和層析的方法用鎳柱對目的蛋白進行純化，經測定，目的蛋白的純度為93％，蛋白回收率為2％；對純化的目的蛋白進行n端測序驗證，結果與genbank中記錄的wzt蛋白的胺基酸序列一致，說明所表達的是wzt蛋白。

通過試驗證明重組wzt蛋白對小鼠淋巴細胞增殖百分數影響比cona高40％，可以刺激機體產生igg抗體，抗體效價在第四周達到最高，最高值為1:4200，但抗體從第五周開始消失較快。

利用重組wzt蛋白作為抗原製備的重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體特異性良好，可用於檢測布魯氏菌wzt蛋白。

附圖說明

圖1為重組克隆質粒pmd-19t-wzt的pcr擴增電泳結果。圖1中，m：dl2000dna分子量標準；1：pmd-19t-wztpcr產物。

圖2為重組克隆質粒pmd-19t-wzt的雙酶切電泳結果。圖2中，m：dl5000dna分子量標準；1：pmd-19t-wzt雙酶切產物。

圖3為重組表達載體pet-21b-wzt的pcr擴增電泳結果。圖3中，m：dl2000dna分子量標準；1：pet-21b-wztpcr產物。

圖4為重組表達載體pet-21b-wzt的雙酶切電泳結果。圖4中，m：dl10000dna分子量標準；1：pet-21b-wzt雙酶切產物。

圖5為重組質粒表達產物sds-page分析結果。圖5中，m：預染蛋白分子量標準；1-8：iptg誘導pet-21b-wzt2h、4h、6h、8h、12h、14h、18h、24h後的菌液；9：未誘導菌液。

圖6為重組質粒表達產物sds-page分析結果。圖6中，m：預染蛋白分子量標準；1-6：iptg終濃度：0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、1.8mm、2.0mm；7：未誘導菌液。

圖7為重組質粒表達產物sds-page分析結果。圖7中，m：預染蛋白分子量標準；1-5：pet-21b-wzt誘導溫度：26℃、28℃、30℃、33℃、37℃；6：未誘導菌液。

圖8為重組菌株表達產物可溶性sds-page分析結果。圖8中，m：非預染蛋白分子量標準；1：超聲破碎沉澱；2：超聲破碎上清。

圖9為純化後蛋白的sds-page分析結果。圖9中，m:非預染蛋白分子量標準；1：wzt蛋白超聲上清；2:雜蛋白洗脫；3-6：純化後蛋白。

圖10為表達產物的westernblot分析。圖10中，m：預染蛋白分子量標準；1：pet-21b-wzt在大腸桿菌bl21(de3)中的表達產物。

圖11為重組wzt蛋白n端測序結果(按測得胺基酸先後順序排列)。

圖12為重組wzt蛋白刺激小鼠淋巴細胞增殖結果。

圖13為重組wzt蛋白免疫小鼠血清抗體igg效價結果。

圖14為重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體特異性檢測結果。m：預染蛋白分子量標準；1：牛布魯氏菌s19菌株；2：wzt基因缺失s19菌株；3：wzm基因缺失s19菌株；4：綠膿桿菌；5：糞腸球菌；6：緩慢葡萄球菌；7：鶉雞腸球菌；8；奇異變形菌；9：純化後wzt蛋白。

具體實施方式

一、材料

1、菌株和質粒

wzt基因由上海生工有限公司合成。

pmd19t(simple)載體購自寶生物(大連)公司。

模板pet21b-wzt、原核表達載體pet-22b、dh5α克隆感受態細胞和bl21(de3)感受態細胞由吉林農業大學生命科學學院代謝工程與合成生物學實驗室保存。

2、主要試劑

3、主要儀器

二、重組wzt蛋白的製備

1、重組克隆質粒pmd-19t-wzt的構建

(1)大腸桿菌dh5α感受態細胞的製備

①從-80℃冰箱中取出e.colidh5α原始菌株，於lb固體平板上劃線培養並挑取單個菌落，接種於5mllb液體培養基中，37℃、150rpm、振蕩培養12h，將培養得到的菌液按照1:1000的體積比接種於100mllb液體培養基中，37℃、150rpm、振蕩培養至od600為0.4～0.5。

②將培養得到的菌液收集至50ml離心管中，冰浴處理30min，4℃，6000rpm離心8min。

③棄去上清，用事先在冰浴中預冷的0.1mol/lcacl2溶液懸浮收集的菌體，4℃，6000rpm離心8min，該步驟重複一次。

④棄去上清，加入4ml預冷的cacl2溶液懸浮收集的菌體，混勻後每個離心管內加入1.6ml事先預冷的滅菌甘油，混勻，將其分裝與1.5mlep管中，每管100μl，存放於-80℃冰箱中備用。

(2)目的基因片段與克隆載體pmd-19t(simple)連接

根據genbank中記錄的wzt基因序列，應用大腸桿菌偏好的密碼子對其進行優化，將優化序列送至上海生工生物公司進行合成。

將合成的目的基因片段與克隆載體pmd-19t(simple)連接，4℃恆溫孵育過夜，構建重組克隆質粒pmd-19t-wzt，連接體系如下表所示。

(3)重組克隆質粒pmd-19t-wzt的轉化

從-80℃冰箱中取出大腸桿菌dh5α感受態細胞，冰浴復甦後加入重組克隆質粒pmd-19t-wzt，將10μl連接產物用移液器加入50μl大腸桿菌dh5α感受態細胞中，冰浴30min，42℃水浴熱擊45s，之後立即冰浴5min(該過程中不要劇烈搖動ep管)。將200μl無抗性lb液體培養基加入其中，振蕩培養1h，條件為37℃，200rpm條件下搖床振蕩培養。將培養好的菌液取出100μl均勻塗布於含有amp抗性的lb固體培養基中，在37℃培養箱中恆溫培養10～12h，直至得到大小相對均一、邊緣較光滑的白色菌落。

(4)重組克隆質粒pmd-19t-wzt的提取

用鑷子夾取無菌小槍頭挑取平板上的單菌落置於5ml含有amp抗性的lb液體培養基中，於搖床中37℃，200rpm振蕩培養過夜。重組克隆質粒pmd-19t-wzt提取步驟如下：

①收集過夜培養的菌液，13000rpm離心1min，棄去上清。

②每管加入250μl的solutioni，吹打混勻菌體。

③每管加入250μl的solutionii，蓋上ep管，輕輕翻轉數次，直至管內液體變得相對澄清，此步驟不宜超過5min。

④每管加入350μl的solutioniii，蓋上ep管，輕輕翻轉7～8次，13000rpm離心10min。

⑤收集離心後得到的上清，吸取上清至柱子中，12000rpm離心1min，棄去下液。

⑥向製備管中加入500μl的bufferw1，12000rpm離心1min，棄去下液。

⑦向製備管中加入700μl的bufferw2，12000rpm離心1min，棄去下液。

⑧重複步驟⑦一次。

⑨將製備管以12000rpm空離1min，棄去下液。

⑩向製備管中加入40μl的eluent溶液，常溫靜置1min，12000rpm離心1min，將提取的重組克隆質粒pmd-19t-wzt置於-20℃冰箱保存備用。

(5)重組克隆質粒pmd-19t-wzt的鑑定

①pcr鑑定

根據優化後序列，應用primerpremier5.0軟體設計引物，由上海生工有限公司合成，引物序列如下：

上遊引物-p1：5'-catatgatccagccatccattaccct-3'(下劃線部分為ndei酶切位點)；

下遊引物-p2：5'-ctcgagcgcaatcgcgcccat-3'(下劃線部分為xhoi酶切位點)。

以提取的不同重組克隆質粒為模板進行pcr鑑定，pcr反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，72℃終延伸10min，pcr反應體系如下表所示，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

pcr鑑定結果：以提取的不同重組克隆質粒為模板，p1、p2為引物pcr擴增得到約750bp大小的條帶，結果見圖1，結果符合預期。

②雙酶切鑑定

用限制性內切酶ndei和xhoi對提取的重組克隆質粒pmd-19t-wzt進行酶切鑑定，雙酶切反應體系如下表所示，37℃金屬浴2h，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

雙酶切鑑定結果：用ndei、xhoi雙酶切重組克隆質粒pmd-19t-wzt，得到一條約2500bp和一條約750bp大小的條帶，如圖2所示，結果符合預期。pcr鑑定和雙酶切鑑定結果都與預期結果一致，成功構建了重組克隆質粒pmd-19t-wzt。

③測序鑑定

將經過pcr鑑定和雙酶切鑑定結果均正確的重組克隆質粒pmd-19t-wzt送至上海生工有限公司進行測序，將測序結果與優化後序列進行比對，結果完全一致。

2、重組表達載體pet-21b-wzt的構建

(1)大腸桿菌bl21(de3)感受態細胞的製備

從-80℃冰箱中取出bl21(de3)菌株，劃線培養並挑取單菌落，製備方法按照上述第二部分第1步中的「(1)大腸桿菌dh5α感受態細胞的製備」方法進行。

(2)目的基因片段與克隆載體pet-21b的連接

挑選測序結果正確的重組克隆質粒pmd-19t-wzt進行ndei和xhoi雙酶切，雙酶切體系如下表所示，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

在切膠儀下切取含有目的基因片段的瓊脂糖凝膠置於離心管中，使用dna凝膠回收試劑盒進行回收，操作步驟如下：

①計算凝膠重量，將這一重量作為一個凝膠的體積(例：100mg＝100μl)。

②向其中加入三倍凝膠體積的bufferde-a，將離心管置於75℃水浴中加熱溶膠，該過程中每2～3min顛倒一次離心管，隨時觀察溶膠情況直至膠完全溶化。

③向離心管中加入0.5個bufferde-a體積的bufferde-b，用移液器吹打混勻。

④將步驟③離心管中的液體轉移至製備管中，12000rpm離心1min，棄去下液。

⑤向製備管中加入500μl的bufferw1，12000rpm離心30s，棄去下液。

⑥向製備管中加入700μl的bufferw2，12000rpm離心1min，棄去下液。

⑦重複步驟⑥一次。

⑧將製備管12000rpm空離1min，棄去下液。

⑨向製備管中加入30μl的eluent溶液，常溫靜置1min，12000rpm離心1min，將回收的片段置於-20℃冰箱保存備用。

⑩將凝膠回收得到的目的基因片段與克隆載體pet-21b用t4dna連接酶進行連接，4℃過夜孵育，構建重組表達載體pet-21b-wzt，連接反應體系如下表所示。

(3)重組表達載體pet-21b-wzt的轉化

將連接產物轉化至e.colibl21(de3)感受態細胞中，塗布於含有amp抗性的固體lb培養基中，轉化方法按照上述的第二部分第1步中的「(3)重組克隆質粒pmd-19t-wzt的轉化」方法進行。

(4)重組表達載體pet-21b-wzt的提取

挑取培養的單個菌落接種於5ml的lb液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養過夜後提取重組表達載體pet-21b-wzt，提取方法按照上述的第二部分第1步中的「(4)重組克隆質粒pmd-19t-wzt的提取」方法進行。

(5)重組表達載體pet-21b-wzt的鑑定

①pcr鑑定

以提取的不同重組表達載體為模板進行pcr鑑定，pcr鑑定方法按照上述的第二部分第1步中的「(5)重組克隆質粒pmd-19t-wzt的鑑定」方法進行。

pcr鑑定結果：以重組表達載體pet-21b-wzt為模板，p1、p2為引物pcr擴增得到約750bp大小的條帶，結果如圖3所示，結果符合預期。

②雙酶切鑑定

將pcr鑑定結果正確的重組表達載體pet-21b-wzt用限制性內切酶ndei和xhoi進行雙酶切鑑定，雙酶切鑑定方法與「重組克隆質粒pmd-19t-wzt」的雙酶切鑑定方法相同。

雙酶切鑑定結果：用ndei、xhoi雙酶切重組表達質粒pet-21b-wzt，得到一條約2500bp和一條約750bp大小的條帶，如圖4所示，結果符合預期。pcr鑑定和雙酶切鑑定結果都與預期結果一致，成功構建了重組原核表達載體pet-21b-wzt。

3、重組wzt蛋白的誘導表達

(1)最佳誘導時間的確定

將活化鑑定正確的菌種置於液體lb(amp+)培養基中，於37℃搖床過夜培養，轉速為200rpm，再按1:50的體積比接種於5ml含有amp抗性的lb液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養，隨時檢測菌液od600值，待od600值約為0.8～1.0時，加入iptg至終濃度為1mm，37℃、200rpm振蕩培養，進行誘導表達，分別收集誘導後2h、4h、6h、8h、14h、16h、24h菌液，用同樣的方法誘導空載體14h作對照。

在iptg終濃度lmm、溫度37℃條件下，分別收集未誘導、誘導後2h、4h、6h、8h、14h、16h、24h菌液，經12％sds-page電泳分析。結果表明：在菌液od600＝1時，加入iptg終濃度為lmm，37℃誘導14h時，目的蛋白表達量較高，如圖5所示，蛋白分子量約27kda。

(2)最佳誘導濃度的確定

在菌液待od600值為0.8～1.0時，加入終濃度分別為0.5mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.8mm、2.0mm的iptg，37℃、200rpm振蕩培養，進行誘導表達，同時將未誘導菌液作為對照。

在溫度37℃、誘導時間14h條件下，當od600＝1時，分別加入不同終濃度的iptg(0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、1.8mm、2.0mm)，經12％sds-page電泳分析。結果表明：當菌液od600＝1時，在溫度37℃、誘導時間14h的條件下，當iptg終濃度為1.0mm時，目的蛋白表達量最高，如圖6所示。

(3)最佳誘導溫度的確定

當od600值為0.8～1時，加入終濃度1mm的iptg，分別放入26℃、28℃、30℃、33℃、37℃搖床振蕩培養14h進行誘導表達，同時將未誘導菌液作為對照。

在iptg終濃度lmm、誘導時間14h的條件下，當od600＝1時加入終濃度1mm的iptg，分別放入26℃、28℃、30℃、33℃、37℃搖床誘導14h，經12％sds-page電泳分析。結果表明：當誘導溫度為33℃時，目的蛋白表達量最高，如圖7所示。

按照上述確定的最佳誘導時間、最佳誘導濃度、最佳誘導溫度對重組原核表達載體pet-21b-wzt進行誘導表達，在菌液od600＝1時，加入終濃度為lmm的iptg，33℃誘導14h後，獲得含有重組wzt蛋白的菌液。

(4)目的蛋白sds-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sds-page)鑑定

①配製sds-page凝膠，配製方法如下表所示。

②將收集得到的菌液od600統一調整至0.7，取500μl菌液於4℃，12000rpm離心5min，棄上清，用高溫滅菌的pbs吹打清洗菌體，然後4℃、12000rpm離心5min，棄上清，收集菌體。

③向菌體中各加入100μl1×sds-pageloadingbuffer，混勻，在沸水中煮10min，用於sds-page電泳。

④取出10μl上樣，非預染蛋白質marker點樣5μl，濃縮膠採用80v恆定電壓，分離膠採用120v恆定電壓，直至電泳完畢。電泳完畢取出凝膠，用考馬斯亮藍染色液染色，微波加熱30s，振蕩30min，然後用脫色液脫色1h，期間更換兩到三次脫色液，條帶清晰後凝膠成像觀察結果。

⑤sds-page鑑定結果：在大腸桿菌bl21(de3)中成功表達了大小約為27kda的目的蛋白。

(5)目的蛋白westernblot鑑定

①電轉移：sds-page結束後，按照凝膠相同大小剪裁硝酸纖維素膜(pvdf膜)及濾紙10片，將pvdf膜在甲醇中浸泡10s，將處理好的pvdf膜、濾紙放在轉膜緩衝液中浸泡30min。按如下的順序安裝：負極-濾紙(5片)-凝膠-pvdf膜-濾紙(5片)-正極，同時保證濾紙、pvdf膜、凝膠對齊，用玻璃棒輕輕地趕走氣泡。接通電源，以恆壓100v，電流不高於250ma的條件轉印50min。

②封閉：1g脫脂奶粉溶於20mlpbst中製成封閉液，將轉印好的pvdf膜置於封閉液中，室溫在搖床上輕輕搖動1h對其進行封閉，期間用pbst洗滌3次，每次2～3min，封閉完成後棄去封閉液。

③與一抗結合：加入抗組氨酸標籤的鼠單克隆抗體，抗體用封閉液稀釋，工作濃度為1:500，4℃孵育過夜，一抗孵育完畢後，用pbst將膜清洗3次，每次約5min。

④與二抗結合：加入辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠igg，抗體用封閉液稀釋，工作濃度為1:5000，室溫孵育2h，二抗孵育完畢後，用pbst將膜清洗3次，每次約5min。

⑤顯色：向膜上加入底物鄰苯二胺(dab)反應液，避光輕輕搖動幾分鐘，隨時觀察目的條帶顯現情況，待目的條帶出現後，立即加入去離子水終止反應並掃描保存。

(6)目的蛋白的可溶性分析

收集誘導的菌液100ml，在4℃、12000rpm離心10min，棄去上清，用高溫滅菌的pbs(ph7.5)吹打洗滌菌體4℃，12000rpm離心10min，棄去上清，重複洗滌一次，洗滌完成後加入超聲裂解緩衝液10ml吹打混勻菌體，超聲破碎菌體，超聲條件為4℃，工作2s，間歇3s，持續15min功率保持在220w左右。取1ml超聲破碎菌體溶液離心，取上清加入適量5×sds-pageloadingbuffer，沸水煮10min，sds-page檢測目的蛋白的可溶性。誘導表達的重組菌液經超聲破碎和離心後，取沉澱和上清進行sds-page分析，結果顯示目的蛋白即重組wzt蛋白具有一定的可溶性，如圖8所示。

(7)目的蛋白的純化

收集菌體，超聲破碎後4℃，12000rpm離心45min，上清用0.22μm濾膜過濾，然後用histrapff親和層析柱純化目的蛋白，按照洗脫、洗滌、平衡、上蛋白、洗脫雜蛋白、洗脫目的蛋白的步驟進行操作。對洗脫出的目的蛋白進行sds-page和westernblot分析，檢查純化效果並鑑定其是否可能是重組wzt蛋白。

誘導表達的重組菌液經超聲破碎後取上清過鎳柱純化，純化後分別取超聲破碎上清、雜蛋白洗脫下液、純化後蛋白進行sds-page分析，結果如圖9所示，在27.0kda左右蛋白純化有清晰條帶，純度較高。

sds-page後，將凝膠上的蛋白轉移至pvdf膜上，以抗his標籤的鼠單克隆抗體為一抗、hrp標記的山羊抗鼠igg為二抗，進行westernblot分析，如圖10所示，在約27kda處有一條明顯的蛋白印記，初步確定其可能為目的蛋白即重組wzt蛋白。

(8)純化後重組wzt蛋白的n端測序鑑定

採用基於edman降解法的n端序列分析方法對純化產物進行n端分析，按照第二部分第3步中的「(5)目的蛋白westernblot鑑定」的操作步驟，將純化產物轉移至pvdf膜上，取600μl、0.1％tfa溶液加入含pvdf膜的管中，放入恆溫混勻器中600rpm振蕩1min，去除上清，重複該步驟三次後將pvdf膜取出，待其自然晾乾後剪切成0.5cm2大小後上樣；將剪切好的pvdf膜放置到島津全自動蛋白質多肽測序儀(ppsq-33a)反應器中進行測試，採用19種同樣狀態的胺基酸混合的標準品進行校準。

測序鑑定結果如圖11所示，測得純化後重組wzt蛋白n端序列為：

nh2-met-ile-gln-pro-ser-ile-thr-leu-ser-asn，與目標蛋白n端序列完全一致，說明表達和純化得到的蛋白為目的蛋白即重組wzt蛋白。

應用bandscan進行灰度分析確定目的蛋白的純度為93％，同時根據：回收率＝(蛋白濃度×蛋白溶液體積×純度)/溼菌總重量×100％，計算得到蛋白的回收率為2％。

在不改變目的蛋白胺基酸及其排列順序的前提下，應用大腸桿菌偏好的密碼子對wzt基因進行優化，使得目的蛋白的表達量得到了明顯的提高，與未優化的wzt基因的表達量相比提高了近兩倍。優化蛋白誘導表達的時間、誘導劑濃度和溫度，使目的蛋白在實驗所設條件下能夠最大程度的可溶性表達，為蛋白的純化提供了先行條件。蛋白純化過程中優化洗脫液中咪唑的濃度和結合液的使用量以及純化體系，可以更好地去除雜蛋白，提高目的蛋白純化效率。表達的蛋白經wsesternblot和n端測序進一步確定表達的蛋白為目的蛋白，為後續蛋白功能的探索奠定了基礎。

三、重組wzt蛋白免疫原性試驗

作為布魯氏菌lps合成過程中的關鍵蛋白，wzt蛋白免疫原性的高低可以對研究布魯氏菌lps合成通路起到一定的作用和啟發。某一蛋白免疫機體後，測定其刺激機體產生的中和性抗體的水平可作為評價該蛋白免疫原性的依據。因此，本發明使用小鼠作為試驗的動物模型，以免疫後小鼠脾淋巴細胞增殖指數作為評判wzt蛋白免疫原性的標準。

1、抗原製備

利用上述製備的布魯氏菌的重組wzt蛋白作為抗原蛋白，將純化得到的重組wzt蛋白與等體積的弗氏完全和不完全佐劑混合進行乳化。

2、免疫方法

選取5周齡的雌性balb/c小鼠(體重18～20g)；將5周齡balb/c小鼠分為重組wzt蛋白免疫組和pbs組，每組7隻；一隻鼠一次免疫30μg重組wzt蛋白，共免疫3次，免疫間隔時間為兩周。

3、小鼠脾淋巴細胞的製備

(1)將免疫後的小鼠處死，在75％的酒精中浸泡15min。

(2)向培養皿中加入5ml小鼠脾淋巴細胞分離液，將脾臟置於200目的尼龍篩網上並覆蓋於培養皿上，小心研磨脾臟。

(3)取脾細胞懸液轉移至15ml離心管中，rpmi-1640培養基，1000rpm離心10min。

(4)吸取800μl上清，轉移至新的一個15ml離心管中，加入10ml培養基，800rpm離心5min，棄上清。

(5)加入5ml紅細胞裂解液搖晃混勻，靜置5min。然後800rpm離心5min，棄上清。

(6)加入10ml培養基吹打，在離心一次棄上清，計數後分裝存放於-80℃冰箱中備用。

4、小鼠脾淋巴細胞轉移實驗(mtt法)

測取od值，計算免疫後小鼠脾淋巴細胞增殖率。計算公式如下：

淋巴細胞增值率＝(od-od1640)/(odpbs-od1640)

od為測取的od值，od1640為rpmi-1640培養基od值，odpbs為pbs的od值。

重組wzt蛋白刺激小鼠脾淋巴細胞增殖實驗結果如圖12所示，重組wzt蛋白濃度為5μg/ml，重組wzt蛋白對小鼠脾淋巴細胞增殖百分數影響比cona高40％。

5、利用間接elisa方法檢測小鼠血清抗體效價

將6周齡balb/c小鼠分為重組wzt蛋白免疫組和pbs組，每組7隻；間隔兩周免疫一次，免疫劑量為30μg重組wzt蛋白，免疫3次；從免疫第2周開始進行斷尾取血，並置於37℃培養箱中放置2.5h，吸出血清保存備用。

以純化好的重組wzt蛋白作為抗原包被板子，包被條件為：100μl包被液、抗原終濃度5μg/ml、4℃過夜孵育；使用pbst洗滌多次，拍幹後將血清按1:1000的體積比稀釋後加入到包被好的板子中，每孔加入100μl，37℃孵育1h，免疫pbs的小鼠血清作為陰性對照，設立空白對照，做3個重複實驗，pbst洗滌後每孔加入100μl經1:3000的體積比稀釋後的二抗，37℃孵育0.5h，pbst清洗3次後，每孔加入100μlopd底物，室溫下避光反應10min，反應結束後每孔加入50μl終止液終止反應，靜置3min；在490nm波長處測定每孔od值，計算小鼠血清抗體的效價。

重組wzt蛋白免疫小鼠後用間接elisa方法檢測小鼠血清抗體變化情況，小鼠血清抗體效價消長曲線如圖13所示，重組wzt蛋白免疫小鼠後產生了抗體，抗體效價在第四周達到最高，最高值為1:4200，但抗體從第五周開始消失較快。

本發明檢測免疫後小鼠血清抗體的效價，觀察小鼠血清抗體igg效價的消長規律，以及wzt蛋白能夠刺激機體產生的最高抗體效價值，最終得到在免疫了重組wzt蛋白後小鼠特異性體液免疫水平。

四、重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體的製備

1、選取健康雌性家兔進行免疫，初次免疫：將500μg重組wzt蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化後，在家兔背部進行皮下多點注射，每點100μg重組wzt蛋白。

2、二次免疫：一周後，將400μg重組wzt蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化後，在家兔背部進行皮下多點注射，每點80μg重組wzt蛋白。

3、之後每間隔一周進行三次和四次免疫，免疫方法與二次免疫方法相同。

4、每次免疫後採取家兔耳靜脈血，以未進行免疫時的兔血清為對照，純化後重組wzt蛋白為抗原，應用間接elisa法檢測兔血清抗體效價，血清稀釋倍數分別為100、200、400、1600、3200、6400。

5、第四次免疫一周後，用心臟取血法採集兔全血，將收集的兔全血在37℃靜置2h，4℃靜置過夜，次日4000rpm，離心10min，收集上清，得到兔血清。

6、純化

(1)將兔血清與等體積的抗體結合緩衝液混合後，用0.22μm濾膜過濾。

(2)用10倍柱體積的抗體結合緩衝液平衡proteina柱子，將準備好的兔血清樣品用注射器緩慢打入到柱子中。

(3)用抗體結合緩衝液清洗柱子，洗脫雜蛋白，直至流出的下液中不含有蛋白成分。

(4)用抗體洗脫液過柱，洗脫抗體，收集流出的下液，並快速用ph9.0的tris-hcl調節ph至中性，收集重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體。

(5)測定收集的重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體蛋白含量，進行適當濃縮，清洗柱子。

7、重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體特異性檢測

將純化得到的重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔igg作為二抗，應用westernblot方法檢測牛布魯氏菌s19菌株、wzt基因缺失s19菌株、wzm基因缺失s19菌株、綠膿桿菌、糞腸球菌、緩慢葡萄球菌、鶉雞腸球菌、奇異變形菌和純化後wzt蛋白。具體檢測過程如下：

(1)電轉移：按照凝膠相同大小剪裁硝酸纖維素膜(pvdf膜)及濾紙10片，將pvdf膜在甲醇中浸泡10s，將處理好的pvdf膜、濾紙放在轉膜緩衝液中浸泡30min。按如下的順序安裝：負極-濾紙(5片)-凝膠-pvdf膜-濾紙(5片)-正極，同時保證濾紙、pvdf膜、凝膠對齊，用玻璃棒輕輕地趕走氣泡。接通電源，以恆壓100v，電流不高於250ma的條件轉印50min。

(2)封閉：1g脫脂奶粉溶於20mlpbst中製成封閉液，將轉印好的pvdf膜置於封閉液中，室溫在搖床上輕輕搖動1h對其進行封閉，期間用pbst洗滌3次，每次2～3min，封閉完成後棄去封閉液。

(3)與一抗結合：加入抗組氨酸標籤的重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體，抗體用封閉液稀釋，工作濃度為1:500，4℃孵育過夜，一抗孵育完畢後，用pbst將膜清洗3次，每次約5min。

(4)與二抗結合：加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔igg，抗體用封閉液稀釋，工作濃度為1:5000，室溫孵育2h，二抗孵育完畢後，用pbst將膜清洗3次，每次約5min。

(5)顯色：向膜上加入底物鄰苯二胺(dab)反應液，避光輕輕搖動幾分鐘，隨時觀察目的條帶顯現情況，待目的條帶出現後，立即加入去離子水終止反應並掃描保存。

檢測結果如圖14所示，結果顯示重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體在相應位置處能夠檢測到牛布魯氏菌s19菌株和wzm基因缺失s19菌株中的特異性條帶，而在wzt基因缺失s19菌株泳道上並未發現相應的特異性條帶，與綠膿桿菌、糞腸球菌、緩慢葡萄球菌、鶉雞腸球菌和奇異變形菌在相應位置處未發生特異性反應，說明該抗體特異性良好，並且能夠用於檢測wzt蛋白。

利用proteina柱子純化得到的重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體中包含的不僅僅有重組wzt蛋白相應的抗體，還包含兔血清中的全部igg，因此在westernblot試驗中容易造成非特異結合和背景顏色較深等情況，因此採用重組wzt蛋白與柱子填料結合，用於純化兔血清中的特異性重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體，進而提高抗體特異性。純化後得到的特異性重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體可用於檢測基因敲除菌株，也可以作為研究應用中的工具，檢測人為和天然的wzt基因缺失的菌株，並為後續試驗提供依據。

以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步的詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本領域的普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案和發明構思，做出相應改變和替代，而且得到與本發明具有相同胺基酸序列的多克隆抗體，其性能也必然相同，都應當視為本發明的保護範圍。

sequencelisting

吉林農業大學

重組wzt蛋白兔血清多克隆抗體及其製備方法

2

1

26

dna

人工

1

上遊引物-p1：5'-catatgatccagccatccattaccct-3'（下劃線部分為ndei酶切位點）。

2

21

dna

人工

2

下遊引物-p2：5'-ctcgagcgcaatcgcgcccat-3'（下劃線部分為xhoi酶切位點）