血管新生誘導劑的製作方法

2024-01-28 09:22:15 2

專利名稱：血管新生誘導劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及可以作為藥物組合物使用的血管新生誘導劑。
背景技術：
血管新生，是指從現有的血管形成小血管的現象，至今有很多研究者正在對血管新生的機理進行研究。血管新生，涉及到癌的增大及轉移、糖尿病性視網膜症和炎症性疾病(慢性風溼性關節炎)的發展，尤其出現了很多以治療癌症為目的抑制血管新生的研究。另一方面，近年來出現了對於被稱為「血管新生療法」的新的治療方法的研究，該療法通過利用並促進血管新生作用，積極向缺血組織周邊供給充足的血液而保護缺血組織，從而治療患處。
對於缺血性疾病的藥物療法，缺血的改善效果並不明顯，對於這樣的藥物治療不應性的缺血性病例，需要實施旁通手術等血行再建術。但是，也有不少因為腦血管障礙或腎功能障礙等併發症而不能實施血行再建術的病例。而且，循環系統疾病，例如，以閉塞性動脈硬化症或伯格氏病為代表的末梢血管疾病沒有有效的治療方法，在難以進行血管擴張術及外科血行再建術時，不得不截斷下肢。作為這樣嚴重的缺血性病例及循環系統疾病的新的治療方法，促進血管新生，形成新的血管的血管新生療法是很有效的。但是，這些技術還沒有達到實用化，急需開發一種有效且安全地誘導血管新生的優良藥劑。
在血管新生療法中作為具體開發的一例，可以例舉利用胚胎幹細胞(ES細胞)等的血管形成技術的研究(例如非專利文獻1)，但是其培養法、分化誘導法及分化細胞的取得方法等應具備的技術還不完善，沒有達到實用化。
另外如同上面所述，也進行了將從人類骨髓液中分離的骨髓單核細胞直接導入治療部位，形成血管新生的自體骨髓細胞移植法(例如非專利文獻2)的研究。但是，在該方法中，需要對患者實施全身麻醉而收取大量的骨髓液，因此不能避免對患者身體的負擔及危險。進而存在極其難以控制導入的細胞分化的問題。
根據本發明，通過在生物體中導入在外科手術等中可以用作止血劑等對生物體安全的纖維蛋白，可以在體內誘導血管新生的技術至今沒有出現過。而且，本發明為充分明確其機理，沒有必要必須使用可能因給藥產生副作用的生長因子，而且不會對患者造成採取骨髓液等外科負擔，從而更加安全。另外，纖維蛋白在生物體內具有優良的附著性，在生物體內施用時，在患處等目的部位可以容易達到固定化。
因此，通過利用本發明的血管新生誘導，可以實現在患處周邊形成血管而供給充足的血液，治療患處的在臨床及成本方面都非常實用的血管新生療法。
平島、片岡等(Hiarshima M.，Kataoka H.等)，「體外脈管形成模式中胚胎幹細胞向血管內皮細胞的成熟(Maturation of embryonic stemcells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis.)」，血液(Blood)，美國血液學會(American Society of Hematology)，(美國)，1999年2月15日，93卷，4號，1253-1263頁。
嶋田壽文、室原豐明，「利用自體骨髓細胞移植的血管再生治療」，再生醫學再生治療現代化學增刊，(株)東京化學同人，2002年7月1日，41卷，102-108頁。

發明內容
本發明的目的在於，提供對生物體安全的血管新生誘導劑。具體來說，本發明提供的由纖維蛋白構成的血管新生誘導劑，通過在臟器或組織內施用對生物體安全且具有優良的生物體附著性的纖維蛋白，形成血管新生。進而本發明的目的是提供用於再生治療的血管新生誘導劑。
本發明者在潛心研究中，意外發現通過在生物體內給藥纖維蛋白，可以誘導血管新生的新方法。而且，本發明者發現，通過在生物體內給藥纖維蛋白，可以利用其血管新生誘導作用供給細胞的增殖、維持所必需的氧及營養成分，而且可以使功能障礙或功能不全的生物體組織或臟器的功能再生。
本發明者以上述發現為基礎進一步進行研究，結果完成了本發明。
即，本發明涉及(1)血管新生誘導劑，其特徵在於，含有纖維蛋白；(2)根據前述(1)所述的血管新生誘導劑，其特徵在於，進一步含有生物體內分解性高分子；(3)根據前述(1)所述的血管新生誘導劑，進一步含有選白骨髓單核細胞、骨髓間質細胞、幹細胞、角質化細胞、成纖維細胞、心肌細胞、神經幹細胞、血管內皮細胞、內皮前體細胞、血管上皮細胞、成骨細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、胰臟細胞、腎臟細胞、腸細胞及胃細胞的細胞和/或由所選細胞構成的組織；(4)根據前述(1)所述的血管新生誘導劑，其特徵在於，進一步含有生長因子；(5)血管新生誘導方法，其特徵在於，用纖維蛋白處理生物體；(6)粒狀製劑，通過冷凍乾燥酶分解纖維蛋白原所得的纖維蛋白而得到；
(7)粒狀製劑，通過冷凍乾燥酶分解纖維蛋白原所得的纖維蛋白與鈣的混合物而得到；(8)皮膚移植方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(9)皮膚疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(10)末梢血管疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(11)心臟疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(12)腦疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(13)骨疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(14)人工臟器皮下移植方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(15)呼吸器官疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(16)消化器官疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(17) 內分泌、代謝疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(18)自體免疫疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白；(19)纖維蛋白在血管新生誘導中的應用。


圖1為在實施例1製備的纖維蛋白的給藥組及對照組中，皮瓣形成後第3天及第7天的皮瓣生存狀態的照片。
圖2是表示在實施例1中製備的纖維蛋白的給藥組及對照組中，皮瓣形成後第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的皮瓣生存率(％)的圖。
圖3表示在實施例1中製備的纖維蛋白的給藥組(a)及對照組(b)中，皮瓣形成後第7天收取各皮瓣，將該組織進行了HE染色。(c)表示在實施例1中製備的纖維蛋白的給藥組中，皮瓣形成後第50天收取皮瓣，將該組織進行了HE染色。
圖4表示在實施例1中製備的纖維蛋白的給藥組及對照組中，隨時間變化測定皮瓣形成後第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的各個皮下組織的血流量(ml/100g組織/分)。
圖5表示在實施例1中製備的纖維蛋白的給藥組及對照組中，在皮瓣形成後第1天、第3天及第7天，皮瓣上的0.5cm(a)位置及1.5cm(b)位置的各皮下組織血流量的恢復率(％)。
圖6表示在實施例1中製備的纖維蛋白的給藥組及對照組中，皮瓣形成後第3天及第7天的各皮瓣表皮溫度的恢復率(％)。
圖7表示在切斷了大腿動脈的大鼠缺血模型的缺血部位給藥實施例1中製備的纖維蛋白，給藥後第5天測定該部位血流量(ml/100g組織/分)的隨時間變化的結果。
具體實施例方式
本發明所使用的纖維蛋白沒有特別的限定，可以為市售的纖維蛋白粉、從市售的纖維蛋白原製成的物質、由人或動物的血漿精製的纖維蛋白原製成的物質。另外，也可以從利用DNA重組技術得到的纖維蛋白原的生成中所得到的含纖維蛋白原的細胞培養液製備纖維蛋白。而且這些纖維蛋白，優選細粒狀冷凍乾燥品，且在生理食鹽水或磷酸緩衝溶液等溶液中容易懸浮的形狀。作為市售的纖維蛋白，可以例舉根據厚生省藥務局監修的生物學製劑標準(1979年第201～203頁)製備的醫療用乾燥纖維蛋白，但優選作為止血劑等達到臨床實用化的、除去了病毒的物質。
作為將本發明的血管新生誘導劑進行給藥的對象，包括人及其他哺乳動物。
從人或動物的血漿分離纖維蛋白原時，從生物體適合性的角度考慮，以人為對象時優選從人的血漿分離，或以動物為對象時優選從這種動物的血漿分離。纖維蛋白原的分離方法沒有特別的限定，可以通過公知的血漿分離法進行。通過血漿分離法得到的纖維蛋白原沉澱物的進一步精製，可以使用本領域技術人員公知的技術，例如，在鹽和/或胺基酸存在的條件下，利用蛋白質沉澱物使纖維蛋白再沉澱的技術，或色譜技術(例如離子交換、親和層析、疏水性或凝膠過濾層析法)中使用任一技術，或兩種技術組合使用。優選除去混入的血漿汙染物質，例如纖連蛋白和纖溶酶原分別利用被固定的明膠和被固定的賴氨酸吸收、除去。通過實施了這種操作的纖維蛋白原形成的纖維蛋白的自體溶解被抑制，從而可以長時間保持穩定。
另外，從人或動物的血漿製備的纖維蛋白原，優選實施熱處理、化學處理，從而除去對生物體有害的病毒。
分離的纖維蛋白原可以懸浮在適當的水性溶劑等中形成纖維蛋白原溶液。而且也可以將該纖維蛋白原溶液冷凍乾燥而製成纖維蛋白原冷凍乾燥品。冷凍乾燥法可以根據公知的技術進行。
從市售的纖維蛋白原，或從人或動物的血漿中分離的纖維蛋白原製備纖維蛋白時，優選使用除去了病毒的高純度凝血酶製備。作為高純度的凝血酶，優選用作臟器止血劑等的口服用凝血酶細粒劑等市售的藥典記載品，但是通常也可以使用具有作為凝血酶的生物活性或生理活性的物質，例如可以使用將血漿蛋白分離而得到的物質等。也就是說，例如，也可以精製使用，在Ca2+存在的條件下將組織促凝血酶原激酶或蛇毒作用於人或牛的血漿精製的凝血酶原而製備的物質。凝血酶的精製，優選單獨使用疏水作用色譜(HIC)或配合陽離子交換色譜(CEC)進行。
上述纖維蛋白的製備中，纖維蛋白原溶解時的濃度為4～12w/v％，優選6～10w/v％。因為在該濃度範圍中，所製備的纖維蛋白的粘著強度增大。作為溶解纖維蛋白原的溶劑，可以使用注射用蒸餾水、注射用生理食鹽水、pH為5～8的緩衝液(磷酸系、檸檬酸系等)等水性溶劑。
關於在上述纖維蛋白原溶液中添加的凝血酶的混合量，為了不降低纖維蛋白的交聯度(聚合度)而形成穩定的凝血酶，在每1mg纖維蛋白原中優選添加0.07至0.36單位的凝血酶，更加優選添加0.07至0.25單位。關於凝血酶的單位，通常將1ml的0.1％精製纖維蛋白原溶液凝固15秒的量設定為1單位(NIH(美國全國衛生研究所)單位[Minimum Requirements for Dried Thorombin](乾燥凝血酶的最低要求)(1946))。
在本發明中，將市售的纖維蛋白原，或從人或動物(例如牛)的血漿中製備的纖維蛋白原在上述溶劑中懸浮之後，優選添加適量的凝血酶，在攪拌條件下以37℃左右溫度溫育一夜而使其進行酶反應，生成纖維蛋白。利用上述方法生成的纖維狀纖維蛋白，優選通過濾紙等從反應溶液分離，並通過冷凍乾燥而形成粒狀。生成的纖維蛋白的分離及冷凍乾燥的方法，可以按照公知的方法進行。
利用上述方法得到的纖維蛋白冷凍乾燥品，可以含有鈣。鈣的添加，優選在纖維蛋白原中添加凝血酶而進行酶反應時進行。通過鈣的添加，纖維蛋白與Ca2+進行聚合、交聯反應從而可以提高纖維蛋白的穩定性。添加的Ca2+優選2mM以上，優選以CaCl2等鈣鹽的形式添加。而且，雖然纖維蛋白具有生物體內分解性，但是通過添加鈣，可以調整在生物體內纖維蛋白的分解時間，並且根據疾病的程度等，可以使誘導血管新生的時間延長。
另外，利用上述方法得到的纖維蛋白冷凍乾燥品，根據使用目的、使用場所、纖維蛋白在生物體內的滯留時間等，也可以進一步含有其他生物體內分解性高分子。其他生物體內分解性高分子，可以在冷凍乾燥纖維蛋白而形成粒狀品時，或將纖維蛋白粒狀品懸浮在適當的水性溶劑時，與纖維蛋白混合。作為生物體內分解性高分子，已知有天然高分子及合成高分子。作為天然高分子，可以例舉葡聚糖、透明質酸、殼多糖、殼聚糖、脫乙醯殼多糖、藻酸、硫酸軟骨素、澱粉、普魯蘭多糖(プルラン)等多糖或這些多糖的衍生物，或白蛋白、膠原蛋白、明膠等蛋白質。在本發明中，優選天然物質，特別優選來自天然植物的高分子，例如明膠等。作為合成高分子，可以例舉聚乙醇酸、聚乳酸、聚氰基丙烯酸酯等。這些材料任何一個都在體內被吸收而消失，所以沒有必要考慮生物體內適合性，而且因為沒有細胞毒性，所以不存在有關生物體安全性的問題。
含有利用上述方法得到的纖維蛋白的血管新生誘導劑的生物體給藥形式，因為根據給藥患者等的疾病種類、疾病部位、疾病程度等各不相同，故不能一概而論，通常根據醫生的判斷確定，但優選給藥形式如下面所述。
本發明的血管新生誘導劑，可以以粉體形式直接給藥至生物體內的目標部位，或在注射用蒸餾水、注射用生理食鹽水、pH為5～8的緩衝液(磷酸系、檸檬酸系等)等水性溶劑的液狀賦形劑中懸浮，例如可以通過注射、塗布等方式給藥。另外，也可以與適當的賦形劑混合，形成軟膏狀、凝膠狀、奶油狀等，例如可以作為纖維蛋白凝膠等進行塗布。進而，在上述水性溶劑等中，懸浮含有纖維蛋白的本發明的血管新生誘導劑，之後通過除去溶劑而形成例如片狀、塊狀、球狀等適當形狀，例如作成纖維蛋白片，將其給藥至生物體的目標部位。這些製劑中使用的賦形劑，只要是可以添加到藥品的則沒有特別的限定，但是優選具有生物體內分解性的那些，另外製劑化方法可以採用該領域中公知的方法。
關於對生物體的纖維蛋白給藥量，相對於給藥生物體的表面積1cm2，優選為1～10mg，更優選1～5mg，特別優選2～3mg。但是，該給藥量並沒有限定於此，從而不能一概而論，所以如上所述，根據給藥部位的疾病等狀況或纖維蛋白在生物體內的滯留處置時間等，根據醫生的判斷確定，而且可以變更。另外，本發明的血管新生誘導劑的劑型為水溶液或軟膏時，賦形劑與纖維蛋白的配比相對於纖維蛋白4mg，賦形劑優選為100～500μl。
本發明的含有纖維蛋白的血管新生誘導劑的血管新生誘導效果的確認方法，沒有特別的限定，可以將本發明的血管新生誘導劑向實驗動物(例如兔子、大鼠或小鼠等動物)給藥，通過確認給藥部的細動脈的增加而進行。作為確認給藥部的細動脈新生的方法，例如，向實驗動物將本發明的血管新生誘導劑給藥之後，用肉眼確認給藥部中細動脈的新生狀況，或收取給藥部的組織並用福馬林固定之後，將該部位實施HE(蘇木精-曙紅)染色而進行調查。進而也可以通過測定給藥部位的血流量、表皮溫度等進行。
在本發明中，進行了使用裸小鼠的皮瓣生存率的研究。本發明的血管新生誘導劑塗布在剝離皮瓣後的皮下組織上，可以確認血管新生誘導效果。具體來說，血管新生的誘導效果的確認通過如下方法實施切開小鼠皮膚，在產生的皮瓣與剝離皮瓣後的皮下組織之間塗布該血管新生誘導劑，之後測定皮下組織的血流量、皮膚表面溫度等。另外，也可以通過如下方法實施通過切斷小鼠的動脈等人為製作生物體內的缺血部位，向缺血部位將該血管新生誘導劑給藥之後，測定該部位的血流量。血流量、皮膚溫度等的測定方法，可以為公知的方法，例如對於血流量的測定，可以例舉通過利用雷射散射的實時血流測定裝置，例如使用雷射都卜勒裝置(型號ALF2100，Advance Co.Ltd.製備)的方法；關於皮膚溫度的測定，可以例舉拍攝溫度記錄圖象，通過電子計算機分析溫度分布，例如使用溫度描記器(サ一モトレ一サ)(TH3100ME、NEC.公司製備)的方法。
在本發明中，通過向生物體給藥纖維蛋白，可以誘導血管新生，可以達到功能障礙或功能不全的生物體內組織及臟器的功能再生，而且通過將細胞或組織等與纖維蛋白一同向生物體內給藥，可以進一步促進其效果。
再生治療的實施，通常需要移植細胞、血管生長、細胞增殖因子等，成為組織再生立足點的生物體內適合材料，進而需要用於維持移植細胞的生物體功能的氧及營養成分的供給源。這些因子被導入生物體內，且在生物體內形成網絡，可以實現功能障礙或功能不全的生物體內組織及臟器的功能再生。
使用本發明的含有纖維蛋白的血管新生誘導劑時，纖維蛋白不僅具有作為生物體內適合材料的功能，而且也具有作為氧、營養成分的供給源的作用。即，作為生物體內分解性高分子的纖維蛋白，具有作為促進移植細胞的粘著、分化、形態形成的立足點的功能，而且通過誘導血管新生發揮作為移植細胞的氧、營養成分的供給源的作用。進而為增進血管新生而在本發明的血管新生誘導劑中含有bFGF、VEGF、HGF等生長因子時，纖維蛋白可以取得在組織再生的地方持續放出生長因子的緩釋效果。
作為在本發明中使用的生長因子，可以例舉成纖維細胞生長因子(FGF)[包括鹼性FGF及酸性FGF]、血管內皮細胞生長因子(VEGF)[優選來自血小板]、肝細胞生長因子(HGF)、血管生成素(包括血管生成素-1和血管生成素-2)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、胎兒型平滑肌肌球蛋白重鏈(SMemb)、生長激素(GH)或其類似物質、其他細胞增殖促進因子等。這些生長因子可以單獨使用一種，也可以組合兩種以上使用。這些物質的用法、用量只要在公知的範圍，則沒有特別的限定，需要根據將本發明的血管新生誘導劑給藥的患者等的疾病、該血管新生誘導劑的給藥形式及處置時間等因素而確定，所以不能一概而論。因此，生長因子的用法、用量，優選根據醫生等的判斷確定，通常相對於每4mg纖維蛋白，生長因子的混合量約為1ng～100μg，特別優選1ng～50μg。
作為本發明的纖維蛋白構成的血管新生誘導劑中使用的移植細胞或移植組織，可以例舉骨髓單核細胞、骨髓間質細胞、胚胎幹細胞(ES細胞)等未分化細胞，角質化細胞或成纖維細胞、血管內皮細胞、血管上皮細胞、內皮前體細胞等分化細胞以及這些分化細胞構成的組織。
作為再生治療的代表性領域，可以例舉皮膚再生治療。因火灼傷、或進行皮膚癌手術時，在患者的皮膚上會殘留疤痕。為治癒這些創傷部位，生物體內的自體皮膚再生功能是必不可少的。通過在創傷部位塗布或注入由本發明的纖維蛋白構成的血管新生誘導劑，角質化細胞或成纖維細胞從該周邊的皮膚組織進入纖維蛋白內，並誘導血管新生，從而促進細胞的增殖，表皮、真皮組織得到再生。表皮組織難以進行自體再生時，通過將患者的其他部分表皮移植到再生的真皮上，在再生真皮與移植表皮之間塗布本發明的纖維蛋白構成的血管新生誘導劑，進一步誘導血管新生而可以提高表皮的粘著性。難以進行自體皮膚再生時，以覆蓋保護為目的實施皮膚移植等，但是用於移植的皮膚即使是從患者本人剝離的自體皮膚，或在生物體外培養的培養皮膚，通過在創傷部與皮膚之間通過給藥本發明的血管新生誘導劑，可以提高與移植皮膚的覆蓋部位的粘著性。另外，通過在本發明的血管新生誘導劑內預先含有角質化細胞或成纖維細胞等和/或生長因子等，可以提高自體組織的再生及移植皮膚的粘著性。
閉塞性動脈硬化、慢性閉塞性動脈硬化、糖尿病、壞疽、雷諾氏病及伯格氏病為代表的末梢性血管疾病沒有有效的治療方法，在難以進行血管擴張術及血管旁通手術等血行再建術時，不得不截斷下肢。對於這樣嚴重的末梢性血管疾病的治療方法，誘導血管新生，形成新血管的本發明的含有纖維蛋白的血管新生誘導劑是有用的。通過在疾患部給藥本發明的血管新生誘導劑，因血管新生而形成側副動脈(旁通)，可以改善缺血部。而且，在本發明的含有纖維蛋白的血管新生誘導劑中，為了進一步促進血管新生，可以預先配合有關血管形成的血管內皮細胞、血管上皮細胞、內皮前體細胞和/或骨髓單核細胞等，也可以進一步配合bFGF、VEGF、HGF等生長因子。
對於心肌梗塞症、擴張型心肌症等心臟疾病，因為心肌沒有再生能力，故因心肌壞死而使收縮功能不全時，除了心臟移植方法之外，至今沒有其他治療方法。但是，通過使用本發明的含有纖維蛋白的血管新生誘導劑，可以再生心肌功能。也就是說，在本發明的血管新生誘導劑中含有心肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞等，通過將其給藥至心臟的壞死區域，可以使壞死區域的心肌組織再生，而且從宿主的健康的周邊心肌部誘導血管，與宿主的心肌組織連接的同時可以再生能夠收縮的心肌組織。
腦挫傷、帕金森氏病、多發性硬化症或腦梗塞等腦疾病，必須改善受損的腦功能，嘗試了神經上皮型幹細胞等神經幹細胞的腦內移植。在神經細胞的移植治療中，需要被移植的神經幹細胞在宿主的組織內生存，形成突觸而再建神經網絡。為了再建神經網絡，需要在移植細胞周邊誘導血管新生，將移植的細胞分化成神經細胞、神經膠星狀細胞等各種細胞。此時，通過將含有該移植細胞的本發明的血管新生誘導劑給藥至腦內，可以同時誘導血管新生，促進腦內神經網絡的再建。
在骨折等的治療中，將直接固定工具貼在作為損傷部位的骨上進行治療。此時，通過將固定工具和本發明的血管新生誘導劑結合使用，例如通過在固定工具上負載本發明的血管新生誘導劑，可以促進骨形成，加快治療速度。另外，在本發明的血管新生誘導劑中含有成骨細胞、軟骨細胞等，可以進一步促進骨形成。
另外，作為骨和關節疾病等的治療方法，嘗試了利用人工骨、人工關節的人工骨、關節置換術，但該置換術的課題是如何使人工骨與患者的周圍組織融合為一體。作為解決這個課題的方法，需要開發一種與患者自身的周圍細胞一體化，可以與周邊組織一同生長的人工骨等。為了得到具有上述功能的人工骨，需要開發如下人工骨的基材具有網孔結構的，可以三維培養骨髓幹細胞、成骨細胞、軟骨細胞等移植細胞；具有優良的生物體適合性；一定時間內可以在生物體內被吸收。本發明的血管新生誘導劑以纖維蛋白為其構成成分，所以具有優良的生物體適合性及生物體內分解性，而且通過血管新生誘導作用可以促進移植細胞的增殖。從而，通過使用本發明的血管新生誘導劑，可以得到優良的人工關節、人工骨。
作為消化器官疾病所公知的缺血性大腸炎、腸閉塞等，是一伴隨由腸的血液循環障礙所導致的腸組織或腸平滑肌細胞壞死的重病。另外，胃潰瘍或十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎等潰瘍性消化器官疾病，也因腸平滑肌細胞壞死而使平滑肌層受到傷害。通過在本發明的含有纖維蛋白的血管新生誘導劑中配合腸細胞、腸平滑肌細胞或胃細胞等並給藥至壞死區域，可以從宿主的健康周邊組織誘導血管，可以再生壞死區域的腸組織或胃組織。
作為恢復功能不全的臟器功能的方法，有使用人工臟器的方法，於是為了實現該方法，正在開發可以長時間埋入體內，具有半永久性功能的人工臟器。特別是，從長時間維持人工臟器功能的目的出發，進行了以人工臟器為基材，嵌入培養細胞的生物人工臟器的研究開發。生物人工臟器，根據其形狀有微膠囊型、大膠囊型等，但任一個都具有在生物體內環境中用於防止生物體的免疫系統襲擊的防禦手段，例如免疫隔離膜等防禦屏障，和可以替代恢復功能的移植細胞及保持移植細胞功能的細胞外基質(培養基)。而且，這些人工臟器中負載的移植細胞，為了維持細胞功能，需要從血液供給氧和營養成分。從而，通過將本發明的由纖維蛋白構成的血管新生誘導劑與該人工臟器複合，可以製作有效增殖、維持人工臟器內移植細胞的生物人工臟器。
作為上述生物人工臟器內負載的移植細胞，可以例舉胰島細胞、胰內分泌細胞、腎臟細胞、肺上皮細胞等。通過使用這些細胞，可以製作各種生物人工胰臟、生物人工腎臟、生物人工肺等。通過移植這種生物胰臟(胰島)，可以將作為內分泌、代謝疾病一例的糖尿病引起的高血糖症，調整至生理更正常狀態。通過移植生物人工腎臟，可以減少因自體免疫不全疾病而必須定期進行血液透析療法等的腎功能不全患者的肉體上的負擔。另外，通過移植生物人工肺，可以恢復肺組織、細胞的損傷、破壞或肺炎、肺纖維化疾症、肺氣腫等呼吸器官疾病導致的障礙、肺功能低下。
進而，通過本發明的血管新生誘導劑的效果，可以在缺血部誘導血管，所以可以進行一直以來難以進行的人工臟器及生物人工臟器的皮下、肌肉內的移植。皮下或肌肉內，可以以比較輕微的侵襲進行移植，並且從該部位移植的人工臟器等的回收也容易，所以被認為是理想的移植部位，但是，在其反面，血管的分布密度稀疏，因而難以用作細胞增殖、生存的場所。也就是說，通過在生物人工臟器內複合本發明的血管新生誘導劑後進行移植，在皮下或肌肉內可以誘導血管新生，可以恢復該部位的缺血狀態，所以在皮下或肌肉內生物人工臟器也可以有效發揮其功能。
在本發明的血管新生誘導劑中配合上述細胞等時，所用細胞可以任選自培養細胞及非培養細胞，其培養方法及從生物體的分離方法，可以使用公知的方法。例如，血管內皮細胞，可以為動脈、大動脈、靜脈及臍帶靜脈中的任一血管的內皮細胞。從血管分離內皮細胞時，例如可以收取將血管內壁進行胰蛋白酶等蛋白酶處理而游離的細胞。骨髓單核細胞可以利用常規方法從骨髓液分離，骨髓液可以從胸骨或骨盆收取。而且，分離的細胞，根據需要也可以進行培養後使用。另外，這些血管內皮細胞或骨髓單核細胞等，可以為患者或病畜等的自體來源或具有移植適合性的其他來源，但優選患者等的自體來源。
在本發明的血管新生誘導劑中配合細胞時的狀態，沒有特別的限定，需要根據將本發明的血管新生誘導劑給藥的患者等的疾病、該血管新生誘導劑的給藥形式及處置時間等因素而確定，通常相對於每4mg纖維蛋白，細胞數為1×102～106個，特別優選1×103～105個。
另外，在本發明的血管新生誘導劑中配合細胞的方法沒有特別的限定，例如，可以在纖維蛋白乳濁液中均勻懸浮細胞，得到細胞乳濁液，或按上述作成纖維蛋白凝膠或纖維蛋白片，通過在其中均勻含有細胞而實施。利用這種方法製備的製劑中，形成在製劑內配合的細胞被纖維蛋白均勻覆蓋的形態，將該製劑給藥到生物體時，可以有效且均勻再生血管。而且，與細胞一同給藥的纖維蛋白在生物體內分解、消失，給藥的細胞同樣通過增殖、粘著，形成具有健全的生物體內網絡功能的器官組織。
下面，利用實施例等詳細說明本發明，但本發明沒有限定於下述各例。
纖維蛋白的製備將500mg的纖維蛋白原(Sigma公司製備)緩慢添加到500ml的PBS(-)(pH7.2)溶液中，利用攪拌器進行攪拌而使其完全溶解。在得到的纖維蛋白原溶液中，添加125單位的凝血酶(Sigma公司製備)，在室溫下攪拌一小時。從溶液中收取析出的纖維蛋白，在500ml的蒸餾水中進行30分鐘攪拌。重複3次洗淨操作。在洗淨之後，用濾紙(ADVANTEC公司製備，5A)除去纖維蛋白的水分，放入500ml離心管中並在-80℃下冷凍保存一夜。將凍結的纖維蛋白乾燥，得到了約為280mg的粒狀纖維蛋白。冷凍乾燥使用東京理科機械公司製備的FDU-830，在溫度-40℃條件下進行一夜。
在Eppendorf管內各移入4mg所得的粒狀纖維蛋白，通過氣體滅菌器(西本產業公司製備、イオジエクトSA-360)實施氣體滅菌之後，在室溫下保存。
使用裸小鼠的皮瓣生存率的研究在8～10周齡的裸小鼠(日本SLC株式會社、BALB/C-nu)中，腹腔內給藥戊巴比妥鈉(50mg/kg)而進行麻醉，在背部正中線部的皮膚中，不切開距離肩胛骨1cm位置的橫向1邊(基底邊Base of Flap)的狀態下，切開、剝離3邊成橫向1cm、縱向2cm的方形，製作了皮瓣(參照圖1)。
每隻小鼠給藥4mg實施例1中製備的纖維蛋白。給藥方法如下在Eppendorf管內將4mg纖維蛋白懸浮在20μl的PBS(-)中，用刮鏟將該溶液均勻塗布在皮瓣與皮下組織之間。塗布之後立即縫合切開部。重複這個操作，製作了9個實施例1中製備的纖維蛋白的給藥模型組。作為對照組，製作了只給藥沒有添加實施例1中製備的纖維蛋白的20μlPBS(-)的9隻(n＝9)小鼠。給藥模型組及對照組，在縫合之後回到飼養籠，通常用固體飼料及水來飼養。
皮瓣的生存率測定在試驗例1中製作的給藥模型組(n＝9)及對照組(n＝9)中，測定了皮瓣形成後第3天及第7天的皮瓣生存率。
將皮瓣形成後第3天及第7天的兩組小鼠固定在實驗臺上，用數位相機拍攝(圖1)背部圖象並傳送到電子計算機上。利用圖象處理軟體(Mac Aspect)分析圖象，算出了整個皮瓣的生存率。兩組的皮瓣生存率通過將整個皮瓣面積設定為100，扣除壞死部面積的比例而求得。在圖2中，表示了兩組的皮瓣形成後第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的皮瓣生存率。其中，進行t檢驗，求得了兩組之間的差異。
在對照組中，皮瓣的生存率在第3天約為44.5±6.07％(平均值±標準誤差)，第7天大約下降為32.0±4.38％。與對照組相比，給藥模型組中，顯示出了第3天及第7天皮瓣的生存率約為72.9±2.54％及73.0±3.89％的高值。這是因為通過在實施例1中製備的纖維蛋白皮瓣缺血部的血管得到新生，促進了剝離的皮瓣與皮下組織的粘著。實際上，收取皮瓣形成後第7天的兩組皮瓣組織實施HE染色(圖3(a)(b))時，在給藥模型組中，與對照組相比發現在肌肉組織內形成了明顯的血管網，發生了良好的血管新生。其中，作為參考，收取了在實施例1中製備的纖維蛋白的給藥組的皮瓣形成後第50天的皮瓣組織，實施了HE染色，結果如圖3(c)所示。根據這個結果，可以確定在皮瓣與皮下組織粘著之後，纖維蛋白完全分解，形成正常的組織。
血流量測定試驗在試驗例1中製作的給藥模型組(n＝1)及對照組(n＝1)中，測定了皮瓣形成後第3天及第7天的皮瓣中心部的血流量。
將兩組小鼠固定在實驗臺上，將背部已縫合的皮瓣表面的中心部位作為雷射都卜勒裝置(型號ALF2100，Advance Co.Ltd.製備)的雷射照射部，測定了一定時間血流量的變化。此時，儘量在照射部與小鼠皮瓣表面密合的狀態下測定。在圖4(a)(b)(c)(d)中，表示了在得到穩定血流量的時間帶中血流量的變化。(a)及(b)表示皮瓣形成後第3天兩組的血流量(ml/100g組織/分)，(c)及(d)表示瓣形成後第7天兩組的血流量(ml/100g組織/分)。
根據這些結果，可以得到如下結論。皮瓣形成後第3天，給藥模型組的血流量大約變化14～16ml/100g組織/分，對照組的血流量大約變化4～5.5ml/100g組織/分。皮瓣形成後第7天，給藥模型組的血流量大約變化11～20.5ml/100g組織/分，對照組的血流量大約變化4.5～5.5ml/100g組織/分。因此，不論是第3天還是第7天，給藥模型組的血流量與對照組相比均顯示出明顯的高值，從而可以確定通過給藥實施例1中製備的纖維蛋白，可以提高血流量。
血流量恢復試驗在試驗例1中製作的給藥模型組(n＝5)及對照組(n＝4)中，測定了皮瓣形成後第1天、第3天及第7天的皮瓣血流量的恢復率。
將兩組小鼠固定在實驗臺上，設置了其背部已縫合的皮瓣表面(橫向1cm、縱向2cm方形)的縱向4等分線(將縱向2cm以0.5cm間隔分割)，和橫向3等分線(將橫向1cm大約以0.33cm間隔分割)。將距離基底邊0.5cm及1.5cm處的線，與橫向3等分線之間的4個交點進行標記，將該4處作為雷射都卜勒裝置(型號ALF2100，Advance Co.Ltd.製備)的雷射照射部，測定了血流量(ml/100g組織/分)。此時，儘量在照射部與小鼠皮瓣表面密合的狀態下測定。其中，距離基底邊0.5cm位置的線上的兩點血流量的平均值作為0.5cm位置的血流量，距離基底邊1.5cm的線上的兩點血流量的平均值作為1.5cm位置的血流量。對進行皮瓣形成前的兩組各個小鼠通過測定相同4處的血流量而得到的血流量的平均值設定為100，以相對這100的比例(％)表示血流量的恢復率。其中，進行t檢驗，求得兩組之間的有效差。
在圖5(a)及(b)中表示了0.5cm及1.5cm位置血流恢復率的結果。在對照組中，在接近基底邊的0.5cm位置，第7天的血流量恢復了70.4±13.29％(平均值±標準誤差)程度，在1.5cm位置，第7天的血流量只恢復了5.23±8.27％(平均值±標準誤差)程度。與此相對，在給藥模型組中，在接近基底邊的0.5cm位置，第3天的血流量幾乎恢復到100％，在1.5cm位置，第7天的血流量只恢復了81.75±16.29％。從而可以確定通過給藥實施例1中製備的纖維蛋白，可以得到顯著的血流量恢復。
表1表示詳細的實驗數據。
表1

血流量ml/100g組織/分[試驗例5]皮膚溫度恢復試驗在試驗例1中製作的給藥模型組(n＝5)及對照組(n＝4)中，測定了皮瓣形成後第3天及第7天的皮瓣表面溫度。
將兩組小鼠固定在實驗臺上，用溫度描記器(TH3100ME、NEC公司製備)拍攝了包括背部已縫合皮瓣的區域的表面溫度。拍攝模式設定為級別(レベル)35℃、靈敏度(センフ)0.7℃、掃描模式SC∑4。在拍攝的圖象基礎上，進行皮瓣區域的表皮溫度分布的分析，求得該區域內的溫度平均值。對進行皮瓣形成前的兩組各個小鼠通過預先分析相同皮瓣區域的表皮溫度分布而得到的平均值設定為100，以相對於該100的比例(％)表示表皮溫度的恢復率。
圖6表示結果。在給藥模型組中，第3天及第7天與對照組相比，得到了顯著的皮膚溫度恢復。特別是第7天的恢復率幾乎達到100％，從而可以確定通過給藥實施例1中製備的纖維蛋白，可以顯著恢復皮膚溫度。
大鼠缺血模型中的血流量測定試驗在8～10周齡的大鼠(清水實驗材料(株)、京都)中，腹腔內給藥戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)而進行麻醉。在大鼠的右大腿根部內側完全切斷大腿動脈，在右下肢製作了缺血區域(缺血模型)。在Eppendorf管內，將實施例1中製備的纖維蛋白8mg在400μl的PBS(-)中無菌懸浮，並通過注射將各100μl該溶液各自給藥至缺血模型的右下肢缺血區域中的4處(給藥模型組，n＝1)。使用雷射都卜勒裝置(型號ALF2100，Advance Co.Ltd.製備)，測定了切開大腿大動脈後第5天右下肢缺血區域的血流量。測定方法如同試驗例3，測定了缺血區域內的血流量。在對照組(n＝1)中，只給藥不含纖維蛋白的PBS(-)400μl。
給藥模型組及對照組的各個結果用圖7(a)及(b)表示。給藥模型組的血流量大約變化12～13ml/100g組織/分，對照組的血流量大約變化4～4.5ml/100g組織/分。給藥模型組的血流量與對照組相比顯示出明顯的高值，從而可以確定通過給藥實施例1中製備的纖維蛋白，可以改善血流量。
發明效果通過在生物體內給藥本發明的含有纖維蛋白的血管新生誘導劑，可以安全且有效誘導血管新生，可以實現功能障礙和功能不全的生物體組織及臟器的功能再生。
權利要求
1.一種血管新生誘導劑，其特徵在於，含有纖維蛋白。
2.根據權利要求1所述的血管新生誘導劑，其特徵在於，進一步含有生物體內分解性高分子。
3.根據權利要求1所述的血管新生誘導劑，其特徵在於，進一步含有選白骨髓單核細胞、骨髓間質細胞、幹細胞、角質化細胞、成纖維細胞、心肌細胞、神經幹細胞、血管內皮細胞、內皮前體細胞、血管上皮細胞、成骨細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、胰臟細胞、腎臟細胞、腸細胞及胃細胞的細胞和/或由所選細胞構成的組織。
4.根據權利要求1所述的血管新生誘導劑，其特徵在於，進一步含有生長因子。
5.血管新生誘導方法，其特徵在於，用纖維蛋白處理生物體。
6.粒狀製劑，通過冷凍乾燥酶分解纖維蛋白原所得的纖維蛋白而得到。
7.粒狀製劑，通過冷凍乾燥酶分解纖維蛋白原所得的纖維蛋白與鈣的混合物而得到。
8.皮膚移植方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
9.皮膚疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
10.末梢血管疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
11.心臟疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
12.腦疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
13.骨疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
14.人工臟器皮下移植方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
15.呼吸器官疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
16.消化器官疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
17.內分泌、代謝疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
18.自體免疫疾病的預防及治療方法，其特徵在於，使用纖維蛋白。
19.纖維蛋白在血管新生誘導中的應用。
全文摘要
本發明的目的在於提供對生物體安全的血管新生誘導劑。通過向生物體內給藥，本發明提供的血管新生誘導劑可以安全誘導血管新生，實現功能障礙和功能不全的生物體組織及臟器的功能再生。
文檔編號A61K35/28GK1491720SQ0310845
公開日2004年4月28日 申請日期2003年4月11日 優先權日2002年10月23日
發明者井上一知, 顧元駿, 金度勳 申請人:井上一知, 創新株式會社