一種微生態製劑－四聯活菌製劑及其製備方法
2024-03-01 11:31:15 1
專利名稱：一種微生態製劑－四聯活菌製劑及其製備方法
技術領域：
一種微生態製劑——四聯活菌製劑及其製備方法，屬於微生態製劑技術領域。
背景技術：
近年來，隨著我國水產養殖業的迅速發展，高密度、集約化的水產養殖規模的日益擴大，養殖水體中高濃度的水產動物排洩物、大量投餵餌料造成的餌料殘餘及汙水的任意排放造成的天然水域的汙染，使養殖生態環境日益惡化。水產動物尤其是蝦蟹等甲殼類動物，免疫系統功能低下，主要依靠各種血細胞產生的非特異性物質如凝聚素溶菌酶等來發揮機體的非特異性免疫功能，在惡化的養殖水體環境中，易受致病細菌和病毒的攻擊，使各類疾病多發，降低養殖經濟效益。水產動物疾病尤其是病毒病大部分都發展快，危害大。通常的防治方法是施用一些抗生素和化學合成藥物對水體進行消毒、淨化處理，對環境及水產動物體內病菌的殺滅，從而達到控制疾病的效果。這種方法對於某些養殖環境惡化較為嚴重及細菌感染有一定的控制作用，但對於大多數苗種場，由於水產苗種抗病能力十分低下，且一旦患病就會出現大量死亡，使用藥物治療無明顯的效果。
抗生素及化學合成藥物長期使用或濫用，不僅導致病原菌的抗藥性耐藥性越來越明顯，用藥量也隨之增大，使用效果越來越差，甚至無效，而且造成藥物在水產品中殘留，降低了水產品的品質。此外，抗生素及化學合成藥物在殺滅病源菌的同時，也幹擾了水產動物體內及養殖水體有益微生物菌群的正常生長繁殖，減弱水產動物自身抗疾病能力，使水體及池底的汙染物及殘餌得不到及時有效的分解，水質逐漸惡化，破壞水體的生態平衡，從而誘發新一輪病害。因此，抗生素及化學藥品是一種被動的疾病防治辦法，不能從根本上提高水產動物的抗病能力，其作為一種應急手段來控制病害時，負面效果是顯而易見的。
用微生態製劑(Microbial ecological agent)進行水產養殖動物病害的防治是近年發展起來的一種新方法，具有無毒、無副作用、無殘留的優點。微生態製劑是基於微生態平衡理論、微生態營養理論及微生態防治理論而發展起來的微生物產品，它對動物疾病的防治是一種主動形式的防治，通過製劑中有益菌群來調整動物體內在營養、免疫、生長刺激、生物拮抗等方面發揮著重要作用的微生態平衡，抑制致病菌的生長，促進動物自身有益微生物的生長，增強其微生態的自我調節能力，防治並減少疾病的發生，提高宿主健康水平。在水產養殖中應用的微生態製劑，還能通過對水體有害物質的分解、病原菌的抑制及水體有益菌群的培育，來改善水質，維持水體生態平衡。
微生態製劑起初多用於治療人體的疾病，隨後微生態製劑開始用於養殖動物的疾病防治，用於製備飼用微生態製劑的微生物種類也日益增多，應用廣泛。1989年美國食品與藥物管理局(FDA)和美國飼料控制官員協會公布了可以直接飼餵且一般認為是安全的微生物菌種名單，共有41種，年使用量在8000噸以上。我國農業部2003年也已公布了乾酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等15種可以直接使用的飼料級微生物添加劑菌種。目前，國內微生態製劑主要應用於豬牛雞等禽畜養殖中，在水產品動物養殖中的應用處於起步階段。
在水產養殖中應用的微生態製劑按所含微生物種類的數量，可分為兩大類，即單一菌株型和多菌株複合型。單一菌株型如光合細菌製劑、芽孢桿菌製劑等，僅含一種微生物，無多菌種協同作用的優勢，相對來說存在作用單一、作用不持久的局限。因此，多菌株混合型製劑在水產養殖中的應用更多，常見有採用芽孢桿菌、硝化細菌、或光合細菌等按比例混合而成的混合型製劑。對此類混合型製劑的製備來說，微生物種類的選擇、配伍及製備工藝是關鍵，直接影響製劑的應用效果。
目前常見的水產養殖用微生態製劑如光合細菌製劑、芽孢桿菌製劑、硝化細菌製劑等，主要是利用光合細菌、芽孢桿菌、硝化細菌等微生物分解水體中過量的殘餘餌料、排洩廢物、動植物殘體等對水產動物有害的有機和無機物質、抑制病原菌的生長，通過養殖水體環境的改善來達到對疾病的防治效果。此外，有的製劑如光合細菌製劑，其微生物自身富含蛋白質等營養物質，通過被吞食為動物補充營養，促進生長，增強對疾病抵抗能力。因此，這些產品對水產動物病害的防治是通過從改善水體環境或補充營養的角度來實現的，並不直接通過參與水產動物體內微生態平衡的調整，來抑制致病菌的生長，促進動物自身有益微生物的生長，增強其微生態的自我調節能力，提高水產動物自身抗病能力。由此，基於上述背景，如果可以開發出兼有直接參與水產動物體內微生態平衡的調整、促進生長，同時又能改善水質的微生態製劑，應用於水產養殖的疾病防治，則對減少抗生素和化學藥物的使用，生產無汙染的綠色水產品，提高養殖經濟效益具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在於獲得一種水產養殖用微生態製劑-四聯活菌製劑的配方組成及其製備方法。
本發明的技術方案「四聯活菌製劑」是多菌株混合型活菌製劑，以酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌四種有益微生物及生物活性鈣-L-乳酸鈣為特徵組分進行配伍，採用通用發酵罐純種培養或混合培養四種微生物，低溫乾燥製備活菌原菌粉，按特定配比復配而成。
該四聯活菌製劑是由酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)CGMCCNo.1647、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1.539、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1414和酵母菌(Sacccharomycescerevisiae)CGMCC 2.614四種益生菌與L-乳酸鈣和沸石粉復配而成；製劑中活菌總數分別為枯草芽孢桿菌活菌總數≥1×107CFU/克，酪酸梭狀芽孢桿菌活菌總數≥1×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌總數≥1×109CFU/克，酵母菌活菌總數≥1×106CFU/克，製劑中L-乳酸鈣的質量含量為6％-10％，沸石粉的質量含量為40％-45％。
該四聯活菌製劑是以微生物純種培養獲得的原菌粉配製而得，其質量百分配比(1)為枯草芽孢桿菌原菌粉2-2.5酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉20-25乾酪乳桿菌原菌粉5-6.5酵母菌原菌粉20-25L-乳酸鈣6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢桿菌原菌粉中枯草芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克乾酪乳桿菌原菌粉中乾酪乳桿菌活菌數≥2×1010CFU/克酵母菌原菌粉中酵母菌活菌數≥5×106CFU/克。
或該四聯活菌製劑是以枯草芽孢桿菌純種培養獲得的原菌粉和以酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌的混合培養獲得的含酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌的混合原菌粉配製而得，其質量百分配比(2)為枯草芽孢桿菌原菌粉2-2.5混合原菌粉45-52L-乳酸鈣6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢桿菌原菌粉中枯草芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克，混合原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥2.4×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌數≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌數≥2.4×106CFU/克。
該四聯活菌製劑的製備方法是由酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)CGMCC No.1647、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1.539、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1414和酵母菌(Sacccharomycescerevisiae)CGMCC 2.614四種益生菌與L-乳酸鈣和沸石粉復配而成。
A.活性菌體的培養和原菌粉的製備(1)製備枯草芽孢桿菌的原菌粉菌種活化枯草芽孢桿菌的凍幹菌種，劃線接種於營養肉湯瓊脂斜面，30-40℃培養18-24小時，然後劃線轉接於營養肉湯瓊脂茄子瓶斜面，30-40℃培養20-24小時，鏡檢，至90％以上菌體形成芽孢，即為成熟。
種子培養將成熟菌泥用無菌水刮洗，裝入內裝玻璃珠的無菌三角瓶，振蕩，獲得均勻的菌懸液，將菌懸液在70-90℃水浴中加熱5-15分鐘，以體積比2％-10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為60％-70％體積比。
種子培養基組成為葡萄糖3-5g，蛋白腖5-10g，酵母膏3-5g，NaCl 5g，自來水定容至1000ml，pH7.0-7.5，培養條件為攪拌轉速100-200r/min，通氣量1-2m3/h，培養溫度為30-40℃，培養時間為16-20h。
發酵罐培養種子培養液以體積比5％-20％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為60％-70％體積比，發酵罐培養的培養基由碳源、氮源和無機鹽組成，碳源用葡萄糖或澱粉，含量為5-15g/L；氮源用蛋白腖、酵母膏、黃豆餅粉或花生餅粉，含量為10-20g/L，無機鹽為NaCl 5g/L，培養條件為攪拌轉速100-200r/min，通氣量1-2m3/h，培養溫度為30-40℃，培養時間為16-20h，鏡檢，至90％以上的菌體已形成芽孢時，放罐結束培養。
菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體。
枯草芽孢桿菌原菌粉的製備收集溼菌體，與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，在40-50℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節枯草芽孢桿菌的活菌數≥5×108CFU/克，即為枯草芽孢桿菌原菌粉。
(2)製備酪酸梭狀芽孢桿菌的原菌粉菌種活化酪酸梭狀芽孢桿菌的凍幹菌種，接入活化培養基，靜置厭氧培養，活化培養基組成蛋白腖10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，可溶性澱粉1g，NaCl5g，NaAc 3g，鹽酸半胱氨酸0.5g，CaCO33g，蒸餾水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃培養24-48h，以體積比5％-15％的接種量轉接於新鮮活化培養基，30-40℃培養24-48h，鏡檢，至90％以上菌體形成芽孢時，即為成熟。
種子培養菌液在70-90℃水浴中加熱5-15分鐘，以體積比2％-10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為70％-80％體積比，種子培養基組成為蛋白腖5-10g，牛肉浸膏5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-10g，澱粉0.5-1g，NaCl 5g，NaAcl-3g，CaCO31-3g，蒸餾水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃靜置厭氧培養16-24h。
發酵罐培養種子培養液以體積比5％-20％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為70％-80％體積比，發酵罐培養的培養基組成為蛋白腖5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-15g，澱粉0.5-1g，NaCl 5g，NaAc 1-3g，CaCO33-10g，自來水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃靜置厭氧培養24-48h，鏡檢，至90％以上菌體形成芽孢時，即放罐結束培養。
菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體。
酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉的製備將酪酸梭狀芽孢桿菌溼菌體與幹澱粉以質量量比1∶1-5混合，40-50℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節酪酸梭狀芽孢桿菌的活菌數≥5×108CFU/克，即為酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉。
(3)製備乾酪乳桿菌原菌粉菌種活化乾酪乳桿菌的凍幹菌種，接入活化培養基，靜置厭氧培養，活化培養基組成為蛋白腖10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2g，NaAc 5g，葡萄糖20g，吐溫-80 1g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，CaCO320g蒸餾水定容至1000ml，pH6.8，30-40℃培養24-48h，以體積比5％-15％的接種量轉接於新鮮活化培養基，30-40℃培養24-48h。
種子培養活化菌液以體積比2％-10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為70％-80％體積比，種子培養基組成蛋白腖5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-10g，CaCO35-10g，KH2PO41-5g，蒸餾水定容至1000ml，pH6.5-7.0，30-40℃靜置厭氧培養24-48h。
發酵罐培養種子培養液以體積比10％-20％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為70％-80％體積比，發酵罐培養的培養基組成葡萄糖10-20g，蛋白腖5-10g，酵母浸膏3-10g，KH2PO41-5g，(NH4)2SO42-5g，CaCO310-20g，自來水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃靜置厭氧培養24-48h。
菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體。
乾酪乳桿菌原菌粉的製備乾酪乳桿菌溼菌體與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，35-45℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節乾酪乳桿菌的活菌數≥2×1010CFU/克，即為乾酪乳桿菌原菌粉。
(4)製備酵母菌原菌粉菌種活化酵母菌凍幹菌種，接入活化培養基，靜置厭氧培養，活化培養基組成為12Brix.麥芽汁，30-40℃培養20-24h，以體積比5％-15％的接種量轉接於新鮮活化培養基，30-40℃培養16-20h。
種子培養活化菌液以體積比2％-10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為70％-80％體積比，種子培養基組成為酵母浸膏3g，葡萄糖5-10g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.1g，KH2PO42g，自來水定容至1000ml，pH4-6，攪拌轉速100-150r/min，通氣量0.5-1m3/h，28-30℃培養16-20h發酵罐培養種子培養液以體積比5％-10％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為70％-80％體積比，發酵罐培養基組成為酵母浸膏3g，葡萄糖10-15g，(NH4)2SO43g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，自來水定容至1000ml，pH4-6，攪拌轉速100-200r/min，通氣量1-2m3/h，28-30℃培養20-24h。
菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體。
酵母菌原菌粉的製備將酵母菌溼菌體與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，35-45℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節酵母菌的活菌數≥5×106CFU/克，即為酵母菌原菌粉。
(5)製備酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌的混合原菌粉發酵罐培養將酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌的種子培養液分別以體積比5％-10％、10％-15％、2％-6％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為70％-80％體積比，發酵罐培養基組成為葡萄糖或紅糖20-40g，蛋白腖3-8g，酵母浸膏2-6g，KH2PO41-5g，(NH4)2SO42-5g，NaCl 3g，CaCO31-5g，NaAc 1-3g，自來水定容至1000ml，pH 6.5-7.0，30-40℃靜置厭氧培養24-48h。
菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得混合溼菌體。
混合原菌粉的製備將混合溼菌體與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，35-45℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥2.4×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌數≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌數≥2.4×106CFU/克，即為混合原菌粉。
B.四聯活菌製劑的配製L-乳酸鈣、沸石粉過40目篩後，與原菌粉按配比(1)或配比(2)進行配料，用飼料混合機拌勻，使成品中枯草芽孢桿菌活菌總數≥1×107CFU/克，酪酸梭狀芽孢桿菌活菌總數≥1×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌總數≥1×109CFU/克，酵母菌活菌總數≥1×106CFU/克，成品採用鋁箔袋裝。
配比(1)質量百分比為枯草芽孢桿菌原菌粉2-2.5酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉20-25乾酪乳桿菌原菌粉5-6.5酵母菌原菌粉20-25L-乳酸鈣6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢桿菌原菌粉中枯草芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克乾酪乳桿菌原菌粉中乾酪乳桿菌活菌數≥2×1010CFU/克酵母菌原菌粉中酵母菌活菌數≥5×106CFU/克。
配比(2)質量百分比為
枯草芽孢桿菌原菌粉2-2.5混合原菌粉45-52L-乳酸鈣6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢桿菌原菌粉中枯草芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克，混合原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥2.4×108CFU/克、乾酪乳桿菌活菌數≥2.4×109CFU/克與酵母菌活菌數≥2.4×106CFU/克。
本發明的有益效果本製劑具有不需氧分解有機物的特點，製劑中所含微生物活化快，繁殖能力強，在養殖水體中易形成有益的優勢菌。利用其中所含的酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌四種微生物的厭氧、好氧特性，在增強水產動物抗病能力及養殖水體的水質淨化方面發揮協同作用，能替代或部分替代抗生素應用於淡水和海水水產養殖的疾病防治，提高水產養殖經濟效益。製劑中L-乳酸鈣對水產動物尤其是蝦蟹等甲殼類水產動物具有促進脫殼生長、預防軟殼症的作用。本製劑的組分均天然存在於自然界，無毒、無副作用、無殘留和二次汙染，不產生耐藥性，在淡水養殖和海水養殖中具有廣闊的市場應用。
養殖全過程均可使用本製劑，在養殖水體中潑灑或在水產動物的餌料中添加四聯活菌製劑，，每畝每米水深潑灑本製劑100-1000克或在餌料中以質量計添加本製劑0.1％-1％，通過水產動物的吞食，進入水產動物體內，調整其自身的益生菌群平衡，提高免疫機能，增強抗感染能力，維護水產養殖動物體內微生態平衡，防治疾病的發生；酵母菌菌體含有多種維生素和生長因子，對水產動物具有營養作用；L-乳酸鈣是L-乳酸的鈣鹽，L-乳酸天然存在於動物體內，其鈣鹽-L-乳酸鈣在補充水產動物生長所需鈣質時，更易吸收利用，對蝦蟹等甲殼類水產動物具有促進脫殼生長、預防軟殼症的作用。
在養殖水體中潑灑本製劑，能高效分解塘底汙染、排洩廢物、殘餘餌料、動植物殘體等對水產動物有害物質，淨化水質，改善養殖水體環境，抑制病原菌的生長，增強對疾病的防治效果。
生物材料樣品保藏及來源說明酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)JSIM-MCB20040312保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏日期為2006年3月10日，保藏號為CGMCC No.1647。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)購自CGMCC，菌株編號1.1414，參見CGMCC菌種目錄 第三版，1997，細菌P12，倒數第3種。
乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)購自CGMCC，菌株編號1.539，參見CGMCC菌種目錄 第三版，1997，細菌P43，第2種。
酵母(Sacccharomyces cerevisiae)購自CGMCC，菌株編號2.614，參見CGMCC菌種目錄第三版，1997，酵母菌P80，第7種。
圖1四聯活菌製劑製備工藝框圖。
具體實施方案實施例1活菌體的純種培養(1)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CGMCC1.1414)的純種培養菌種活化無菌開啟枯草芽孢桿菌的凍幹菌種，劃線接種於試管營養肉湯瓊脂斜面，37℃培養18-24h，然後劃線轉接於營養肉湯瓊脂茄子瓶斜面，37℃培養20-24h，鏡檢，當90％以上菌體形成芽孢時，即為成熟，準備移種。
種子培養準備一個內裝玻璃珠的無菌三角瓶，用無菌水將茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下來，裝入三角瓶，振蕩分散菌泥，獲得均勻的菌懸液。將菌懸液在85℃水浴中加熱5分鐘，以體積比5％的接種量接入0.1m3種子罐.種子罐的裝量係數為60％(v/v)。
種子培養基組成為葡萄糖3g，蛋白腖5g，酵母膏3g，NaCl 5g，自來水定容至1000ml，pH 7.0-7.5，37℃培養17h，攪拌轉速150r/min，通氣量1-2m3/h。
發酵罐培養種子培養液以體積比10％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為65％(v/v)，發酵罐培養的培養基組成為葡萄糖10g，黃豆餅粉10g，無機鹽為NaCl 5g，自來水定容至1000ml，37℃培養20h，攪拌轉速150r/min，通氣量1.5m3/h。在培養過程中根據泡沫的高漲情況，加豆油或泡敵進行消泡，防止因泡沫逃逸出發酵罐而引起雜菌汙染的情況。取發酵液進行鏡檢，當90％以上的菌體已形成芽孢時，即放罐結束培養。
菌體收集將培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體，供製備枯草桿菌原菌粉。
(2)酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum JSIM-MCB-20040312)的純種培養菌種活化無菌開啟酪酸梭狀芽孢桿菌的凍幹菌種，接入裝有活化培養基的試管，進行靜置厭氧培養。活化培養基組成為蛋白腖10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，可溶性澱粉1g，NaCl 5g，NaAc 3g，鹽酸半胱氨酸0.5g，CaCO33g，蒸餾水定容至1000ml，pH7.0，37℃培養24h，然後以體積比10％的接種量轉接於新鮮活化培養基，37℃培養35h，鏡檢，當90％以上菌體形成芽孢時，即成熟，準備移種。
種子培養活化菌液在85℃水浴中加熱5分鐘，以體積比10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為80％(v/v)。種子培養基組成為蛋白腖5g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖5g，澱粉0.5g，NaCl 5g，NaAc 3g，CaCO31g，蒸餾水定容至1000ml，pH7.0，37℃靜置厭氧培養20h。
發酵罐培養種子培養液以體積比10％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為80％(v/v)，發酵罐培養基組成為蛋白腖7g，酵母浸膏3g，葡萄糖5g，可溶性澱粉1g，NaCl 5g，NaAc 3g，CaCO33g，自來水定容至1000ml，pH 7.0，37℃靜置厭氧培養40h，鏡檢，當90％以上菌體形成芽孢時，即放罐結束培養。
菌體收集將培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體，供製備酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉。
(3)乾酪乳桿菌((Lactobacillus casei CGMCC1.539)的純種培養菌種活化無菌開啟乾酪乳桿菌的凍幹菌種，接入裝有活化培養基的試管，進行靜置厭氧培養。
活化培養基組成為蛋白腖10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2g，NaAc 5g，葡萄糖20g，吐溫-80 1g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320g蒸餾水定容至1000ml，pH6.8，30℃培養30h，然後以體積比8％的接種量轉接於新鮮活化培養基，30℃培養24h。
種子培養活化菌液以體積比5％的接種量接入0.1m3種子罐。種子罐的裝量係數為80％(v/v)，種子培養基組成為蛋白腖10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，CaCO37g，KH2PO42g，蒸餾水定容至1000ml，pH6.5-7.0，30℃靜置厭氧培養30h。
發酵罐培養種子培養液以體積比15％的接種量接入1m3發酵罐.發酵罐裝量係數為80％(v/v)，發酵罐培養的培養基組成為葡萄糖10g，蛋白腖5g，酵母浸膏5g，KH2PO42g，(NH4)2SO43g，CaCO315g，自來水定容至1000ml，pH 7.0，30℃靜置厭氧培養36h。
菌體收集將培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體，供製備乾酪乳桿菌原菌粉。
(4)酵母菌(Sacccharomyces cerevisiae CGMCC2.614)的純種培養菌種活化無菌開啟酵母的凍幹菌種，接入裝有活化培養基的試管，進行靜置厭氧培養。
活化培養基組成為12Brix.麥芽汁，30℃培養24h，然後以體積比5％的接種量轉接於新鮮活化培養基，30℃培養16h。
種子培養活化菌液以體積比5％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為70％(v/v)，種子培養基組成為酵母浸膏3g，葡萄糖5g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，KH2PO42g，自來水定容至1000ml，pH5，30℃培養18h，攪拌轉速100r/min，通氣量0.5m3/h。
發酵罐培養種子培養液以體積比5％的接種量接1m3發酵罐，裝量係數為70％(v/v)，發酵罐培養基組成為酵母浸膏3g，葡萄糖10-15g，(NH4)2SO43g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.1g，自來水定容至1000ml，pH 5，30℃培養20h，攪拌轉速100r/min，通氣量1m3/h。
菌體收集將培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體，供製備酵母菌原菌粉。
實施例2酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌活菌體的混合培養菌種活化酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌、酵母菌凍幹菌種的活化與實施例1中所述相同。
種子培養酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌、酵母菌的種子培養與實施例1中所述相同。
發酵罐培養將酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌、酵母菌的種子培養液分別以6％、12％、2％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為80％(v/v)。
發酵罐培養基組成為紅糖20g，蛋白腖5g，酵母浸膏3g，KH2PO41g，(NH4)2SO42g，NaCl 3g，CaCO33g，NaAc 3g，自來水1000ml，pH 7.0，35℃靜置厭氧培養48h。
菌體收集將培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體，供製備酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌和酵母菌的混合原菌粉。
實施例3微生物純菌種原菌粉的製備(1)枯草芽孢桿菌原菌粉將純種培養後收集的枯草芽孢桿菌溼菌體與幹澱粉以質量比例1∶2進行混合，在40-50℃下低溫乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節原菌粉中枯草芽孢桿菌的活菌總數≥5×108CFU/克。
(2)酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉將純種培養後收集的酪酸梭狀芽孢桿菌溼菌體與幹澱粉以質量比例1∶2.5進行混合，在40-50℃下低溫乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌的活菌總數≥5×108CFU/克。
(3)乾酪乳桿菌原菌粉將純種培養後收集的乾酪乳桿菌溼菌體與幹澱粉以質量比1∶2混合，在35-45℃下低溫乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節原菌粉中乾酪乳桿菌的活菌總數≥2×1010CFU/克。
(4)酵母菌原菌粉將純種培養後收集的酪酸梭狀芽孢桿菌溼菌體與幹澱粉以質量比1∶5混合，在35-45℃下低溫乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節原菌粉中酵母菌的活菌總數≥5×106CFU/克。
實施例4混合原菌粉的製備將酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌和酵母菌混合培養後收集的混合溼菌體與幹澱粉以質量比例1∶2進行混合，在35-45℃下低溫乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節混合原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌總數≥2.4×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌總數≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌總數≥2.4×106CFU/克。
實施例5四聯活菌製劑成品的製備L-乳酸鈣、沸石粉過40目篩後，與原菌粉按下表所列的配比，用飼料混合機拌勻，使成品中枯草芽孢桿菌活菌總數≥1×107CFU/克，酪酸梭狀芽孢桿菌活菌總數≥1×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌總數≥1×109CFU/克，酵母菌活菌總數≥1×106CFU/克。成品採用鋁箔袋裝，每袋裝量1kg，15袋為1個紙箱包裝，紙箱材料採用瓦楞紙。
表1 按配比(1)的5例質量百分組成
表2 按配比(2)的4例質量百分組成
權利要求
1.一種四聯活菌製劑，其特徵是由酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)CGMCC No.1647、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1.539、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1414和酵母菌(Sacccharomycescerevisiae)CGMCC 2.614四種益生菌與L-乳酸鈣和沸石粉復配而成；製劑中活菌總數分別為枯草芽孢桿菌活菌總數≥1×107CFU/克，酪酸梭狀芽孢桿菌活菌總數≥1×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌總數≥1×109CFU/克，酵母菌活菌總數≥1×106CFU/克，製劑中L-乳酸鈣的質量含量為6％-10％，沸石粉的質量含量為40％-45％。
2.根據權利要求1所述的四聯活菌製劑，其特徵是以微生物純種培養獲得的原菌粉配製而得，其質量百分配比(1)為枯草芽孢桿菌原菌粉2-2.5酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉20-25乾酪乳桿菌原菌粉5-6.5酵母菌原菌粉20-25L-乳酸鈣6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢桿菌原菌粉中枯草芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克乾酪乳桿菌原菌粉中乾酪乳桿菌活菌數≥2×1010CFU/克酵母菌原菌粉中酵母菌活菌數≥5×106CFU/克。
3.根據權利要求1所述的四聯活菌製劑，其特徵是以枯草芽孢桿菌純種培養獲得的原菌粉和以酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌的混合培養獲得的含酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌的混合原菌粉配製而得，其質量百分配比(2)為枯草芽孢桿菌原菌粉2-2.5混合原菌粉45-52L-乳酸鈣6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢桿菌原菌粉中枯草芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克，混合原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥2.4×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌數≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌數≥2.4×106CFU/克。
4.一種如權利要求1、2或3所述四聯活菌製劑的製備方法，其特徵是由酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)CGMCC No.1647、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1.539、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1414和酵母菌(Sacccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.614四種益生菌與L-乳酸鈣和沸石粉復配而成；A.活性菌體的培養和原菌粉的製備(1)製備枯草芽孢桿菌的原菌粉菌種活化枯草芽孢桿菌的凍幹菌種，劃線接種於營養肉湯瓊脂斜面，30-40℃培養18-24小時，然後劃線轉接於營養肉湯瓊脂茄子瓶斜面，30-40℃培養20-24小時，鏡檢，至90％以上菌體形成芽孢，即為成熟；種子培養將成熟菌泥用無菌水刮洗，裝入內裝玻璃珠的無菌三角瓶，振蕩，獲得均勻的菌懸液，將菌懸液在70-90℃水浴中加熱5-15分鐘，以體積比2％-10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為60％-70％體積比，種子培養基組成為葡萄糖3-5g，蛋白腖5-10g，酵母膏3-5g，NaCl 5g，自來水定容至1000ml，pH7.0-7.5，培養條件為攪拌轉速100-200r/min，通氣量1-2m3/h，培養溫度為30-40℃，培養時間為16-20h；發酵罐培養種子培養液以體積比5％-20％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為60％-70％體積比，發酵罐培養的培養基由碳源、氮源和無機鹽組成，碳源用葡萄糖或澱粉，含量為5-15g/L；氮源用蛋白腖、酵母膏、黃豆餅粉或花生餅粉，含量為10-20g/L，無機鹽為NaCl 5g/L，培養條件為攪拌轉速100-200r/min，通氣量1-2m3/h，培養溫度為30-40℃，培養時間為16-20h，鏡檢，至90％以上的菌體已形成芽孢時，放罐結束培養；菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體；枯草芽孢桿菌原菌粉的製備收集溼菌體，與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，在40-50℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節枯草芽孢桿菌的活菌數≥5×108CFU/克，即為枯草芽孢桿菌原菌粉；(2)製備酪酸梭狀芽孢桿菌的原菌粉菌種活化酪酸梭狀芽孢桿菌的凍幹菌種，接入活化培養基，靜置厭氧培養，活化培養基組成蛋白腖10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，可溶性澱粉1g，NaCl5g，NaAc 3g，鹽酸半胱氨酸0.5g，CaCO33g，蒸餾水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃培養24-48h，以體積比5％-15％的接種量轉接於新鮮活化培養基，30-40℃培養24-48h，鏡檢，至90％以上菌體形成芽孢時，即為成熟；種子培養菌液在70-90℃水浴中加熱5-15分鐘，以體積比2％-10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為70％-80％體積比，種子培養基組成為蛋白腖5-10g，牛肉浸膏5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-10g，澱粉0.5-1g，NaCl 5g，NaAc1-3g，CaCO31-3g，蒸餾水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃靜置厭氧培養16-24h；發酵罐培養種子培養液以體積比5％-20％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為70％-80％體積比，發酵罐培養的培養基組成為蛋白腖5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-15g，澱粉0.5-1g，NaCl 5g，NaAc 1-3g，CaCO33-10g，自來水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃靜置厭氧培養24-48h，鏡檢，至90％以上菌體形成芽孢時，即放罐結束培養；菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體；酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉的製備將酪酸梭狀芽孢桿菌溼菌體與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，40-50℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節酪酸梭狀芽孢桿菌的活菌數≥5×108CFU/克，即為酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉；(3)製備乾酪乳桿菌原菌粉菌種活化乾酪乳桿菌的凍幹菌種，接入活化培養基，靜置厭氧培養，活化培養基組成為蛋白腖10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2g，NaAc 5g，葡萄糖20g，吐溫-801g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，CaCO320g，蒸餾水定容至1000ml，pH6.8，30-40℃培養24-48h，以體積比5％-15％的接種量轉接於新鮮活化培養基，30-40℃培養24-48h；種子培養活化菌液以體積比2％-10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為70％-80％體積比，種子培養基組成蛋白腖5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-10g，CaCO35-10g，KH2PO41-5g，蒸餾水定容至1000ml，pH6.5-7.0，30-40℃靜置厭氧培養24-48h；發酵罐培養種子培養液以體積比10％-20％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為70％-80％體積比，發酵罐培養的培養基組成葡萄糖10-20g，蛋白腖5-10g，酵母浸膏3-10g，KH2PO41-5g，(NH4)2SO42-5g，CaCO310-20g，自來水定容至1000ml，pH7.0，30-40℃靜置厭氧培養24-48h；菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體；乾酪乳桿菌原菌粉的製備乾酪乳桿菌溼菌體與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，35-45℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節乾酪乳桿菌的活菌數≥2×1010CFU/克，即為乾酪乳桿菌原菌粉；(4)製備酵母菌原菌粉菌種活化酵母菌凍幹菌種，接入活化培養基，靜置厭氧培養，活化培養基組成為12Brix.麥芽汁，30-40℃培養20-24h，以體積比5％-15％的接種量轉接於新鮮活化培養基，30-40℃培養16-20h；種子培養活化菌液以體積比2％-10％的接種量接入0.1m3種子罐，裝量係數為70％-80％體積比，種子培養基組成為酵母浸膏3g，葡萄糖5-10g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.1g，KH2PO42g，自來水定容至1000ml，pH4-6，攪拌轉速100-150r/min，通氣量0.5-1m3/h，28-30℃培養16-20h；發酵罐培養種子培養液以體積比5％-10％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為70％-80％體積比，發酵罐培養基組成為酵母浸膏3g，葡萄糖10-15g，(NH4)2SO43g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，自來水定容至1000ml，pH4-6，攪拌轉速100-200r/min，通氣量1-2m3/h，28-30℃培養20-24h；菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得溼菌體；酵母菌原菌粉的製備將酵母菌溼菌體與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，35-45℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節酵母菌的活菌數≥5×106CFU/克，即為酵母菌原菌粉；(5)製備酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌的混合原菌粉發酵罐培養將酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌與酵母菌的種子培養液分別以體積比5％-10％、10％-15％、2％-6％的接種量接入1m3發酵罐，裝量係數為70％-80％體積比，發酵罐培養基組成為葡萄糖或紅糖20-40g，蛋白腖3-8g，酵母浸膏2-6g，KH2PO41-5g，(NH4)2SO42-5g，NaCl 3g，CaCO31-5g，NaAc 1-3g，自來水定容至1000ml，pH 6.5-7.0，30-40℃靜置厭氧培養24-48h；菌體收集培養液泵入轉速為15000r/min的連續式離心機進行離心，棄上清液，獲得混合溼菌體；混合原菌粉的製備將混合溼菌體與幹澱粉以質量比1∶1-5混合，35-45℃乾燥20-24h，粉碎機粉碎，過40目篩，用幹澱粉調節酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥2.4×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌數≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌數≥2.4×106CFU/克，即為混合原菌粉；B.四聯活菌製劑的配製L-乳酸鈣、沸石粉過40目篩後，與原菌粉按配比(1)或配比(2)進行配料，用飼料混合機拌勻，使成品中枯草芽孢桿菌活菌總數≥1×107CFU/克，酪酸梭狀芽孢桿菌活菌總數≥1×108CFU/克，乾酪乳桿菌活菌總數≥1×109CFU/克，酵母菌活菌總數≥1×106CFU/克，成品採用鋁箔袋裝；配比(1)質量百分比為枯草芽孢桿菌原菌粉2-2.5酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉20-25乾酪乳桿菌原菌粉5-6.5酵母菌原菌粉20-25L-乳酸鈣6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢桿菌原菌粉中枯草芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克酪酸梭狀芽孢桿菌原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克乾酪乳桿菌原菌粉中乾酪乳桿菌活菌數≥2×1010CFU/克酵母菌原菌粉中酵母菌活菌數≥5×106CFU/克。配比(2)質量百分比為枯草芽孢桿菌原菌粉2-2.5混合原菌粉45-52L-乳酸鈣6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢桿菌原菌粉中枯草芽孢桿菌活菌數≥5×108CFU/克，混合原菌粉中酪酸梭狀芽孢桿菌活菌數≥2.4×108CFU/克、乾酪乳桿菌活菌數≥2.4×109CFU/克與酵母菌活菌數≥2.4×106CFU/克。
5.一株酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)JSIM-MCB20040312，菌株保藏編號為CGMCC No.1647。
全文摘要
一種微生態製劑－四聯活菌製劑及其製備方法，屬於微生態製劑技術領域。本發明的活菌製劑是以酪酸梭狀芽孢桿菌、乾酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌四種有益微生物及L－乳酸鈣為特徵組分，採用通用發酵罐純種或混合培養，低溫乾燥製備活菌原菌粉，按特定配比復配而成。本製劑利用相關菌株的厭氧、好氧特性，在增強水產動物抗病能力及養殖水體的水質淨化方面發揮協同作用，能替代或部分替代抗生素應用於淡水和海水水產養殖的疾病防治，提高水產養殖經濟效益。L－乳酸鈣組分對蝦蟹等甲殼類水產動物具有促進脫殼生長、預防軟殼症的作用。本製劑組分無毒、無副作用、無殘留和二次汙染，不產生耐藥性，在淡水養殖和海水養殖中具有廣闊的市場應用。
文檔編號C02F3/34GK1844364SQ20061004020
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月11日 優先權日2006年5月11日
發明者陸茂林, 孫梅, 匡群, 施大林, 劉淮, 何義進 申請人:江蘇省微生物研究所有限責任公司