微生物固體菌劑及其製備方法和應用的製作方法

2024-04-05 12:16:05

專利名稱：：微生物固體菌劑及其製備方法和應用的製作方法微生物固體菌劑及其製備方法和應用
技術領域：
-本發明主要涉及微生物的發酵方法,尤其涉及利用食品行業產生的廢液廢渣製備酵母融合菌(F306)、白地黴菌(G361)和根黴菌(R)三菌組合的FGR固體菌劑的方法和應用。
背景技術：
：-傳統的微生物菌劑的製備方法，所用原料是葡萄糖、蛋白腖、糖蜜、牛肉膏、維生素，無機鹽和水配製成液體培養基，從試管斜面菌種上刮取菌苔接種在液體培養基中，經好氧#氧培養製備成液體菌劑或將液體菌種接種在由玉米粉、麩皮、豆面、籽餅、豆粕和米糠等原料組成的固料培養基上，發酵製備成固體菌劑。其缺點是所用原料成本高，生產工藝複雜，不能節約能源。傳統的微生物菌劑製備所採用的微生物菌種大多是從國家或地方菌種庫或直接從自然界分離篩選出的菌種，其缺點是l.微生物菌種的活性差；2.對有機物分解轉化能力弱；3.這些菌種所製備的菌劑活細胞數少，大多數在108個/克。混合菌劑傳統做法，是將各種不同的菌種(好氧和厭氧)在各自不同的生長環境中培養菌種，然後從^菌種的培養物中刮取菌苔製取^h菌的液體菌懸液，再轉種於各自的液體培養液經通氣或厭氧發酵培養後離心製取活性細胞菌，將沉澱物噴霧乾燥製成粉劑，製成多菌的混合。其缺點是製備工藝複雜，發酵周期長，成本高，應用受到限制。
發明內容本發明的目的在於避免現有微生物固體菌劑生產技術不足之處而提供一種微生物固體菌劑及其製備方法和應用。使用酵母融合菌與白地黴菌和根黴菌科學配伍，以新鮮豆腐或粉絲或玉米或洋芋澱粉產生的廢渣及農業秸稈為原料，添加少量無機鹽，培養料不滅菌，三種菌在同一條件下製備酵母融合菌、白地每菌和根黴菌固體菌劑的製備方法。該方法是利用食品行業產生的廢渣為原料，生產過程無"三廢"汙染，生產工藝簡單，操作方便，節省人力，節省能源，其固體菌劑，即可用於有機廢水淨化劑，又可作為微生物飼料和微生物肥料，也可以用於石油開採、食品工業、環境工程、醫療和精細化工等行業。本發明可以通過採用以下技術方案實現一種微生物固體菌劑，其特點在於由酵母融合菌、白地黴菌(GeotrichumCandidumLink)、根黴菌(Rhizopus)和固體培養基組成，其三種菌株的重量百分比為酵母融合菌為5565。%、白地黴菌為3035%、根黴菌510%，所述的酵母融合菌的保藏號為CGMCC2461,保藏日期為2008年4月21日，分類命名為釀酒酵母(SaccharomycesCerevisiaeHansen)。白地黴菌(GeotrichumCandidumLink)是中國科學院微生物菌種中心保存的安全菌種，編號為AS.2.361，根黴菌(Rhizopus)是市場公開銷售菌種。所述的固體培養基包括有重量百分比為以乾料計50"80%的糟渣，15-30%的玉米芯粉，8-12%的麩皮，0.5-0.8%的玉米面，0.1-3%的尿素，0.2-4%的硫酸銨，再加入新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米澱粉廢水或洋芋澱粉廢水使其含水重量百分比為45-65%,用l^的石灰水調pH5.5-6.5。所述的微生物固體菌劑的製備方法，其特點在於包括有如下步驟A.瓊脂斜面培養基的製備及菌種的培養a.瓊脂斜面培養基的製備麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白腖0.2-0.6%、瓊脂粉1-3%、無菌水80-120ml，加熱溶解後，用1%的氫氧化鈉調pH值至5.5-6.5，經110-114'C，30-35分鐘蒸汽滅菌,然後在無菌條件下分裝於15X1.5cm的乾燥滅菌的試管擺成斜面待凝固後備用；b.菌種的培養分別取酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條件下，轉種於上述製備的瓊脂斜面培養基上，經28-32'C、24-48小時培養，即得瓊脂斜面菌種，為一級菌種；B液體培養基的製備及液體菌種的培養a.液體培養基的製備在1升f^豆腐廢水或粉絲廢水或玉米澱粉廢水或洋芋澱粉廢水中加入硫酸銨l-2g，磷酸0.5-lml，用l^的石灰水調pH5.5-6.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然後經110-112。C,30~35分鐘高壓滅菌，冷卻後備用；b.分別取酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌的一級菌種，在無菌條件下，接種於液體培養液中，經28-32'C、24-48小時培養，其培養液為二級菌種；c.分別取酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌的二級菌種再擴大培養，上搖床振蕩培養，經振幅100120r/min、溫度2832。C、1824小時培養，其菌液為三級菌種；d.分別將重量百分比為酵母融合菌為5565%、白地黴菌為3035%、根黴菌510%三級菌種再擴大培養，三種菌在同一個發酵罐，經28-32'C、18-24小時的通氣攪拌發酵培養，其菌液為酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌混合菌劑，或為四級菌種繼續逐級擴大培養，用此菌劑作為製備固體菌劑的菌種；C.固體菌劑的培養將含水比為60-80%新鮮的豆與渣或粉絲渣或玉米澱粉渣或洋芋澱粉或啤酒、白酒糟，加入經0.5-1.2%}^04處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為24:13:0.51，並加入相對於乾料的0.2_4%的硫酸銨，相對於乾料的0.1_3%的尿素，均勻攪拌，使其含水量達到45-65%，用1%的石灰水調節PH至5.56.5，然後加入相對於乾料總量為8-12%酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌混合菌液，充分攪拌混合均勻後，在發酵和乾燥兩用發酵池中經溫度2832'C通風攪拌發酵1824小時後，再經406(TC通熱風乾燥，製成酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌固體菌劑。所述的酵母融合菌的製備有如下步驟將酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母種的斜面轉種和培養，在液體振蕩培養14小時後，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1%的纖維素酶和1%蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2小時，溫度33°C，得到酒精酵母原生質體；將熱帶假絲酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母種的斜面轉種和培養，在液體振蕩培養14小時後，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1.5%的纖維素酶和0.5%的蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2.5小時，溫度33'C，得到熱帶假絲酵母原生質體；將熱帶假絲酵母原生質體經0.1%碘乙酸滅活，與酒精酵母原生質體以l:l混合，將沉澱懸於35%聚乙二醇的促溶劑中，3(TC水浴靜止處理，pH6.0，時間為40min，融合菌液經高滲磷酸緩衝液液反覆衝洗，塗布於高滲選擇型培養基和高滲完全培養基平板培養基上，經3(TC、7天培養，平板生長出酵母融合菌。酵母融合菌的培養基為麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白腖0.2-0.6%、瓊脂粉1-3%、無菌水80-120ml，加熱溶解後，用1X的氫氧化鈉調pH值至5.5-6.5，經110-114°C，30-35分鐘蒸汽滅菌，然後^無菌條件下分裝於15X1.5cm的乾燥滅菌的試管擺成斜面待凝固後備用。所述的微生物固體菌劑應用於畜禽飼料添加劑。所述的糟渣為啤酒酒糟或白酒糟或豆腐渣或粉絲渣或玉米澱粉渣或洋芋渣。我們採用先進的單親滅活原生質體融合技術，對熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)968和酒精酵彈(Saecharomycescervsiar)2.399兩親本菌株做融合，構建新的基因工程菌，這些融合菌即具有雙親的生物特性，又具有優於雙親的活性酶，絮凝性和耐高溫的生物特性。能充分利用豆腐、粉絲和玉米洋芋澱粉廢渣中有機物的營養物質進行生長繁殖，利用酵母融合菌(F306)配伍白地黴菌(G361)和根黴菌(R)三菌組合製備酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌液固體菌劑。G361白地黴菌是一種很粗營養價值類似產骯假絲酵母的微生物，又能利用硫酸銨和尿素合成蛋白質，純菌體蛋白質含量高達40%以上，根黴菌能分泌活性強的糖化酶，能將澱粉結構中的a-l,a-4和a-6鍵打斷，而完成將澱粉轉化為純度高的葡萄糖供酵母融合菌和白地黴菌利用，三菌的科學配比在同一條件下，同一發酵時間完成各自的發酵功能，起到菌種間的互補，有效的利用糟渣秸稈原料，提高糟渣秸稈的營養價值，所有培養料不滅菌，這一技術既節省了培養基的原料，減少原料配製和高壓滅菌的工序，節省了能源，也解決了這些行業治汙的難題，是一項變廢為寶，一舉多得的生物技術。酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌固體菌劑即可作為有機廢水處理淨化劑，又可在農、林、牧、漁業上應用，也可作為生物絮凝劑，表面活性劑，生物吸附劑等應用於石油開採、食品工業、環境工程、醫療和精細化工等行業，具有較廣的應用價值。本發明固體菌劑製備方法的特點在於其使用液態培養基，優點是一方面是液體培養基是利用食品、飲料行業生產的廢液，添加少量無機鹽，調整pH值，這些廢液營養豐富，適於菌種的快速生長繁殖。二是新鮮漿水或廢水可以不滅菌，添加無機鹽調整pH值後，可直接接入菌種進行液體發酵培養。這樣節省了設備和能源，三是液體培養菌種，菌細胞繁殖快，菌液細胞濃度高，加入固體原料的菌量大可抵抗雜菌汙染。圖l:本發明固體菌劑的製備流程圖。圖2:本發明和豆粕中主要胺基酸含量的對比曲線。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明見圖1見圖l，實施例l(1)試管液體菌種的培養，取新鮮豆腐廢水經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液100ml，加入(NH》2S040.lg,H3P040.05ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於15X1.5cm的乾燥試管中，經112。C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32。C，分別接種F306酵母融合菌、7G361白地黴菌、和R根黴菌於試管液體培養基中，經2832T:培養2448小時，即為試管液體菌種(一級菌種)(2)三角燒瓶液體菌種的培養取新鮮豆腐廢水經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液1000ml，加入(NH4)2S04lg，H3P(X0.5ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然後經112。C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32。C，將試管液體菌種接種在液體三角燒瓶培養基中，經2832。C培養2448小時，即為液體三角燒瓶菌種(二級菌種)(3)液體擴大培養生產菌種取新鮮豆腐廢水經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液10000ml，加入(NH4)2S0<10g，H3P045ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然後經112。C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32X:，將二級菌種接種在液體三角燒瓶培養基中，上搖床振蕩培養，振幅為100120r/min，經溫度2832'C培養1824小時發酵培養，其培養液為三級菌種。(4)取三級菌種再擴大培養，上發酵罐，所用新鮮豆腐廢水不滅菌，將重量百分比為55%的F306酵母融合菌、35%的G361白地黴菌、和10%的R根黴菌三菌培養液接入後，經2832'C培養1824小時，通氣攪拌發酵培養，其發酵液即為F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌液體菌劑，活細胞數為1.02.0X10'。個/ml;(5)根據需要可逐級擴大產量；(6)取含水分65X的新鮮豆腐渣2000kg，加入經0.5%^^04處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為2:1:0.5，並加入相對於乾物質硫酸銨為4%、尿素3%，充分混合後調固體發酵含水分45%，用1X的石灰水調節PH至5.56.5，然後加入相對於乾料總量為10X的FGR液體菌劑，充分攪拌混合均勻後，在發酵和低溫乾燥兩用發酵池中經溫度2832'C通風攪拌發酵1824小時後，再經406(TC通熱風乾燥，製成F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌固體菌劑。該F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌固體菌劑活細胞數為l.lXl(f個/克，粗蛋白28.6%。實施例2(l)試管液體菌種的培養，取新鮮粉絲廢水100ml,加入(NH》2S040.lg，H3PO40.05ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於15X1.2cm的乾燥試管中，經112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32'C，分別接種F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌於試管液體培養基中，經2832。C培養2448小時，即為試管液體菌種(一級菌種)(2)三角燒瓶液體菌種的培養取新鮮粉絲廢水lOOOml，加入(NH4)2S04lg，H3P040.5ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然後經112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C,將試管液體菌種接種在液體三角燒瓶培養基中，經2832。C培養2448小時，即為液體三角燒瓶菌種(二級菌種)。(3)液體擴大培養生產菌種取新鮮粉絲廢水10000ml,加入(NH4)2S0410g，H3P045ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然後經112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32'C，將二級菌種接種在液體三角燒瓶培養基中，上搖床振蕩培養，振幅為100120r/min，經溫度2832。C培養1824小時發酵培養，其培養液為三級菌種。(4)取三級菌種再擴大培養，上發酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分比為65%的F306酵母融合菌、30%的G361白地黴菌、和5%的R根黴菌三菌培養液接入後，經2832'C培養1824小時，通氣攪拌發酵培養，其成熟的發酵液即為F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌液體菌劑，活細胞數為0.81.8X10"'個/ml;(5)根據需要可逐級擴大產量；(6)取含水分70%的新鮮蠶豆粉絲渣2000kg，加入經0.75XH2S04處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮，玉米面的重量比為3:2:1，並加入相對於乾物質硫酸銨為3%、尿素2%，調固體發酵含水分50%，充分混合均勻後用1%的石灰水調節PH至6.0，然後加入相對於乾料總量為11X的FGR液體菌劑，充分攪拌混合均勻後，在發酵和低溫乾燥兩用發酵池中經溫度2832。C通風攪拌發酵1824小時後，再經406(TC通熱風乾燥，製成F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌固體菌劑，該F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌固體菌劑活細胞數為1.0Xl(T個/克，粗蛋白28.2%。實施例3(1)試管液體菌種的培養，取新鮮玉米澱粉廢水，經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液100ml，加入(NH4)2S040.1g，跳0.05ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於15X1.2cm的乾燥試管中，經112。C，'30分鐘高壓滅菌，冷卻至32。C，分別接種F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌於試管液體培養基中，經2832。C培養2448小時，即為試管液體菌種(一級菌種)(2)三角燒瓶液體菌種的培養取新鮮玉米澱粉廢水，經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液1000ml，加入(NH,)2S(Xlg，H3P040.5ml,充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然後經112t，30分鐘由壓滅菌，冷卻至32'C，將試管液體菌種接種在液體三角燒瓶培養基中，經2832。C培養2448小時，即為液體三角燒瓶菌種(二級菌種)(3)液體擴大培養生產菌種取新鮮玉米澱粉廢水，經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液10000ml，加入(Mi)2S0410g，H:,P(X5ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然後經112r，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32'C，將二級菌種接種在液體三角燒瓶培養基中，上搖床振蕩培養，振幅為100120r/min，經溫度2832。C培養1824小時發酵培養，其培養液為三級菌種。(4)取三級菌種再擴大培養，上幾酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分比為60X的F306酵母融合菌、32X的G361白地黴菌、和8%的R根黴菌三菌培養液接入後，經2832'C培養1824小時，通氣攪拌發酵培養，其成熟的發酵液即為F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌液體菌劑，活細胞數為1.22.2Xl(T個/ml;(5)根據需要可逐級擴大產量；(6)取含水分75X的新鮮玉米澱粉渣2000kg，加入經1%貼04處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為4:3:1，並加入相對於乾物質硫酸銨為4%、尿素2%，調固體發酵含水分55%，充分混合均勻後用1%的石灰水調節PH至6.5，然後加入相對於乾料總量為12X的FGR液體菌劑，充分攪拌混合均勻後，在發酵和低溫乾燥兩用發酵池中經溫度2832'C通風攪拌發酵1824小時後，再經406(TC通熱風乾燥，製成F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌固體菌劑，該F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌固體菌劑活細胞數為1.2Xl(T個/克，粗蛋白26.8%。實施例4(1)試管液體菌種的培養，取新鮮洋芋澱粉廢水，經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液100ml,加入(NH4)2S040.lg，H3P040.05ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於15X1.2cm的千燥試管中，經112°C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32°C，分別接種F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌於試管液體培養基中，經2832。C培養2448小時，即為試管液體菌種(一級菌種)。(2)三角燒瓶液體菌種的培養取新鮮洋芋澱粉廢水，經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液1000ml，力n入(NH^)2S(Xlg，H3P040.5ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然後經112C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32'C，將試管液體菌種接種在液體三角燒瓶培養基中，經2832。C培養2448小時，即為液體三角燒瓶菌種(二級菌種)(3)液體擴大培養生產菌種，取新鮮洋芋澱粉廢水，經煮沸10分鐘自然沉澱取上清液10000ml，加入(NH4)2S0410g，H3P045ml，充分溶解後調節PH至5.56.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子總量的1/4，然後經112。C，30分鐘高壓滅菌，冷卻至32。C，將二級菌種接種在液體三角燒瓶培養基中，上搖床振蕩培養，振幅為100120r/min，經溫度2832。C培養1824小時發酵培養，其培養液為三級菌種。(4)取三級菌種再擴大培養，上發酵罐，所用新鮮粉絲廢水不滅菌，將重量百分比為60%的F306酵母融合菌、35%的G361白地黴菌、和5%的R根黴菌三菌培養液接入後，經2832'C培養1824小時，通氣攪拌發酵培養，其成熟的發酵液即為F306酵母融合菌、G361白地黴菌、和R根黴菌液體菌劑，活細胞數為1.22.2X10'"個/ml;(5)根據需要可逐級擴大產量；'(6)取含水分60%的新鮮洋芋渣2000kg，加入經1.2XH2S04處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為4:3:1，並加入相對於乾物質硫酸銨為4%、尿素3%，調固體發酵含水分50%，充分混合均勻後用1%的石灰水調節PH至6.5，然後加入相對於乾料總量為12X的FGR液體菌劑，充分攪拌混合均勻後，在發酵和低溫乾燥兩用發酵池中經溫度2832'C通風攪拌發酵1824小時後，再經406(TC通熱風乾燥，製成FGR固體菌劑，該FGR固體菌劑活細胞數為1.3X10"'個/克，粗蛋白30.2%。實施例5一種酵母融合菌的製備有如下步驟將酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母種的斜面轉種和培養，在液體振蕩培養14小時後，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1%的纖維素酶和1%蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2小時，溫度33"C，得到酒精酵母原生質體；將熱帶假絲酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母種的斜面轉種和培養，在液體振蕩培養14小時後，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1.5%的纖維素酶和0.5%的蝸牛酶進行酶解脫壁,時間為2.5小時，溫度33'C，得到熱帶假絲酵母原生質體；將熱帶假絲酵母原生質體經O.1%碘乙酸滅活，與酒精酵母原生質體以l:l混合，將沉澱懸於35%聚乙二醇(PEG)的促溶劑中，3(TC水浴靜止處理，pH6.0，時間為40min，融合菌液經高滲磷酸緩衝液(PBS)液反覆衝洗，塗布於高滲選擇型培養基(醒S)和高滲完全培養基(YPDS)平板培養基上，經30。C、7天培養，平板生長出酵母融合菌。所述的酵母融合菌的培養基為麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白腖0.2-0.6%、瓊脂粉1-3%、無菌水80-120ml，加熱溶解後，用1%的氫氧化鈉調pH值至5.5-6.5，經110-114°C，30-35分鐘蒸汽滅菌，然後在無菌條件下分裝於15X1.5cm的乾燥滅菌的試管擺成斜面待凝固後備用。實施例6:本發明作為畜禽飼料添加劑將FGR固體菌劑以525M的比例加在豬、羊、奶牛詞料中進行飼喂。本發明的酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌固體菌劑的產品質量分析及在作為畜禽飼料添加劑的實施效果通過多次重複計數檢驗，按上述工藝生產的微生物菌劑，其細胞總數隨發酵參數的不同而存在差異，處於10Xl(f2X10"M2個/克之間，而活性細胞數量佔到細胞總數的80%以上。從2005年和2006年批量生產的微生物菌劑中各選擇一批，按採用要求採取樣品送甘肅草原生態研究所進行分析，結果見表1表1微生物菌劑中常規營養成分含量％tableseeoriginaldocumentpage12無氮浸出物(％)=100-(水分%+粗蛋白^%+粗纖維%+粗脂肪％)樣品l=2005年生產微生物菌劑之一批，以下同樣品2=2006年生產微生物菌劑之一批，以下同經多次檢驗，微生物菌劑乾物質中粗蛋白質含量介於26.8%30.2%之間，其差異主要來自原料配比與結構的不同。一般底物粗蛋白質含量越高，其產品的粗蛋白質越高。從表l可以看出，利用各種糟渣發酵生產的微生物菌劑，粗纖維含量較高。微生物菌劑主要礦物質含量分析結果見表2。表2微生物菌劑中主要礦物質元素含量tableseeoriginaldocumentpage12由表2可見，微生物菌劑中除鈣比較缺乏外，鉀、鐵、鋅、銅等元素含量較高。表318種胺基酸分析結果見表3。微生物菌劑中18種胺基酸含量tableseeoriginaldocumentpage13續表3%tableseeoriginaldocumentpage13主要有毒有害成分選擇2006年生產的微生物菌劑樣品，由甘肅省獸藥飼料監察所分析了有毒有害含量，結果見表4。表4微生物菌劑中主要有毒有害成分含量tableseeoriginaldocumentpage13以樣品2為基礎，將微生物菌劑胺基酸的比例和結構與其他飼料或畜產品進行比較，結果見表5。表5微生物菌劑的11種胺基酸與有關飼料及畜產品胺基酸含量對比tableseeoriginaldocumentpage13*2號微生物菌劑的胺基酸含量""~**牛肉、豬肉的胺基酸以100克蛋白質為基礎，其他數據以國家飼料資料庫為準#R:微生物菌劑的胺基酸和表中其他飼料或畜產品中胺基酸的相關係數樣品2中18種胺基酸的總和為21.78%，佔粗蛋白質的81.30%，說明產品粗蛋白的質量優良。從18種胺基酸中選擇與動物生產關係較為密切的11種，分別與啤酒酵母、豆粕、玉米蛋白粉、秘魯魚粉、肉粉、苜蓿草粉的胺基酸含量進行對比。藉助相關分析法，計算微生物菌劑的胺基酸含量與上述幾種詞料和牛肉、豬肉胺基酸含量的相關係數。從表5可見，菌體蛋白的胺基酸與上述5種飼料胺基酸的相關係數，從大到小的順序依次為豆粕>肉粉>苜蓿草粉>秘魯魚粉>啤酒酵母。說明微生物菌劑胺基酸比例和結構與豆粕最為相似，其次為肉粉。此外，與豬肉蛋白的胺基酸相關係數也高達0.9174，說明菌體蛋白胺基酸結構與豬肉蛋白胺基酸也非常相似；與秘魯魚粉的相關係數是0.8172，提示當以菌體蛋白代替詞料中的魚粉時，需要特別注意用其他原料將胺基酸調配平衡。微生物菌劑的胺基酸和豆粕的非常相似，粗蛋白含量約為豆粕的50%，說明兩倍數量的微生物菌劑中，胺基酸含量與豆粕基本相等，從圖2可以看出，兩者之間的變化趨勢也非常接近。由此可見，在胺基酸方面，微生物菌劑是豆粕的良好替代品。見圖2，在配制飼料時，以2份的微生物菌劑代替1份的豆粕時，除賴氨酸與異亮氨酸略顯不足外，其他主要胺基酸基本與豆粕基本相同。微生物菌劑保存試驗與飼餵效果取同期生產的奶牛精料補充料、微生物菌劑、微生物菌劑奶牛精料補充料(含微生物菌劑5%)三種飼料，分別存放於白色磨口瓶中置於陰涼避光處，定期觀察。結果表明，不含微生物菌劑的奶牛精料補充料在5個月時出現了黴變與結塊和異味；微生物菌劑奶牛精料補充料保存9個月時出現黴變徵兆和輕微的異味；微生物菌劑存放18個月時，仍具有酸香味，且無黴變徵兆。①利用微生物菌劑配製精料補充料進行奶牛養殖試驗，結果見表6。表6微生物菌劑飼養奶牛效果試驗數據'tableseeoriginaldocumentpage14*精料補充料中含微生物菌劑5%②將微生物固體菌劑精料中詞餵奶牛，測定鮮奶成分變化，結果見表7。表7精料補充料中添加發酵液前後牛奶主要成分變化'分組及奶牛乳脂率非脂固型物乳蛋白乳糖冰點密度對比頭數(%)(%)(%)(%)rc)(g/ml)對照期153.628.363.044.57-0.551.028試驗期153.758.413.054.53-0.551.028試驗-對照+0.13+0.05+0.01-0.040.000.000*按精料的5%噴灑微生物發酵液，試驗在甘肅農業科學院奶牛場進行③微生物固體菌劑濃縮飼料對歐拉成年羊的育肥效果見表8。表8肥育羊出欄活重和屠宰情況'精飼料中組別及年齡出欄活重(Kg/只)日增重(g/只)胴體重(Kg/個)屠宰率(%)淨收入(元/只)微生物菌劑第一組(4-5歲)7874,5439,150.1289,50佔4%第二組(2-3歲)66.892.7230.545.6660.50微生物菌劑第二組(4-5歲)75.441,8136.248.0147.00佔0%第四組(2-3歲)64.263.6329.245.4842.00*試驗在瑪曲縣薩合牧民新村產業基地完成，試驗羊20隻，每組5隻。使用本發明做f肥豬飼餵實驗，在蘭州rjf七裡河區綜合畜牧場和榆中萬泉養殖場，分別作了倉'肥豬飼餵效果試驗。選擇同品種，同日齡即60日齡20頭育肥豬，實驗組與對照組各10頭。90R齡育肥豬84頭，實驗組與對照組各42頭，每組為二群。試前20-30大驅蟲、防疫。空腹稱重。，在原日量中，分別減少0.5或1公斤混合料，加入0.5或1公斤微生物菌劑，其飼料配比如下表9:表9飼料配比項目混合微生物消化能粗蛋白粗纖維鈣磷料(公齒劑公千卡)(克)(克)(克)(克)實驗單位^^\斤)斤)七裡河綜合舒牧場試驗組20.57.71394.919.189.888.6七裡河綜合畜牧場對照組2,5/7.94373.511.779.558.4萬泉養殖場試驗組219.08490.95.9012.189.8萬泉養殖場對照紹3z9.53448.85.8511.669.615表10育肥豬增重變化項目場組頭數頭平均初重頭平均末歪全期頭平均增重頭曰增重結果分析七裡河綜合畜-牧場l式驗組102745.6818.680.46P〉0.05七単河綜合畜-牧場對照組1027.1949.4922.300.55P〉0.05萬議養殖場試驗組4237.3960.1822.790.569P〉0.05萬&養殖場對照組4240.8864.0523.170.579P〉0.05詞餵結果實驗組與對照組比較，ll增重T測量P〉0.05。差異均不顯著。微生物菌劑的成本主要由原料成本和生產費用兩部分構成。其原料成本決定於原料種類和配比，由於主要原料屬於秸稈和各種下腳料，因此成本較低，平均930元/噸。如果不採用此技術，一般以日產12噸、年產3000噸為例，估算生產成本為年生產銷售3000噸，需流動資金25萬元，固定資產投資約60萬元。生產定員ll人(人均月工資1500元)，管理人員4人(人均月工資1800元)，福利按工資的4%提取。估算成本為1145元/噸。動物詞餵試驗證明，微生物菌劑可以提高奶牛日產奶量1.552.75kg、乳脂率0.010.03個百分點、提高乳中非脂固形物0.05個百分點，總脂肪和總蛋白的日產量相應得到提高，乳糖降低0.04個百分點；微生物菌劑用於肉羊肥育，日增重提高29.1g/d33.7g/d。將FGR固體菌劑以1525X的比例加在豬飼料中進行飼喂，比對照豬增重96克/日.頭。權利要求1.一種微生物固體菌劑，其特徵在於由酵母融合菌、白地黴菌(GeotrichumCandidumLink)、根黴菌(Rhizopus)和固體培養基組成，其三種菌株的重量百分比為酵母融合菌為55～65％、白地黴菌為30～35％、根黴菌5～10％，所述的酵母融合菌的保藏號為CGMCC2461。2.如權利要求1所述的微生物固體菌劑，其特徵在於所述的固體培養基包括有重量百分比為以乾料計50-80%的糟渣，15-30%的玉米芯粉，8-12%的麩皮，0.5-0.8%的玉米面，0.1-3%的尿素，0.2-4%的硫酸銨，再加入新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米澱粉廢水或洋芋澱粉廢水使其含水重量百分比為45-65%，用1%的石灰水調pH5.5-6.5。3.如權利要求1所述的微生物固體菌劑的製備方法，其特徵在於包括有如下歩驟A.瓊脂斜面培養基的製備及菌種的培養a.瓊脂斜面培養基的製備麥芽汁0.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白腖0.2-0.6%、瓊脂粉1_3%、無菌水80-120ml,加熱溶解後，用1%的氫氧化鈉調pH值至5.5-6.5,經110-114°C，30-35分鐘蒸汽滅菌，然後在無菌條件下分裝於15X1.5cm的乾燥滅菌的試管擺成斜面待凝固後備用；b.菌種的培養分別取酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條件下，轉種於上述製備的瓊脂斜面培養基上，經28-32'C、24-48小時培養，即得瓊脂斜面菌種，為一級菌種；B液體培養基的製備及液體菌種的培養a.液體培養基的製備在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米澱粉廢水或洋芋澱粉廢水中加入硫酸銨1-2g，磷酸0.5-lml，用lX的石灰水調pH5.5-6.5，分裝於500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然後經110-112。C，30-35分鐘高壓滅菌，冷卻後備用；b.分別取酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌的一級菌種，在無菌條件下，接種於液體培養液中，經28-32'C、24-48小時培養，其培養液為二級菌種；c.分別取酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌的二級菌種再擴大培養，上搖床振蕩培養，經振幅100120r/min、溫度2832。C、1824小時培養，其菌液為三級菌種；d.分別將重量百分比為酵母融合菌為5565%、白地黴菌為3035%、根黴菌510%三級菌種再擴大培養，三種菌在同一個發酵罐，經28-32°C、18-24小時的通氣攪拌發酵培養，其菌液為酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌混合菌劑，或為四級菌種繼續逐級擴大培養，用此菌劑作為製備固體菌劑的菌種；C.固體菌劑的培養-將含水比為60-80%新鮮的豆腐渣或粉絲渣或玉米澱粉渣或洋芋澱粉，加入經0.5-1.2XH2S04處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為24:13:0.51，並加入相對於乾料的0.2_4%的硫酸銨，相對於乾料的0.1-3%的尿素，均勻攪拌，使其含水量達到45-65%，用1X的石灰水調節PH至5.56.5，然後加入相對於乾料總量為8-12%酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌混合菌液，充分攪拌混合均勻後，在發酵和乾燥兩用發酵池中經溫度2832'C通風攪拌發酵1824小時後，再經4060。C通熱風乾燥，製成酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌固體菌劑。4.如權利要求3所述的酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌液體菌劑的製備方法，其特徵在於所述的酵母融合菌的製備有如下步驟將酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母種的斜面轉種和培養，在液體振蕩培養14小時後，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1%的纖維素酶和1%蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2小時，溫度33'C，得到酒精酵母原生質體；將熱帶假絲酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母種的斜面轉種和培養，在液體振蕩培養14小時後，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1.5%的纖維素酶和0.5%的蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2.5小時，溫度33°C，得到熱帶假絲酵母原生質體；將熱帶假絲酵母原生質體經0.1%碘乙酸滅活，與酒精酵母原生質體以1:1混合，將沉澱懸於35%舉乙二醇的促溶劑中，3(TC水浴靜止處理，pH6.0，時間為40min,融合菌液經高滲磷酸緩衝液液反覆衝洗，塗布於高滲選擇型培養基和高滲完全培養基平板培養基上，經30'C、7天培養，平板生長出酵母融合菌。5.如權利要求4所述的酵母融合菌、白地黴菌和根黴菌液體菌劑的製備方法，其特徵在於所述的酵母融合菌的培養基為:麥芽汁O.5-2%、葡萄糖0.5-2%、蛋白腖0.2-0.6%、瓊脂粉1-3%、無菌水80-120ml,加熱溶解後，用1%的氫氧化鈉調pH值至5.5-6.5，經110-114°C，30-35分鐘蒸汽滅菌，然後在無菌條件下分裝於15X1.5cm的乾燥滅菌的試管擺成斜面待凝固後備用。6.如權利要求1所述的微生物固體菌劑，其特徵在於所述的微生物固體菌劑應用於畜禽飼料添加劑。全文摘要本發明主要涉及微生物的發酵方法，尤其涉及利用食品行業產生的廢液廢渣製備酵母融合菌(F306)、白地黴菌(G361)和根黴菌(R)三菌組合的FGR固體菌劑的方法和應用。一種微生物固體菌劑，其固體培養基包括有重量百分比為以乾料計50-80％的糟渣，玉米芯粉15-30％，麩皮8-12％，玉米面0.5-0.8％，尿素0.1-3％，硫酸銨0.2-4％，再加入新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米澱粉廢水或洋芋澱粉廢水使其含水重量百分比為45-65％，用1％的石灰水調pH5.5-6.5，然後加入相對於乾料總量為8-12％酵母融合菌、白地黴菌、根黴菌混合菌液，充分攪拌，在發酵和乾燥兩用發酵池中經溫度28～32℃通風攪拌發酵18～24小時後，再經40～60℃通熱風乾燥，製成固體菌劑。其在畜禽飼料添加劑上有很好的應用效果。文檔編號C12R1/645GK101407762SQ20081001814公開日2009年4月15日申請日期2008年5月7日優先權日2008年5月7日發明者孫榮高申請人:孫榮高