一種快速鑑定辣椒抗疫病相關基因功能的方法
2024-04-05 03:12:05 1
專利名稱：一種快速鑑定辣椒抗疫病相關基因功能的方法
技術領域：
本發明屬於植物育種領域，具體涉及一種利用病毒誘導的基因沉默技術鑑定辣椒抗疫病相關基因功能的方法，該方法具有操作簡單、無需進行植物遺傳轉化、周期短，且可以在不同遺傳背景下進行鑑定等優點，是一種快速、有效鑑定植物基因功能的方法。
背景技術：
辣椒(Capsicumannuum L.)屬於爺科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum),—年生草本植物，原產於中南美洲熱帶亞熱帶地區，現在世界各地普遍栽培，也是我國種植面積最大的蔬菜作物之一。辣椒疫病是由疫黴菌(Phytophthora capsici L.)引起的一種毀滅性土傳病害，世界上許多國家均有發生。辣椒疫病是我國辣椒產業的重要病害，且有逐年加重的趨勢，從而造成嚴重的經濟損失。目前生產上主要以化學防治的方法來控制辣椒疫病的發生，不僅防治效果差，而且汙染產品和環境，造成辣椒產品殘毒超標，嚴重製約著我國辣椒產業在國際市場上的競爭力。選育抗病品種是控制辣椒疫病最為經濟和有效的方法。隨著分子生物學技術的快速發展，很多與辣椒疫病抗性相關的基因被克隆出來(Park, C. -J. , Shin, R. , Park, J. Μ. , Lee, G. -J. , Yoo, T. H. and Paek, K. -H. A hot peppercDNA encoding a pathogenesis-related protein 4is induced during the resistanceresponse to Tobacco mosaic virus [J] · Mol. Cells, (2001a) 11，122-127),並利用傳統的遺傳轉化方法對其功能進行分析。然而，這種常規遺傳轉化技術存在著許多的局限性，其主要表現在於操作程序複雜、周期長、轉化條件要求苛刻、轉化效率低且受辣椒品種影響，甚至對某些生物體具有致死效應，嚴重地制約著分子育種的進程。因此，需要尋找一種快速高效的基因功能鑑定方法。病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是從研究病毒和寄主之間的相互作用發展而來。在這個系統中，帶有目的基因片段的病毒載體被傳遞到植物細胞，植物細胞識別入侵病毒的威脅並且利用保護性防衛機制來摧毀病毒和病毒載體上所攜帶的任何外源基因，從而影響植物本身目的基因的轉錄過程，導致目的基因mRNA發生特異性降解。即指攜帶與植物內源功能基因同源序列的病毒在侵染植物之後，能夠使植物發生基因沉默從而出現表型突變，可以通過植物表型或生理指標上的變化來反映該基因的功倉泛。病毒誘導的基因沉默是近年來發展起來的一種快速鑑定植物基因功能的方法，它能最大限度地克服傳統方法的局限性，具有操作簡單、周期短、沉默效率高，且可以在不同遺傳背景下生效等優點。因此，適用於大規模的基因功能篩選。以下是發明人給出的相關參考文獻I、劉珂珂，辣椒對疫病的抗性及其機理研究[D].西北農林科技大學博士學位論文(導師鞏振輝)，2009。2、羅德旭，鞏振輝，李大偉.辣椒疫病抗病性分子鑑定技術研究[J].西北農業學報，2008，17 (5) 76-80o3、 Rugang Chen, Hanxia Li， Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao andZhibiao Ye. CaMi, a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsiumannuum L.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26(7) :895-905。4、Park, C. -J.，Shin, R.，Park, J. M.，Lee，G. -J.，Yooj T. H. and Paekj K. _H. A hotpepper cDNA encoding a pathogenesis-related protein 4is induced during theresistance response to Tobacco mosaic virus[J]· Mol. Cells，2001，11 :122127。5、AndreC. Velasquez, Suma Chakravarthyj Gregory B. Martin. Virus-inducedGene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato[J]. Journal ofVisualized Experiments, 2009, (28) :el292，DOI:10. 3791/1292。
發明內容
針對上述現有技術中關於辣椒基因功能鑑定中存在的問題，本發明的目的在於，提出一種快速鑑定辣椒抗疫病相關基因功能的方法。該方法具有操作簡單、無需遺傳轉化、周期短且可以適宜不同品種遺傳背景等優點，是一種快速、有效鑑定辣椒基因功能的方法。為了實現上述任務，本發明釆用如下的技術解決方案一種快速鑑定辣椒抗疫病相關基因的方法，其特徵在於，該方法利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體葉片抗病性相結合的方法，進行辣椒疫病抗性相關基因的功能分析，具體步驟如下I)辣椒材料的準備供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334，選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中。然後轉到25V /18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進行培養，期間澆Hoagland』 s營養液；待苗子兩片真葉展平時，可用於病毒誘導的基因沉默注射；2)辣椒疫黴菌孢子懸浮液的準備選擇辣椒疫黴菌生理小種phi作為接種病原菌，供試辣椒材料CM334對辣椒疫黴菌生理小種Phl表現為抗性的方法(劉珂珂，辣椒對疫病的抗性及其機理研究[D].西北農林科技大學博士學位論文，2009)。病原菌的準備具體參考(羅德旭，鞏振輝，李大偉.辣椒疫病抗病性分子鑑定技術研究[J].西北農業學報，2008，17 (5) :76-80)的方法。3)重組病毒載體的構建(I)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成採用Trizol 法提取辣椒葉片總 RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang,Junhong Zhang，Jinghua Xiao and Zhibiao Ye. CaMi,a root-knot nematode resistancegene from hot pepper (Capsium annuum L.) confers nematode resistance intomato [J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895_905)，按 Promega 公司的反轉錄試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈合成。(2)目的基因片段的克隆用於病毒沉默載體構建的基因片段大小一般要求在150_500bp之間，本申請中所涉及的基因引物設計均遵循本原則。根據NCBI公布的或已克隆的辣椒疫病抗性相關基因序列，設計合適的引物序列，以步驟(I)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產物連接到克隆載體PMD19-T上，16°C過夜。轉化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測初步確定連接成功後，送上海生物工程公司進行測序。確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即可用於構建基因沉默表達載體。(3)重組載體構建選擇病毒載體為菸草脆裂病毒的載體pTRVl和pTRV2。選擇合適的酶切位點對病毒載體pTRV2和步驟(2)經過測序驗證含有目的基因序列的克隆載體進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a，用菌落PCR和雙酶切方法檢測出目的基因片 段，證明目的基因已經成功轉入病毒載體中。(4)轉化農桿菌利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構建好的病毒載體分別導入農桿菌菌株GV3101中，經PCR檢測確定為目的基因，保存菌液以備用。4)農桿菌菌液注射( I)農桿菌菌液準備將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3)構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化，具體參考(Andr6C. Velasquez, Suma Chakravarthy, GregoryB. Martin.Virus-induced Gene Si lencing(VIGS) in Nicotiana benthamiana andTomato[J]. Journal of Visualized Experiments, 2009, (28) el292, DOI:10. 3791/1292)的方法。(2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個小孔，然後用去掉針頭的I. OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個葉面出現水潰狀，證明菌液已被注射進植株體內。將注射接種後的辣椒植株放入人工氣候箱，18°C、暗培養2d後，轉入22°C /18°C、16h/8h、60%溼度條件下進行培養，觀察並記錄辣椒的表型變化，期間以Hoagland’s營養液進行澆灌。5)基因沉默效果檢測(I)沉默表型觀察辣椒葉片農桿菌注射接種約25d左右就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功進入植株體內。(2)辣椒尚體葉片接種鑑定待檢測基因功能選帶有病毒症狀的辣椒離體葉片接種辣椒疫黴菌phi。離體葉片接種濃度為I. OX IO4個，每個葉片10 μ L0接種辣椒疫黴菌孢子懸浮液後，於28°C，相對溼度95%，50001x人工氣候箱進行培養，5d後觀察表型症狀的變化。觀察方法是，在葉片接種部位出現明顯病斑的，說明被檢測基因與辣椒抗疫病相關；相反，在葉片接種部位沒有出現明顯病斑的，則說明被檢測基因與辣椒抗疫病無關，或是無功能基因。本發明創製的鑑定辣椒基因功能的方法操作簡單、周期短、無需基因全長序列、無需轉基因植株、表型獲取快等諸多優點，可用於快速、高效、高通量地分析基因功能研究。
圖I為辣椒CaPOD基因沉默的表型觀察圖片。其中，左圖為pTRV_00 (空載體，不含目的基因)，右圖為pTRV-CaP0D (重組載體，攜帶目的基 因)。圖2為辣椒CaPOD基因沉默離體葉片接種辣椒疫黴菌的表型觀察圖片。其中，圖左邊為pTRV-00 (空載體，不含目的基因)，圖右邊為PTRV-CaP0D (重組載體，攜帶目的基因)。圖3為辣椒CaRGAl基因沉默的表型觀察圖片。其中，左圖為pTRV_00 ；(空載體，不含目的基因)，右圖為=PTRV-CaRGAl (重組載體，攜帶目的基因)。圖4為辣椒CaRGAl基因沉默離體葉片接種辣椒疫黴菌的表型觀察圖片。其中，圖左邊為pTRV-00 ；(空載體，不含目的基因)，圖右邊為pTRV-CaRGAl (重組載體，攜帶目的基因)。以下結合附圖和發明人給出的應用實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式按照本發明的技術方案，發明人給出以下具體的應用實施例，需要說明的是，以下實施例僅是說明性的，本發明的應用並不限於這些實施例。應用實施例I :本實施例利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體葉片抗病性相結合的方法，進行辣椒疫病抗性相關基因的功能分析，具體如下I、辣椒材料的準備供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽。經4d種子露白，播於穴盤中。然後轉到25°C /18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進行培養，期間澆Hoagland’s營養液。待苗子兩片真葉展平時，可用於病毒誘導的基因沉默注射。2.辣椒疫黴菌孢子懸浮液的準備選擇辣椒疫黴菌生理小種Phl作為接種病原菌，供試辣椒材料CM334對其表現為抗性(劉珂珂，辣椒對疫病的抗性及其機理研究[D].西北農林科技大學博士學位論文，2009)。病原菌的準備具體參考(羅德旭，鞏振輝，李大偉，辣椒疫病抗病性分子鑑定技術研究[J].西北農業學報，2008，17 (5) 76-80)的方法。3、重組病毒載體的構建(I)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成採用Trizol法提取辣椒葉片總RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMij a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsium annuumL) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895-905)，按Promega公司的反轉錄試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈合成。(2)目的基因片段的克隆用於病毒沉默載體構建的基因片段大小一般要求在150-500bp之間，本申請中所涉及的基因引物設計均遵循本原則。根據申請人課題組克隆的辣椒過氧化物酶(CaPOD)基因序列(NCBI GenBank登錄號FJ596178)(劉珂珂，辣椒對疫病的抗性及其機理研究[D]. 2009)，設計合成一對帶有Xba I和Bam HI雙酶切位點的引物序列(正向引物5』 -GGGTCTAGAGTGCTCAACACACACTTTATTCTTCTC-3> ;反向引物5』 -GGG GGATCCCCAAGAATGACAACAGAGTCCCTA-3J )，片段大小為480bp。以步驟(I)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產物連接到克隆載體pMD19_T上，16°C過夜。轉化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測初步確定連接成功後，送上海生物工程公司進行測序。經分析得出擴增的基因片段序列與設計目的基因序列一致，即可用於基因沉默載體的構建。(3)重組載體構建用於本實施例的病毒載體為菸草脆裂病毒的載體pTRVl和PTRV2。選用Xba I和Bam HI內切酶對病毒載體pTRV2和經步驟(2)驗證過的克隆載體T-CaPOD進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a，用菌落PCR和雙酶切方法檢測出480bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體pTRV-CaPOD已經構建成功，可用於下一步農桿菌侵染。 (4)轉化農桿菌利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構建好的病毒載體pTRV-CaPOD分別導入農桿菌菌株GV3101中，PCR檢測確定擴增出480bp的目的條帶，保存菌液以備用。4、農桿菌菌液注射(I)農桿菌菌液準備將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體pTRV-CaPOD的農桿菌菌液按已知的方法進行活化，具體參考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato [J]. Journal of Visualized Experiments,2009, (28) e1292，DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個小孔，然後用去掉針頭的I. OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個葉面出現水潰狀，證明菌液已被注射進植株體內。將注射接種後的辣椒植株放入人工氣候箱，18 °C、暗培養2d後，轉入22 °C /18 °C、16h/8h、60%溼度條件下進行培養，觀察並記錄辣椒的表型變化，期間以Hoagland’s營養液進行燒灌。5.基因沉默效果檢測(I)沉默表型觀察農桿菌注射接種大約25d後，辣椒葉片出現明顯的病毒症狀表現(見圖I):部分葉脈褪綠，周圍出現黃綠色病毒斑點，有些葉片邊緣甚至捲曲，說明重組病毒載體pTRV-CaPOD已經成功進入植株體中。(2)辣椒尚體葉片接種鑑定待檢測基因功能選帶有病毒症狀的pTRV-CaPOD辣椒離體葉片進行辣椒疫黴菌phi接種。離體葉片接種濃度為I. OX IO4個每個葉片10 μ L。接種辣椒疫黴菌孢子懸浮液後，於28°C，相對溼度95%，50001x人工氣候箱進行培養，5d後觀察到的表型症狀變化情況(見圖2)pTRV-CaPOD病毒沉默植株離體葉片出現明顯的壞死反應，而對照pTRV_00植株的離體葉片沒有壞死斑，這一結果說明CaPOD與辣椒的抗疫病相關。應用實施例2:本實施例利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體葉片抗病性相結合的方法，進行辣椒疫病抗性相關基因的功能分析，具體如下I、辣椒材料的準備供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽。經4d種子露白，播於穴盤中。然後轉到25°C /18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進行培養，期間澆Hoagland’s營養液。待苗子兩片真葉展平時，可用於病毒誘導的基因沉默注射。2、辣椒疫黴菌孢子懸浮液的準備選擇辣椒疫黴菌生理小種phi作為接種病原菌，供試辣椒材料CM334對其表現為抗性(劉珂珂，辣椒對疫病的抗性及其機理研究[D].西北農林科技大學博士學位論文，2009)。病原菌的準備具體參考(羅德旭，鞏振輝，李大偉.辣椒疫病抗病性分子鑑定技術研究[J].西北農業學報，2008，17 (5):76-80)的方法。
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3、重組病毒載體的構建(I)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成採用Trizol法提取辣椒葉片總RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMi, a root-knot nematode resistance gene from hot pepper(Capsium annuumL.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports, 2007，26 (7):895-905),按Promega公司的反轉錄試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈合成。(2)目的基因片段的克隆用於病毒沉默載體構建的基因片段大小一般要求在150-500bp之間，本發明中所涉及的基因引物設計均遵循本原則。根據申請人課題組克隆的辣椒CaRGAl基因序列(NCBI GenBank登錄號GQ386945. I),設計合成一對帶有Eco RI和Bam HI雙酶切位點的引物序列(正向引物5，-GGGGAATTCAAGTCCTCAAACCACACCCCT-3'反向引物5』 -GGGGGATCCCAACATACTCCACCTCCGCAG-3』)，片段大小為 210bp。以步驟(I)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產物連接到克隆載體pMD19-T上，16°C過夜。轉化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測初步確定連接成功後，送上海生物工程公司進行測序。經分析得出擴增的基因片段序列與設計目的基因序列一致，即可用於構建基因沉默載體。(3)重組載體構建用於本實施例的病毒載體為菸草脆裂病毒的載體pTRVl和PTRV2。選用Eco RI和Bam HI內切酶對病毒載體pTRV2和經步驟(2)驗證過的克隆載體T-CaRGAl進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a，用菌落PCR和雙酶切方法檢測出2IObp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體pTRV-CaRGAl構建成功，可用於下一步的農桿菌侵染。(4)轉化農桿菌利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構建好的病毒載體的PTRV-CaRGAl分別導入農桿菌菌株GV3101中，PCR檢測確定擴增出210bp的目的條帶，保存菌液以備用。4、農桿菌菌液注射
(I)農桿菌菌液準備將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體pTRV-CaRGAl的農桿菌菌液按已知的方法進行活化,具體參考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato[J].Journal of Visualized Experiments,2009, (28) e1292，DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個小孔，然後用去掉針頭的I. OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個葉面出現水潰狀，證明菌液已被注射進植株體內。將注射接種後的辣椒植株放入人工氣候箱，18 °C、暗培養2d後，轉 入22 °C /18 °C、16h/8h、60%溼度條件下進行培養，觀察並記錄辣椒的表型變化，期間以Hoagland’s營養液進行燒灌。5.基因沉默效果檢測(I)沉默表型觀察農桿菌注射接種大約25d後，辣椒葉片出現不同程度的病毒症狀(見圖3):即葉片表面有花綠色病毒斑點出現，證明重組病毒載體pTRV-CaRGAl已成功導入辣椒體內。(2)辣椒尚體葉片接種鑑定待檢測基因功能選帶有病毒症狀的pTRV-CaRGAl辣椒離體葉片，接種辣椒疫黴菌phi。離體葉片接種濃度為I. OX IO4個· mr1，每個葉片10 μ L。接種辣椒疫黴菌孢子懸浮液後，於28°C，相對溼度95%，50001x人工氣候箱進行培養，5d後觀察到的表型症狀變化情況(見圖4)pTRV-CaRGAl病毒沉默植株離體葉片出現輕度的壞死斑，而對照pTRV_00植株幾乎沒變化，證明CaRGAl參與辣椒對疫病的抗性反應。應用實施例3:本實施例利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體葉片抗病性相結合的方法，進行辣椒疫病抗性相關基因的功能分析，具體如下I、辣椒材料的準備供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽。經4d種子露白，播於穴盤中。然後轉到25°C /18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進行培養，期間澆Hoagland’s營養液。待苗子兩片真葉展平時，可用於病毒誘導的基因沉默注射。2、辣椒疫黴菌孢子懸浮液的準備選擇辣椒疫黴菌生理小種phi作為接種病原菌，供試辣椒材料CM334對其表現為抗性(劉珂珂，辣椒對疫病的抗性及其機理研究[D].西北農林科技大學博士學位論文，2009)。病原菌的準備具體參考(羅德旭，鞏振輝，李大偉.辣椒疫病抗病性分子鑑定技術研究[J].西北農業學報，2008，17 (5):76-80)的方法。3、重組病毒載體的構建(I)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成採用Trizol法提取辣椒葉片總RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMij a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsium annuumL.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895-905)，按Promega公司的反轉錄試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈合成。(2)目的基因片段的克隆用於病毒沉默載體構建的基因片段大小一般要求在150-500bp之間，本發明中所涉及的基因引物設計均遵循本原則。根據NCBI公布的辣椒線粒體Caatp6基因序列(GenBank登錄號DQ: 126681),設計合成一對帶有Eco RI和Bam HI雙酶切位點的引物序列(正向引物5』 -CCGGAATTCGCTTCGCCTTCGTATAGTAGTTC-3，;反向引物5』 -CGCGGATCCAGTCATAGTGCTCACCCTGTTTG-3> )，片段大小為 300bp。以步驟(I)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產物連接到克隆載體pMD19-T上，16°C過夜。轉化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測初步確定連接成功後，送上海生物工程公司進行測序。經分析得出擴增的基因片段序列與設計目的基因序列一致，即可用於構建基因沉默載體。(3)重組載體構建用於本發明的病毒載體為菸草脆裂病毒的載體pTRVl和PTRV2。選用Eco RI和Bam HI內切酶對病毒載體pTRV2和經步驟(2)驗證過的克隆載體T-Ca-atp6-2進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a，用菌落PCR 和雙酶切方法檢測出300bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體pTRV-Ca-atp6-2構建成功，可用於下一步的農桿菌侵染。(4)轉化農桿菌利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構建好的病毒載體pTRV-Ca-atp6-2分別導入農桿菌菌株GV3101中，PCR檢測確定擴增出300bp的目的條帶，保存菌液以備用。4、農桿菌菌液注射(I)農桿菌菌液準備將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體pTRV-Ca-atp6-2的農桿菌菌液按已知的方法進行活化,具體參考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato[J]. Journal of Visualized Experiments,2009, (28)el292, DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個小孔，然後用去掉針頭的I. OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個葉面出現水潰狀，證明菌液已被注射進植株體內。將注射接種後的辣椒植株放入人工氣候箱，18 °C、暗培養2d後，轉入2 2 °C /18 °C、16 h / 8 h、6 O %溼度條件下進行培養，觀察並記錄辣椒的表型變化，期間以Hoagland’s營養液進行燒灌。5.基因沉默效果檢測(I)沉默表型觀察農桿菌注射接種大約25d後，辣椒葉片出現輕度病毒病斑症狀，葉片有捲曲現象，證明重組病毒載體pTRV-Ca-atp6-2已成功導入辣椒植株體內。(2)辣椒離體葉片接種鑑定待檢測基因功能選帶有病毒症狀的pTRV-Ca-atp6_2辣椒離體葉片，接種辣椒疫黴菌phi。離體葉片接種濃度為I. OX IO4個每個葉片10 μ L0接種辣椒疫黴菌孢子懸浮液後，於28°C，相對溼度95%，50001x人工氣候箱進行培養，5d後觀察到的表型症狀變化情況，發現pTRV-Ca-atp6-2病毒沉默植株離體葉片與對照pTRV-ΟΟ植株離體葉片無明顯差異，說明Ca-atp6-2基因與辣椒疫病抗性無關。
權利要求
1. 一種快速鑑定辣椒抗疫病相關基因的方法，其特徵在於，該方法利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體葉片抗病性相結合的方法，進行辣椒疫病抗性相關基因的功能分析，具體步驟如下 1)辣椒材料的準備 供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min,清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中，然後轉到25°C/18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進行培養，培養期間澆Hoagland’s營養液，待苗子兩片真葉展平時，用於病毒誘導的基因沉默注射； 2)辣椒疫黴菌孢子懸浮液的準備 選擇辣椒疫黴菌生理小種Phl作為接種病原菌，供試辣椒材料CM334對辣椒疫黴菌生理小種phi表現為抗性的方法。
3)重組病毒載體的構建 (1)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成 採用Trizol法提取辣椒葉片總RNA,按Promega公司的反轉錄試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈合成； (2)目的基因片段的克隆 用於基因沉默表達載體構建的基因片段大小要求在150-500bp之間；根據NCBI公布的或已克隆的辣椒疫病抗性相關基因序列，設計合適的引物序列；以步驟(I)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒回收目的基因；利用T4DNA連接酶將回收產物連接到克隆載體pMD19-T上，16°C過夜，然後轉化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測初步確定連接成功後，進行測序，確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即可用於構建基因沉默表達載體； (3)重組載體構建 選擇病毒載體為菸草脆裂病毒的載體pTRVl和pTRV2 ;選擇合適的酶切位點對病毒載體pTRV2和步驟(2)經過測序驗證含有目的基因序列的克隆載體進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒回收，利用T4DNA連接酶將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜，轉化DH5a，用菌落PCR和雙酶切方法檢測出目的基因片段，證明目的基因已經成功轉入病毒載體中； (4)轉化農桿菌 利用凍融法將攜帶PTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構建好的病毒載體分別導入農桿菌菌株GV3101中，經PCR檢測確定為目的基因，保存菌液以備用。
4)農桿菌菌液注射 (1)農桿菌菌液準備 將攜帶PTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3)構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化； (2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個小孔，然後用去掉針頭的I.OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個葉面出現水潰狀，證明菌液已被注射進植株體內；將注射接種後的辣椒植株放入人工氣候箱，18 °C、暗培養2d後，轉入22 °C /18 °C,16h/8h、60%溼度條件下進行培養，觀察並記錄辣椒的表型變化，培養期間以Hoagland’s營養液進行澆灌； 5)基因沉默效果檢測 (1)沉默表型觀察 辣椒葉片農桿菌注射接種25d就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功導入植株體內； (2)辣椒尚體葉片接種鑑定待檢測基因功能 選帶有病毒症狀的辣椒離體葉片接種辣椒疫黴菌phi。離體 葉片接種濃度為1.0X104個-mr1,每個葉片10 μ L ;接種辣椒疫黴菌孢子懸浮液後，於28°C，相對溼度95%，50001x人工氣候箱中進行培養，5d後觀察表型症狀的變化； 觀察方法是，在葉片接種部位出現明顯病斑的，說明被檢測基因與辣椒抗疫病相關；相反，在葉片接種部位沒有出現明顯病斑的，則說明被檢定基因與辣椒抗疫病無關，或是無功能基因。
全文摘要
本發明公開了一種快速鑑定辣椒抗疫病相關基因功能的方法。利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體葉片抗病性技術相結合的方法對辣椒的抗疫病相關基因CaPOD和CaRGA1進行功能鑑定，主要包括構建基因沉默表達載體，經農桿菌GV3101介導侵染辣椒葉片並觀察葉片的表型變化，產生沉默效果的辣椒植株葉片表現出明顯地病毒症狀；對沉默植株的離體葉片接種辣椒疫黴菌病原，在葉片接種部位出現明顯壞死病斑的，說明被檢測基因與辣椒抗疫病相關；相反，在葉片接種部位沒有出現明顯病斑的，則說明被檢定基因與辣椒抗疫病無關，或是無功能基因。該發明為大規模驗證辣椒抗病基因功能奠定了基礎，從而可極大地加快辣椒分子育種的進程。
文檔編號A01G7/06GK102812836SQ201210296540
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者鞏振輝, 王軍娥, 李大偉, 張瑩麗, 賀玉梅 申請人:西北農林科技大學