Wnt蛋白及癌症的檢測與治療的製作方法

2024-01-20 23:21:15 3

專利名稱：：Wnt蛋白及癌症的檢測與治療的製作方法
技術領域：
：本發明涉及肝癌的檢測與治療。
背景技術：
：肝細胞癌(HCC)是肝臟主要的原發性惡性腫瘤。雖然已經鑑定了病毒病原學因素，但是肝癌形成期間導致胂瘤發展的分子機制在很大程度上仍然未知。蛋白的Frizzled家族由IO個或更多個七跨膜蛋白組成，這些蛋白起Wnt蛋白受體的作用。Wnt/Frizzled信號傳導網絡影響多種生物學過程，其範圍從細胞命運決定到細胞遷移和增殖。卩-聯蛋白是在細胞-細胞粘著中發揮作用的多因子蛋白，其參與增強4丐粘著蛋白及a-聯蛋白與肌動蛋白細胞骨架的連接。當缺乏Wnt/Frizzled信號傳導時，卩-聯蛋白通過與糖原合酶激酶(GSK)-3(3的相互作用被磷酸化，並形成與軸蛋白和腺瘤性結腸息肉蛋白(adenomatouspolyposiscoliprotein,APC)的複合物。隨後，卩-聯蛋白被靶向來由泛蛋白蛋白酶體系統降解。相反，Wnt配體與其Frizzled受體的結合通過抑制GSK-3卩酶促活性穩定細胞內的p-聯蛋白。然後，(3—聯蛋白易位到糹田月包核中，與高速泳動族(highmobilitygroup)結構域因子，如Tcf/Lef聯合。該複合物與生長調節及細胞遷移相關基因的轉錄上調有關。發明概述本發明部分基於下述發現，即Wnt3、8b和11是Frizzled7的配體，其通常在HCC中，例如在B肝病毒(HBV)相關的HCC中在mRNA和蛋白水平過度表達。過度表達Frizzled7的肝癌細胞顯示出細胞移動性和遷移增強。過度表達似乎為肝細胞轉化的多步過程中的早期事件，因此，Frizzled7及Wnt3、8b和11是肝癌治療中新的分子靶標。因此，在一方面，本發明糹是供了鑑定抗癌劑的方法。該方法包4舌擇選與包含Wnt3、Wnt8b或Wnt11蛋白的胺基酸序列或其FZD結合片段的多肽結合的測試化合物，和任選的測定測試化合物是否能夠(i)降低細胞中Wnt/FZD7信號傳導，U)降低肝癌細胞移動性，(iii)降低肝癌細胞中卩-聯蛋白的積聚；或(iv)在體外或體內治療肝癌；其中能夠達到(i)到(iv)中至少一項的測試化合物是抗癌劑。在一些實施例中，選擇測試化合物可以包括提供包含Wnt3、Wnt8b或Wnt11蛋白的胺基酸序列或其i《D結合片段的多肽，將所述多肽與測試化合物接觸，檢測所述多肽與測試化合物之間的結合；和如果所述測試化合物和多肽結合，選擇所述測試化合物。與測試化合物結合的多肽可以是(i)天然存在的多肽，(ii)重組多肽，(iii)在細胞表面表達的多肽，或(iv)分離的多肽。當多肽包含Wnt3蛋白的胺基酸序列時，所述多肽可以包含SEQII〕NO:8到12中的任一序列。當所述多肽包含Wnt8b蛋白的胺基酸序列時，所述多肽可以包括SEQIDNO:5到19中任一序列。當多肽包含Wnt11蛋白的胺基酸序列時，所述多肽可以包含SEQIDNO:22到26中任一序列。在某些實施例中，所述多肽包含SEQID:7到27中任一序列以及至少一個非Wnt序列。測試化合物可以選自下組多肽、核糖核酸、小分子(如小有機分子)和脫氧核糖核酸。通過本文所述的鑑定癌症試劑的方法鑑定的抗癌劑包括，但不限於，抗Wnt抗體，如單克隆抗體，FZD7受體，FZD7受體的Wnt結合片段和其它結合Wnt的化合物。通過這些方法鑑定的抗癌劑可以^^用於治療癌症，例如肝癌。此外，通過這些方法鑑定的抗癌劑可以一皮用於製備用以治療肝癌或降低患者中肝癌細胞移動'性的藥物。另一方面，本發明包括鑑定候選抗癌劑的方法。該方法包括(a)提供第一多肽，所述第一多肽(i)含有FZD多肽(如FZD7多肽)或其片段；和(ii)顯示與Wnt(如Wnt3、8b或11)結合的能力；(b)提供第二多肽，所述第二多肽(i)含有Wnt多肽(如Wnt3、8b或11多肽)或其片段；和(ii)顯示與FZD(如FZD7)結合的能力；(c)在存在測試化合物的條件下使第一和第二多肽接觸；和(d)比較存在測試化合物時第一與第二多肽的結合水平和不存在測試化合物時的結合水平，其中存在測試化合物時與不存在時相比結合水平下降表明測試化合物是候選的抗癌劑。該方法可以進一步包括(e)確定候選抗癌劑是否能夠(i)降低細胞中Wnt/FZD7信號傳導；(ii)降低癌細胞移動性；(iii)降低癌細胞中p-聯蛋白的積聚；或(iv)在體外或體內治療癌症；其中能夠達到(i)至(iv)中至少一項的候選物是抗癌劑。所述測試化合物可以選自下組多肽、核糖核酸、小分子(如小有機分子)和脫氧核糖核酸。Wnt多肽可以包括，如SEQII)NO:8到12,15到19和/或22到26。FZD多肽可以包括，如S1:QII)N:l，2和/或3。在某些實施例中，第一多肽是包含FZX)多肽(如FZD7多肽)的第一融合蛋白，所述FZD多肽與(i)轉錄因子的轉錄激活結構域或(ii)轉錄因子的DNA結合結構域融合；第二多肽是含有Wnt多肽(如Wnt3、8b或11多肽)的第二融合蛋白，所述Wnt多肽與(i)轉錄因子的轉錄激活結構域或(ii)轉錄因子的DNA結合結構域融合，其中FZD多肽與和Wnt多肽融合的結構域不同的結構域融合；並根據轉錄因子的重構(reconstitution)檢測第一和第二多肽的結合。通過本發明所述方法鑑定的抗癌劑(和/或候選抗癌劑)可以被用於治療癌症，例如肝癌。此外，通過本發明所述方法鑑定的抗癌劑(和/或候選抗癌劑)可以被用於製備用以治療癌症，例如肝癌的藥物。另一方面，本發明提供了確定細胞(如肝細胞)是否是癌細胞，或者有成為癌細胞的風險的方法。該方法包括(a)提供測試細胞(如肝細胞)；(b)確定與對照細胞相比，是否該細胞的FZD7和/或Wnt3表達水平較高，和/或FZD8和/或Wm11表達水平較4氐；和(c)如果與對照細胞相比，測試細胞的FZD7和/或Wnt3表達水平較高，和/或測試細胞的FZD8和/或Wnt11表達水平較低，則將測試細胞分類為(i)癌細胞或(ii)有成為癌細胞的風險。當該方法包括確定細胞的FZD7和/或Wnt3表達水平時，該方法可以進一步包括(c)確定測試細胞的FZD8和/或Wnt11表達水平是否低於對照細胞，其中更低的FZD8和/或Wnt11表達水平指示測試細胞是癌細胞，或者有成為癌細胞的風險。當該方法包括確定細胞的FZD8和/或Wnt11表達水平時，該方法可以進一步包括(c)確定測試細胞的FZD7和/或Wnt3表達水平是否高於對照細胞，其中較高的FZD7和/或Wnt3表達水平指示測試細胞是癌細胞，或者有成為癌細胞的風險。另一方面，本發明提供確定患者是否患有癌症或有患有癌症的風險，例如測試的組織樣本是否來自患有癌症或冇患有癌症的風險的患者的方法。該方法可以包括(a)提供從患者獲得的測試組織樣本(例如肝臟組織，如胂瘤的或肺瘤周圍的肝臟組織)，和(b)確定與AM建康個體中獲得的可與之比較的組織樣本相比，測試組織樣本中FZD7和/或Wnt3的表達水平是否4交高，和/或FZD8和/或Wnt11的表達水平是否較低，其中測試組織樣本中較高的FZD7和/或Wnt3表達水平和/或較低的FZD8和/或Wnt11表達水平指示樣本來自於患有癌症或有患有癌症的風險的患者。當該方法包括確定FZD7和/或Wnt3表達水平時，該方法可以進一步包括(c)確定測試組織樣本中FZD8和/或Wnt11表達水平是否低於從健康個體獲得的組織樣本，其中較低的FZD8和/或Wntll表達水平指示樣本來自患有癌症或有患有癌症的風險的患者。當該方法包括確定FZD8和/或Wnt11表達水平時，該方法可以進一步包括(c)確定測試組織樣本中'，ZD7和/或Wnt3表達水平是否高於從健康個體獲得的組織樣本，其中較高的FZD7和/或Wnt3表達水平指示患者患有癌症或有患有癌症的風險。在本發明所述的所有方法中，確定FZD7、FZD8、Wnt3或Wnt11的表達水平可以包括例如使用Northern印跡分析或RT-PCR分析確定細胞中FZD7、FZD8、Wnt3或WntllmRNA的量。在其它實施方式中，確定表達水平可以包括例如卩吏用抗Wnt抗體，如與SEQIDNO:7或80結合的抗體確定細胞中FZD7、FZD8、Wnt3或Wntl1蛋白的量。另一方面，本發明包括治療患者中癌症(如肝癌)的方法。該方法包括向患者施用有效量化合物，所述化合物降低患者表達FZD7的細胞中的Wnt/FZD7信號傳導，並且任選對表達FZD7的細胞不是致命的。在一個實施方式中，所述化合物是降低患者中h'ZD7和/或Wnt3表達和/或增加患者中Wntll表達的化合物。在另一個實施方式中，所述化合物是在患者中與Wnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7或FZD8結合的化合物。所述化合物可以是，例如反義寡核苷酸，包含在生理條件下與Wnt核苷酸序列雜交的核苷酸序列的雙鏈RNA(dsRNA),分離的FZD7受體或其Wnt3結合片段，編碼Wnt多肽(如Wntl1多肽)或FZD7的截短形式(如缺少FZD7的胞內和/或跨膜結構域的FZD7形式)的遺傳構建體，和/或抗FZD和/或抗Wnt抗體(如抗Wnt3抗4本)。所述化合物可以通過任何途徑施用，例如通過施用到患者肝臟。在某些實施方式中，所述化合物是與SEQIDNO:7或80結合的抗體。在另一實施方式中，所述化合物是含有SEQII)NO:81、82或83的siRNA。另一方面，本發明包括降低癌細胞(如肝癌細胞)移動性的方法。該方法包括施用給細胞有效量的能夠降低細胞中WntZFZD7信號傳導的化合物，所述化合物任選對細胞是不致命的。在一個實施方式中，所述化合物是降低患者中FZD7和/或Wnt3表達和/或增加患者中Wntll表達的化合物。在另一實施方式中，所述化合物是與患者中Wnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7或FZD8結合的化合物。所述化合物可以是，例如反義寡核普酸，包含在生理條件下與Wnt核苷酸序列雜交的核香酸序列的雙鏈RNA(dsRNA)，分離的FZD7受體或其Wnt3結合片段，編碼Wnt多肽(如Wntl1多肽)或FZD7的截短形式(如缺少FZD7的胞內和/或跨膜結構域的FZD7形式)的遺傳構建體，和/或抗FZD和/或抗Wnt抗體(如抗Wnt3抗體)。所述化合物可以通過4壬^T途徑施用，例如通過施用給患者肝臟。在某些實施方式中，所述化合物是與SRQIDNO:7或80結合的抗體。在另一實施方式中，所述化合物是含有SEQ1DNO:81、82或83的siRNA。另一方面，本發明包括降低表達FZD7的細胞中Wnt/FZD7信號傳導的化合物在製備(i)治療肝癌的藥物或(ii)降低肝癌細胞移動性的藥物中的用途。任選的，所述藥物對於表達FZD7的細胞是不致命的。在一個實施方式中，所述化合物是降低患者中FZD7和/或Wnt3表達和/或增加患者中Wntll表達的化合物。在另一實施方式中，所述化合物是與患者中Wnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7或FZD8結合的化合物。所述化合物可以是，例如反義寡核苷酸，包含在生理條件下與Wnt核苷酸序列雜交的核苷酸序列的雙鏈RNA(dsRNA)，分離的FZD7受體或其Wnt3結合片段，編碼Wnt多肽(如Wntl1多肽)或FZD7的截短形式(如缺少FZD7的胞內和/或跨膜結構域的FZD7形式)的遺傳構建體，和/或抗FZD和/或抗Wnt抗體(如抗Wnt3抗體)。一方面，本發明包括抗Wm抗體，例如抗Wnt3抗體，例如與SEQIDNO:7或胺基酸序列LRAKYSLFKPPTEKDL(SEQII)NO:80)結合的抗體。所述抗體可以包含在適於施用給患者的藥物組合物中。另一方面，本發明包括本文所述的任一化合物在製備用於治療或預防本文所述病症，例如癌症，例如肝癌的藥物組合物中的用途。所述組合物可以根據本文所述的方法用於治療癌症和/或降低癌細胞移動性的方法中。所述組合物可以是本文所述的任意形式，例如液體或固體組合物。在某些實施方式中，所述組合物是抗體，如抗Wnt抗體，如與SEQIDNO:7或胺基酸序列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQIDNO:80)結合的抗體。在另一實施方式中，所述化合物是siRNA,如含有核酸序列WNT3-1:5'-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3，(SEQII)NO:81)，額T3-2:5,-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3，(SEQIDN:82)，和/或WNT3-3:5，-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3，(SEQIDNO:83))的siRNA。本發明還包括本文所述的可用於檢測Wnt蛋白的核酸(如下表1中所述的引物)。除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語的含義都與本發的方法和材料，但是與本文所述的類似或等同的方法或材料也可以用於本發明的實踐或測試。所有本文提及的出版物、專利申請、專利和其它參考文獻都全文引入作為參考。如果發生沖突，以本說明書，包括定義為準。材料、方法和實施例僅是說明性的例證，不作為限制。本發明的其它特徵和優點將通過下面的詳細描述和權利要求顯示。圖1A是一組銀染的二維SDS-PAGE凝膠的照片，其顯示用肝素處理(Hep+)或不處理(Hep-)Huh7細月包後，Huh7細胞中分級的硫酸乙醯肝素蛋白聚糖的模式。來自肝素親合層析的0.25MNaCl級分被分離到第一維的pH3-10非線性IPG凝膠和第二維的4-12%梯度NuPAGE凝膠上。來自未用肝素處理的級分的蛋白斑點(畫圓圈；下文表示為"斑點1")顯示表達增加。圖1B是從斑點1獲得的胰蛋白酶肽的質傳圖。斑點1被切下，脫色，並用胰蛋白酶消化。在PBSII裝置上分析肽質量。標記的峰(*)代表符合人Wnt-11肽計算得到的質量的肽。圖1C是瓊脂糖凝膠照片，該凝膠顯示用RT-PCR在各種肝細胞癌細胞系中檢測Wnt配體mRNA。在所有HCC細胞系中#全測到Wnt-3mRNA,在3個HCC細胞系中檢測到Wnt-11mRNA而在Focus細胞中沒檢測到。通過RT-PCR沒檢測到其它WntmRNA。圖2A是顯示通過qRT-PCR在HCC細胞系中測定的Wnt3mRNA水平的條形圖。採用18SrRNA水平作為內對照，將Wnt3和WntllmRNA水平表示為每10918SrRNA的拷貝數。HCC細胞系中Wnt3mRNA的表達水平(平均值士SE)為每10918SrRNA在HepG2中370.0±10.3，在Hep3B中381.3±12.7，在Huh7中95.2土6.3，和210.4士9.5個拷貝。圖2B是條形圖，顯示通過qRT-PCR在HCC細胞系中測定的Wntl1mRNA水平。採用18SrRNA水平作為內對照，將Wntl1mRNA水平表示為每10918SrRNA的拷貝數。WntllmRNA表達水平為每10918SrRNA在HepG2中8,499.3±845,0，在Hep3B中290.9±40.1和在Huh7細胞中3.57±0.2個拷貝。通過qRT-PCR在Focus細胞中沒能檢測到Wnt11mRNA，這與常規RT-PCR的結果一致。圖3A是顯示人HCC組織中Wnt3mRNA表達的條形圖。mRNA水平通過qRT-PCR測定。白條表示正常肝臟組織中的mRNA水平。黑條表示HCC組織中的mRNA水平。灰條表示相應的腫瘤周圍組織的mRNA水平。實驗一式兩份進行，數據表示為平均值±SI)。77%的HCC和59%的腫瘤周圍組織顯示Wnt3mRN八表達水平高於正常肝臟組織的平均值±3SD。與相應的月中瘤周圍組織相比，71%的HCC組織Wnt3mRNA表達水平增高。圖3B是顯示人HCC組織中WntllmRNA表達的條形圖。該mRNA水平通過qRT-PCR測定。白條表示正常肝臟組織中的mRNA水平。黑條表示HCC組織中的mRNA水平。灰條表示相應的腫瘤周圍組織的mRNA水平。實驗一式兩份進行，數據表示為平均^1±SD。41%的HCC組織顯示表達水平甚至降低至低於正常肝臟組織的較低截止水平(cut-offlevel)，但是在腫瘤周圍組織中沒有一個顯示降低(Fischer精確檢驗的P二.0036)。65%的成對樣本還顯示腫瘤與相應的腫瘤周圍組織相比Wnt11mRNA表達減少。圖3C是顯示人HCC組織中FZD7mRNA表達的條形圖。該mRNA水平通過qRT-PCR測定。白條表示正常/汗髒組織中的mRNA水平。黑條表示HCC組織中的mRNA水平。灰條表示相應的腫瘤周圍組織的mRNA水平。實驗一式兩份進行，數據表示為平均值土SD。59%的HCC和腫瘤周圍組織與正常肝臟組織相比顯示FZD7mRNA表達增加。71%的成對樣本顯示腫瘤與相應的腫瘤周圍組織相比FZD7mRNA的表達增加(Wilcoxon符號秩檢驗的P=.031)。圖4A-4D是免疫組織化學染色的人HCC和腫瘤周圍組織的照片(放大倍數x400)。圖4A:陰性對照。圖4B:(3-聯蛋白染色的腫瘤周圍組織。肝細胞顯示典型的膜染色。圖4C:卩-聯蛋白染色的HCC組織，其顯示|3-聯蛋白的細胞核積聚。注意到核染色以及(3-聯蛋白的細胞質染色增強。圖4D:HCC組織，其不顯示卩-聯蛋白的細胞核或細胞質積聚。圖5A是Western印跡的複合圖，其顯示Wnt3質粒轉染對I-ICC細胞系中T-細胞因子(Tcf)轉錄活性的影響。用myc-標記的Wnt3質粒或pcDNA3.1/myc-HisA質粒，pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH,和卩-半乳糖苷酶質粒共轉染Focus、Huh7和Hep3B細胞。轉染後24小時，細胞血清飢餓24小時，然後用1%FBSMEM進行刺激。刺激後2小時和24小時收集細胞，進行Wnt3和(3-聯蛋白的螢光素酶分析和Western印跡分析。採用兔多克隆抗Wnt3抗體的Western印跡分析顯示轉染後Wnt蛋白增加。用單克隆抗myc抗體驗證多克隆抗Wnt3抗體的特異性。注意到Focus細月包中糹田胞的|3—聯蛋白水平增高。使用Hsp90蛋白作為內上樣對照。圖5B是顯示用Wnt3質粒轉染後HCC細胞系中Tcf轉錄活性改變的條形圖。轉染後Focus細胞中Tcf轉錄活性與用對照質粒轉染的Focus細胞相比增加了3倍。轉染後Tcf轉錄活性在Huh7細/l包中略微降低，在Hep3B細胞中沒有變化。白條表示用對照質粒(pcDN八)轉染的細胞，黑條表示用Wnt3質粒轉染的細胞。圖6A是顯示抗Wnt3抗體對HCC細胞系中Tcf轉錄活性的影響的條形圖。接種HCC細胞到12孔平板中，用pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH和P-半乳糖苷酶質粒轉染。細胞血清飢餓24小時，隨後用含有抗Wnt3抗體(Wnt3-Ab;黑條)或對照抗體(10嗎/ml)的1%FBSMEM培養糹田月包，孵育24小時後進行收集。使用正常的兔IgG作為對照抗體(C-Ab;白條)。用多克隆抗Wnt3抗體處理，Tcf的轉錄活性在Huh7中降低了60%，Hep3B中降低了26%，Focus細胞中降低了40%。圖6B是顯示siRNA對內源Wnt3mRNA表達的影響的條形圖。濃度為10或100nM的對照siRNA和Wnt3siRNA(WNT3-3)被轉染到HCC細胞中。轉染後48小時，收集細胞，使用qRT-PCR測定Wnt3mRNA的表達水平。siRNAWnt3-3在100nM濃度下在所有三個細胞系中導致mRNA水平平均降低了50-60%。圖6B代表了Hub7細胞中的這種效果。圖6C是顯示Wnt3siRNA對HCC細胞系Tcf轉錄活性的影響的條形圖。給定濃度(nM)的Wnt3sillNA或對照siRNA在存在Tcf報導基因的條件下進行共轉染。Tcf轉錄活性在Huh7中降低48.5%，在Hep3B中降低33%,在Focus糹田月包中降低43.5%。圖7是細胞培養的照片，顯示用抗Wnt3抗體處理的Focus細胞中傷口癒合延遲。將Focus細胞在6孔板中鋪板。用無菌的塑料200)li1微量移液管尖端損傷鋪滿的單層細胞。隨後用含有抗Wnt3Ab或兔IgG(對照抗體(CAb);10pg/ml)的培養基處理細胞，在不同的時間點拍照。用抗Wnt3Ab處理的Focus細胞顯示傷口癒合延遲。這一效果在24h時最明顯。在24h時，用CAb處理的細胞中大部分傷口被遷移的和/或增殖的細胞覆蓋，但在用抗Wnt3Ab處理的細胞中傷口繼續存在。圖8A-8E顯示了示例性FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8b和Wnt11人和小鼠胺基酸序列，包括推定的結合基序。發明詳述本發明至少部分基於下述發現，即特定的Frizzled(FZD)蛋白，如FZD7和8與某些癌症，如肝癌相關，以及Wnt3,8b和11是Frizzled7的配體。因此，本說明書除其他內容之外提供使用Wnt和FZD蛋白、基因、FZD特異性抗體和探針診斷和治療癌症以及篩選測試化合物治療癌症的能力的方法。還公開了用於治療癌症，如肝癌的化合物。I.核酸、蛋白、載體和宿主細胞術語"Frizzled"、"FZD"、"Frizzled蛋白"和"Frizzled受體"表示與果蠅Frizzled基因相關的哺乳動物蛋白家族，其在組織極性的發生中起作用。Frizzled家族含有至少10個哺乳動物基因。示例性的人Frizzled受體包括Frizzled1、Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled6、Frizzled7、Frizzled8、Frizzled9和Frizzled10。Frizzled受體涉及跨膜信號轉導的動態模型，類似於具有氨基末端配體結合結構域的G-蛋白偶聯的受體。術語"Wnt蛋白"、"Wnt配體"和"Wnt"表示與果蠅體節極性基因wingless相關的哺乳動物蛋白家族。在人類中，Wnt家族的基因通常編碼38到43kDa的富含半胱氨酸的糖蛋白，其具有疏水信號序列和保守的天冬醯胺連接的低聚糖共有序列(參見例如Shimizu等，CellGrowthDiffer8:1349-1358(1997))。Wnt家族含有至少19個哺乳動物成員。示例性的Wnt蛋白包括Wnt-1、Wnt-2、Wnt-2b(也稱為Wnt-13)、Wnt-3、Wnt-3A、Wnt-4、Wnt匿5A、Wnt陽5B、Wnt-6、Wnt-7A、Wnt-7B、Wnt-8A、Wnt-8B、Wnt-10A、Wnt-10B、Wm-ll、Wnt14、Wnt15和Wnt16。除Wnt配體外，已經分離了分泌的Frizzled相關蛋白(sFRP)的家族。sFRP似乎通過與i爭膜Frizzled受體竟爭與分泌的Wnt配體的結合作為Wnt信號傳導的可溶性內源調製子發揮功能。sl.'RP可以通過結合蛋白並阻斷與其細胞表面信號傳導受體接近而對抗wm功能，或者它們也能夠通過促進配體向Frizzled受體的遞呈增強Wnt功能。術語"Wnt/FZD信號傳導途徑"表示由Frizzled受體，如FZI)7與一個或多個它的配體，如Wnt蛋白，如Wnt3、8b或ll之間的相互作用啟動的胞內信號轉導途徑。通常，Wnt/FZD相互作用包括Wnt蛋白，如Wnt3、8b或11與Frizzled受體，如FZD7的結合，其導致信號轉導途徑的激活。在一些情況中，Wnt/Frizzled信號傳導途徑的激活導致下遊Wnt和/或FZD可誘導基因的誘導作用。"下遊Wnt/FZD調控的基因產物"是由於Wnt/FZD信號傳導途徑的信號傳導的結果而被調控(如上調或下調)的蛋白或RNA。本發明包括某些FZD和Wnt核酸的用途。例如，本發明包括某些FZD7和8核酸的用途，例如編碼圖8A到8E所列的示例性人和小鼠FZD7(分別為SEQIDNO:1和3)和8(分別為SEQII)NO:4和6)受體的核酸。作為另一個實例，本發明包括某些Wnt3、8b和ll核酸的用途，例如編碼圖8A到8E所列的示例性人和小鼠Wnt3(分別為SEQIDNO:7和13)、8b(分別為SEQIDNO:14和20)和11(分別為SEQIDNO:21和27)蛋白的核酸。本發明中還包括某些FZD和Wnt核酸片段的用途，例如編碼SEQIDNO:l、3、4、6、7、13、14、20、21或27的核酸序列的片#殳。FZD或Wnt核酸的片段分別編碼FZD或Wnt多肽(如人或齧齒動物多肽)的至少一個有用片段，例如結合結構域(如CRD結構域)或其它有用的片段。例如，FZD核酸的有用片段可以編碼具有結合活性的FZD受體片段，如對應於SEQIDN:3或5的片段。作為另一個實例，Wnt核酸的有用片段可以編碼具冇結合活性的Wnl多肽片段，如對應於SEQIDNO:8到12、15到19和22到26的任何一個或多個的片段。本文所述的FZD和Wnt核酸包括RNA和DNA，其包括基因組DNA和合成(如化學合成的)DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈的。單鏈時，核酸可以是有義鏈或反義鏈。可以使用寡核苷酸類似物或衍生物(如肌苦或硫代磷酸核苷酸)合成核酸。例如可以使用該寡核苷酸製備具有改變的鹼基配對能力或增強的核酸酶抗性的核酸。"分離的核酸"是結構不同於任何天然存在的核酸的結構或任何跨越超過三個分開的基因的結構的核酸。術語因此包括，例如(a)具有天然存在的基因組DNA分子的部分序列，但其側面不是其天然所存在的生物基因組中該分子的部分的兩側的編碼序列的DNA;(b)以^吏其載體或者原核生物或真核生物基因組I)NA中的核酸；(c)分開的分子，例如cDNA、基因組片段、通過聚合酶鏈式反應(PCR)產生的片段，或限制性酶切片段；和(d)重組核苷酸序列，其為雜合體基因，即編碼融合蛋白的基因的一部分。該定義明確排除了存在於(i)DNA分子，(ii)轉染細胞；和(iii)細胞克隆的混合物中的核酸，例如存在於DNA庫，如cDNA或基因組DNA庫中的核酸。在一些實施方式中，本發明包括與FZD或Wnt核酸基本上同源的核酸序列的用途。與FZD或Wnt核酸"基本上同源"的核酸序列與編碼SEQIDNO:1到27的任一序列的FZD或Wnt核酸序列有至少75%同源。例如，基本同源的核酸序列可與編碼SEQIDNO:1到27任一的序列有至少約80%、85%、90%、95%、98%或至少約99%同源。為進行核酸比較，參照核酸序列的長度至少為50個核苷酸，但是也可以更長，例如至少60個核苷酸或更多核苷酸。本文中，使用在Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA90:5873-5877中？文進的Karlin和Altschul(19卯)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA87:2264-2268所示的算法確定兩胺基酸序列或兩核酸序列的"百分比同源性，，。該算法被引入Altschul,等(1990);J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。通過NBLAST程序，設定分值(score)=100，字長(wordlength)=12進行BLAST核苷酸;險索以獲得與本發明所使用的FZD或Wnt核酸分子同源的核苷酸序列。通過XBLAST程序，設定分值(score)=50，字長(wordlength)=3進行BLAST蛋白檢索以獲得與參照多肽同源的胺基酸序列。為獲4尋可—進4亍比專交的缺口比對(gappedalignments)，j吏用Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402中所述的GappedBLAST。當使用BLAST和GappedBLAST程序時，使用各程序(如XBLAST和NBLAST的預設參數。參見網際網路網址ncbi.nlm.nih.gov。本發明還包括在嚴格的雜交條件(如本文所定義的)下與完整的或一部分的編碼SEQIDNO:1到27中任一的核苷酸序列，或者該核酸序列的補體雜交的核酸的用途。雜交的核酸的雜交部分長度通常至少為15(例如20、25、30或50)個核苷酸。雜交的核酸的雜交部分與一部分或完整的編碼FZD或Wnt多肽的核酸序列，或與其補體有至少約75%(例如，至少80%、90%、95%或980/。)的同一性。本文所述類型的雜交核酸可以被用作諸如克隆探針、引物(如PCR引物)或診斷探針。寡核苦酸探針與核酸樣本的雜交典型地在嚴格條件下進行。核酸雙鏈或雜交體的穩定性被表示為解鏈溫度或Tm，其為探針從靶DNA上解離的溫度。使用該解鏈溫度定義所需的嚴格條件。如果要被鑑定的序列其與探針相關並基本上相同，但不完全相同，可利用它首先建立最低溫度，在該溫度以及特定的鹽(如SSC或SSPE)濃度下只發生同源雜交。然後，假定r/。的錯配導致Tm降低rc，相應降低雜交反應中最終洗滌的溫度(例如，如果搜尋與探針具有>95%同一性的序列，降低最終洗滌溫度5。C)。實踐中，每T/。錯配Tm的變化可以在0.5。C到1.5。C之間。嚴格條件包括在68°C，5xSSC/5xDenhardt溶液/1.0%SDS中雜交，在室溫，0.2xSSC/0.1°/。SDS中洗滌。中等嚴格條件包括在42。C,3xSSC中洗滌。改變鹽濃度和溫度的參數以獲得探針和靶核酸之間最優水平的同一性。其它關於該條件的指導是本領域容易得到的，例如可參見Sambrook等,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;和Ausubel等.(eds.)，1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)第2.10與編碼SEQIDNO:1到27中任一的核苦酸序列雜交的核酸一皮認為是"反義寡核苷酸"。本發明還包括含有本文所述FZD和/或Wnt核酸的遺傳構建體(如載體和質粒)，其可操作的連接於轉錄和/或翻譯序列以允許表達，如表達載體。所選核酸，如編碼FZD或Wnt多肽的DNA分子，當其以使得其它分子能夠指導所選核酸的轉錄和/或翻譯的方式被放置時，"可操作的連接於"另一核酸分子，如啟動子。例如，可將所選核酸置於與其它核酸分子相鄰的位置。本發明還包括含有本文所述FZD和/或Wnt核酸的工程細胞。例如，本發明包括轉化的宿主細胞，即其中(或其祖先中)通過重組DNA技術導入編碼FZD和/或Wnt多肽的核酸的細胞。包括原核和真核細胞，如哺乳動物細胞(如肝細胞)、真菌和細菌(如大腸桿菌)等。本發明中所包括的示例性類型的工程細胞示例是過量表達1;ZD7轉基因的肝細胞。"過量表達FZD"的細胞是癌細胞和/或轉基因細胞，其中特定FZD蛋白，如FZD7和/或8的表達分別是來自同樣組織類型的非癌細胞或非轉基因細胞中表達水平的至少約1.5倍，如至少約2、3、4或5倍。在一些實施方式中，細胞中FZD的表達可以與不同組織類型的非癌或非轉基因細胞中的表達或不同組織類型的一組非癌或非轉基因細胞進行比4交。此外，一種類型的FZD蛋白(如FZD7)的表達可以與同樣細胞中其它FZD蛋白進行比較。確定特定基因表達水平的方法是本領部分。域公知的。這些方法包括，但不限於，RT-PCR、實時PCR和使用針對基因產物的抗體。本發明還包括某些FZD和Wnt多肽的用途。本發明中所使用的FZD多肽的實例是人和小鼠FZD多肽，例如分別如SEQIDNO:1和3，以及分別如SEQIDNO:4和6所示的多肽。本發明中所使用的Wnt多肽的實例是人和小鼠Wnt3、8b和11多肽，例如SEQIDNO:7、13、14、20、21和27中所示的多肽。本發明中所使用的還包括FZD和Wnt多肽的某些片段，例如SEQlDNO:l、3、4、6、7、13、14、20、21和27的片段。FZD和Wnt多肽的片段可以包括至少一個結合結構，或全長FZD和Wnt多肽的其它有用部分。例如，FZD和Wnl多肽的有用片段包括，但不限於，具有結合活性的片段(例如SHQIDNO:2、5、8至12、15至19和22至26)。術語"蛋白"和"多肽"都表示任何胺基酸鏈，不管其長度或翻譯後的修飾(如糖基化或磷酸化)。因而，術語"Frizzled蛋白"、"Wnt蛋白"、"Frizzled多肽"和"Wnt多肽，，包括天然存在的全長分離蛋白，以及重組或合成產生的多肽，其對應於天然存在的全長蛋白，或者天然存在的或合成的全長多肽的片段。如上所述，術語"Frizzled多肽"和"Wnt多肽，，分別包括天然存在的或合成的FZD和Wnt多肽的生物學活性片段。蛋白的片段可以通過各種本領域技術人員已知的方法製備，例如重組、通過蛋白水解消化、或通過化學合成。多肽的內部或末端片段可以通過從編碼所述多肽的核酸的一端(對於製備末端片段而言)或兩端(對於製備內部片段而言)移除一個或多個核苷酸產生。該誘變的DNA的表達可以產生多肽片段。用"末端輕咬(end-nibbling)，，核酸內切酶進行消化可以產生編碼一批片段的DNA。編碼蛋白片段的DNA也可以通過例如隨機剪切(randomshearing)、限制性消化、寡核苷酸的化學合成、使用聚合酶領域已知的技術，例如常規的Merrifield固相FMOC或t-Boc化學法化學合成。純化或分離的化合物是組合物，其中至少60%的重量為目標化合物，如FZD多肽、Wnt多肽或抗體。例如，所述製品可以至少75%(如至少卯％、95%或甚至99%)的重量為目的化合物。純度可以通過任何本領域已知的合適方法進^亍測定，例如柱層析、聚丙烯醯胺;疑月交電泳或HPLC分析。在某些實施方式中，FZD和Wnt多肽包括與天然存在的FZD和Wnt多肽的整個或部分基本上相同的序列。與本文所述的FZD和Wnt多肽序列"基本上同源"的多肽具有與SEQIDNO:1至27任一所示胺基酸序列至少65%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，例如100%)同源的胺基酸序列(度量方法如本文所述)。為進行比較，參照FZD和Wnt多肽序列的長度可以為至少16個胺基酸，例如至少20或25個胺基酸。"保守的胺基酸取代"是指其中胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基替換。具有類似側鏈的胺基酸殘基的家族在本領域中已有定義。這些家族包括具有鹼性側鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(如天門冬胺酸、穀氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(如甘氬酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性倒鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、P分枝的側鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。本發明還包括融合蛋白(和編碼該融合蛋白的核酸)的用途，其中FZD(如FZD7和/或8)或Wnt(如Wnt3、8b和/或11)多肽的一部分與不相關的多肽(如標記物多肽或融合配偶體)融合以產生融合蛋白。例如，所述多肽可以與六組氨酸標籤或FLAG標籤融合以便於純化細菌表達的多肽，或者與血凝素標籤或FLAG標籤融合以便於純化真核細胞中表達的多肽。本發明還包括諸如包含第一部分和第二部分的分離的多肽(和編碼這些多肽的核酸)的用途，其中第一部分包括例如FZD或Wnt多肽，第二部分包括不相關的多肽，如免疫球蛋白恆定(Fc)區或者可檢測的標記物。融合伴侶可以是，例如利於分泌的多肽，如分泌序列。這樣的融合多肽典型地被稱為前蛋白(preprotein)。宿主細胞可以切開分泌序列以形成成熟的蛋白。本發明還包括編碼與多肽序列融合以產生無活性前蛋白的FZD和/或Wnt多肽。通過移除起失活作用的序列可以將前蛋白轉變為蛋白的活性形式。II.4全測癌症的方法不被理論所局限，似乎各種FZD蛋白，如FZD7和8以及FZI)配體，如Wnt3和ll在癌症，如肝癌中是重要的。特別的，肝細胞似乎在轉化過程的早期，如HCC發生之前過量表達FZD7和Wnt3。類似的，這樣的細胞通常FZD8和/或Wnt11表達不足。Wnt3、8b和11似乎是FZ[〕7配體。因此，本發明提供了^^測癌細胞的方法，其有助於診斷患者中癌症的存在和嚴重程度(如肺瘤分級，胂瘤負荷等)，有助於確定患者的預後和評估患者對治療的反應(例如在化療方案期間或之後通過例如評估腫瘤負荷提供對治療效果的度量)。檢測可以基於對在癌細胞中差異表達(如與非癌細胞相比)的多核苷酸(如FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wnt11多核苷酸)的檢測和/或對由在癌細胞中差異表達的多核普酸編碼的多肽(如FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wnt11多肽)的檢測。本發明的糹企測方法可以在體外或體內、在生物學樣本，如分離的細胞和/或整個組織上進行。本文所採用的"生物學樣本，，是生物學組織或液體樣本，其含有核酸或多肽，如FZD7蛋白、多核苷酸或轉錄本。這樣的樣本包括，但不限於，從例如肝臟、肺、淋巴結、結腸、肖、胰腺、膽管、小腸和/或食道獲得的組織。生物學樣本還可以包括組織切片，例如活組織檢查或屍檢樣本、為組織學目的而獲得的冰凍切片、血液、血漿、血清、唾液、糞便、眼淚、粘液、膽汁、唾液、淋巴液、毛髮、皮膚等。生物學樣本還包括源自患者組織的外植體和原發的和/或轉化的細胞培養物。生物學樣本典型地從真核生物，例如靈長類動物，如黑猩猩或人；母牛；馬；山羊；綿羊；狗；貓；嚙齒類動物，如豚鼠，大鼠或小鼠；兔；鳥；爬形動物或魚中獲得。樣本通常通過從動物中移出細胞樣本獲得，但也可以通過提供以前分離的細胞(例如由他人在其它時間和/或為其它目的所分離的)，或通過在體內進行本發明的方法來完成。還可以使用具有治療或結果歷史記錄的存檔組織。在一些實施方式中，提供通過測定細胞中轉錄本(如FZD7、8、Wnt3和/或Wnt11轉錄本)的表達4全測癌細/1包的方法，該轉錄本在癌細月包中差異表達(differentiallyexpressed)。多種已知的方法中的任一可用於通過mRNA與合適的雜交探針的雜交進行檢測，其包括但不限於，檢測轉錄本；通過使用特異的寡核苷酸引物的聚合酶鏈式反應檢測轉錄本；以及使用合適的雜交探針的原位雜交。這些方法可用於檢測和/或測量在癌細胞中差異表達的基因的mRNA水平。在一些實施方式中，該方法包括a)在允許雜交的條件下，將樣本與對應於本文所述差異表達基因的多核苷酸接觸；和b)若有的話，檢測雜交。當與合適的對照相比時，檢測到不同的雜交，指示樣本中存在在癌細胞中差異表達的多核苷酸。合適的對照包括，例如不是癌細胞的樣本，已知不包含在癌細胞中差異表達的多核苷酸的樣本，以及與在癌細胞中差異表達的多核苷酸同"義，，(thesame"sense")的標記的多核苷酸的用途。允許雜交的條件是本領域已知的，並且已經在上文中進行了更詳細的描述。檢測也可以通過任何已知的方法完成，其包括但不限於，原位雜交、PCR(聚合酶鏈式反應)和/或RT-PCR(反轉錄-PCR)或已知技術的結合。本領域已知多種用於多核苷酸的標記和標記方法，其可以用於本發明的分析方法。雜交的特異性可以通過與合適對照的比較確定。通常含有本文所述多核苷酸的至少IO個核苷酸，至少12個核苷酸或至少15個連續核苷酸的多核苷酸，諸如具有本文所述序列的那些多核苷酸，可用於多種用途，例如用於^^測和/或測量在癌細胞中差異表達的多核苷酸的轉錄水平的探針或PCR引物。如本領域技術人員所了解的，探針可以被可檢測地標記，並與例如含有固定的從測試樣本獲得的多核苷酸(如mRNA)的陣列(array)接觸。可選的，所述探針可以固定在陣列上，所述測試樣本被可4全測的標記。本發明方法的這些和其它變體的用途在本領域的技術範圍內，並且在本發明的範圍中。核普酸探針可用於檢測對應於所提供的多核苷酸的基因的表達。在Northern印跡中，mRNA被電泳分離並與探針接觸。作為與特定大小的mRNA類型的雜交檢測探針。定量雜交的數量以確定相關的表達量。探針可用於與細胞原位雜交以檢測表達。探針也可以用於在體內診斷性檢測雜交序列。探針可以用放射性同位素或其它類型的可檢測標記來標記，如生色團、螢光團和/或酶。核酸雜交分析的其它例子記載於WO92/02526和U.S.Pat.No.5,124,246中。PCR是另一種用於檢測少量靶核酸的方式(參見，例如Mullis等,Meth.Enzymol.(1987)155:335;U.S.Pat.No.4,683,195;和U.S.Pat.No.4,683,202)。使用與靶核酸雜交的兩條引物寡核芬酸開始反應。引物由本文所述多核苷酸內的序列或其3，和5'序列組成。通過標準PCR方法擴增靶序列後，擴增的靶核酸可以通過本領域已知的方法進行檢測，例i口Southern印-跡。mRNA或cDNA也可以-通itSambrook等，"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(NewYork,ColdSpringHarborLaboratory,1989)中所述的4專統印-跡#支術(^口Southern印跡、Northern印跡等)進行檢觀'j(例如不通過PCR擴增)。通常，mRNA或使用聚合酶從mRNA產生的cDNA可以使用凝膠電泳進行純化和分離，並轉移到固相支持體，如硝化纖維上。可將固體支持物暴露於標記的探針，並洗滌以除去任何未雜交的探針。隨後可檢測含有標記探針的雙鏈體。使用PCR擴增的方法可在來自一個或多個細胞的DNA上進行。聚合酶鏈式反應的使用記載於Saiki等(1985)Science239:487中，技術綜述可以見於Sambrook等,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(NewYork,ColdSpringHarborLaboratory,1989;pp.l4.2-14.33)中。擴增反應中可以包括可檢測的標記。合適的可檢測標記包括螢光染料(例如螢光素異硫氰酸鹽(FITC)、若丹明、德克薩斯紅、藻紅蛋白、異藻青蛋白、6-羧基螢光素(6-FAM)、2',7'-二甲氧基-4'，5'-二氯-6-羧基螢光素、6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基-2',4,4'，5'，7,7'-六氯螢光素(HEX)、5-羧基螢光素(5-FAM)或N,N，N'，N'-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA))、放射性標記(如"P、35S、31-1等)等。標記可以是兩段系統(twostagesystem),其中多核苷酸與生物素、半抗原等結合，所述生物素、半抗原等具有高親和力結合配偶體，如抗生物素蛋白、特異抗體等，其中結合配偶體與可檢測的標記結合。所述標記可以與一個或全部兩個引物結合。可選的，標記擴增中所使用的核苷酸庫，從而將標記摻入到擴增產物中。在一個實施方式中，使用實時PCR評估表達水平。從目的樣本中分離RNA。設計PCR引物以擴增特定目的基因。使用雙標記的交光寡核苷酸探針測量PCR產物累積。探針用兩種不同的螢光染料標記，5'端報導分子染料和3'端猝滅染料。選擇與PCR擴增子中存在的內靶序列同源的寡核苷酸探針。當探針完整時，兩種螢光團之間發生能量轉移，螢光發射被猝滅。在PCR的延伸階段期間，探針被Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割。因此，報導分子不再接近捽滅分子，並測量發射強度的增加。下述實施例部分提供了使用實時PCR檢測FZD表達的示例性方法。引物也可以用於其它方法，例如RT-PCR。這個分析提供了核酸的定量度量。在其它實施方式中，提供了通過檢測被細胞差異表達的蛋白(如FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wnt1蛋白)的表達檢測癌細胞的方法。多種已知方法都可用於檢測，其包括但不限於使用例如在BL1SA和/或Western印跡方法中有用的結合化合物，如抗體或其抗原結合片段的方法。該抗體可以是多克隆或單克隆，並且可以用可檢測標記物(如螢光團、發色團或同位素等)標記。在合適時，化合物可以附著於固相支持物，例如珠子、平板、濾紙、樹脂等。確定化合物/靶複合物的形成可通過將所述複合物與和第一化合物(或複合物)特異性結合的另一化合物(如第二抗體)接觸而進行。類似於第一化合物，另一化合物可以附著於固相支持物和/或能夠用可檢測標記物標記。進行本文所述檢測方法所需的材料可以作為試劑盒的一部分提供。因此，本發明進一步提供用於檢測生物學樣本中在癌細胞中差異表達的多核苷酸(例如通過檢測由差異表達的目的基因編碼的mRNA)和/或其編碼的多肽的存在和/或水平的試劑盒。使用這些試劑盒的程序可以由檢驗科、實驗室、開業醫生或私人個體進行。本發明用於檢測由在癌細胞中差異表達的多核普酸編碼的多肽的試劑盒可以包含與所述多肽特異性結合的部分，例如抗體。本發明用於檢測在癌細胞中差異表達的多核苷酸的試劑盒可以包括與該多核苦酸特異性雜交的部分。試劑盒任選提供在程序中有用的附加組分，包括例如緩沖液、顯影試劑、標記、反應表面、檢測手段、對照樣本、標準、說明書和解釋性信息。本發明進一步涉及^^測/診斷哺乳動物(例如人)中腫瘤或前腫瘤病症的方法。本文中所使用的"診斷"通常包括確定患者的疾病或紊亂易感性、確定受試者目前是否為疾病或紊亂所侵襲，受疾病或紊亂侵襲的受試者的預後(例如鑑定轉移前或轉移癌狀態，癌症的階段，或癌症對治療的反應性)和治療度量(therametrics)(例如監測受試者的狀況以提供關於治療效果或功效的信息)。一個示例性檢測/診斷方法包括(a)從哺乳動物(例如人)獲得生物學樣本(例如肝臟組織)，(b)一全測樣本中FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wntll基因產物(如蛋白或mRNA)的存在，和(c)與對照樣本比4交存在的FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wnt11基因產物的量。依照這個方法，在樣本中存在增高水平的1'7D7和/或Wnt3基因產物和/或降低水平的I'7D8和/或Wntl1基因產物指示受試者患有腫瘤或前腫瘤病症，例如肝癌或發生肝癌的風險。依照本發明確定FZD7和/或Wnt3蛋白水平的增高和/或FZD8和/或Wnt11蛋白水平的降低使得能夠鑑定可能從特定治療中獲益的患者。例如，篩選來自原發治療後(postprimarytherapy)的受試者(例如已進行手術的受試者)的樣本FZD7和/或Wnt3水平增高和Z或FZD8和/或Wnt11蛋白水平降低的存在，該水平是殘餘腫瘤組織的標誌。類似的，檢測(例如通過免疫螢光)手術移除的腫瘤切除位置周圍的組織(例如腫瘤周圍組織)，FZD7和/或Wnt3水平增高和/或FZD8和/或Wnt11水平降低(相對於周圍組織)表示該組織中可能發生疾病或腫瘤切除的不完全。鑑定這種患者的能力使得根據特定患者的需要調整治療成為可能。也可以監測進行非手術治療，如化療或放療的受試者，從這些受試者中獲得的樣本中FZD7和/或Wnt3水平增高和/或FZD8和/或Wnt11水平降低指示需要繼續治療。熟練技術人員還能夠理解，使用本文所述的方法可以進行以優化治療方案為目的的癌症(例如肝癌)分級。III.鑑定能夠治療癌症的化合物的方法
技術領域：
：本發明提供篩選測試化合物治療癌症，如肝癌的能力的方法。本文所述的"測試化合物"是能夠用本文所述方法篩選的任何化合物。例如，測試化合物可以是，例如小有機或無機分子(M.W.少於1，000Da)。可選的或另外的，測試化合物可以是多肽(如具有隨機或預定胺基酸序列的多肽或者天然存在的或合成的多肽)或核酸，例如DNA或RNA分子。測試化合物可以是天然存在的(例如草本或天然產物)或合成的，或者能夠同時包括天然的和合成的組分。測試化合物可以具有少於每摩爾約10，000克，少於每摩爾5,OO克，少於每摩爾1，000克或少於每摩爾約500克的分子式量。測試化合物可以是，例如任何有機或無機化合物(例如雜有機或有機金屬化合物)、胺基酸、胺基酸類似物、多肽、肽模擬物(如擬肽)、寡肽(例如，長度從約5個到約25個胺基酸，優選長度從約10到20或12到18個胺基酸，優選12、15或18個胺基酸長)、核苷酸、核苷酸類似物、多核苷酸、多核苷酸類似物、核糖核酸、脫氧核糖核酸、反義寡核普酸、核酶、糖、脂類(如神經鞘脂類)和/或脂肪酸或其任何組合。術語Wnt/FZD信號傳導(如Wnt/FZD7信號傳導)的"拮抗劑"或"抑制劑"表示，例如與Wnt蛋白(如Wnt3、8和/或11)和/或FZI)受體(如I'，ZD7)結合，和/或如已知的Wnt/1'，ZD信號傳導分析(例如測定卩-聯蛋白水平，由Tcf和Lef轉錄因子或其它下遊Wnt/Frizzled調控的基因產物控制的癌基因表達)所測定的部分或完全阻斷或抑制Wnt/FZD信號傳導(如Wnt/FZD7信號傳導)的化合物。抑制劑包括，例如Wnt或FZD蛋白的抗體(下述實施例部分描述了抗Wnt3抗體的一個實例)、Wnt或FZD蛋白的修飾形式、天然存在和合成的配體、拮抗劑、激動劑、抗體、小化學分子等。下文中詳述了檢測抑制劑或拮抗劑的分析。測試化合物文庫在某些實施方式中，本發明的篩選使用測試化合物文庫。"文庫"是通過一個或多個起始組分的各種組合合成的化合物的集合(例如，以混合物或以物理分隔的個體化合物的形式)。至少一些化合物必須不同於文庫中至少其它一些4匕合物。文庫可以包"^舌，例如5、10、50、100、1000或甚至10,000、50,000、或100,000個或更多的不同的化合物(即，不是同一化合物的簡單多重拷貝，雖然文庫中的一些化合物可以重複或出現超過一次)。每種不同的化合物可以一定的數量存在，從而使得它的存在能夠通過一些方式進行確定，例如能夠用受體或合適的探針進行分離、分析和/或檢測。使每種不同的化合物的存在能夠被檢測所需的實際數量由於所使用的實際程序而不同，並可以隨分離、檢測和分析技術的進展而改變。當化合物以基本上等摩爾量存在於混合物中時，例如每種化合物100皮摩爾的量通常可以被檢測到。文庫可以包括個體化合物的文庫(例如，基本上以每孔單一類型化合物的方式存在，其通過平行合成或者poolandsplit-pool方法製備)和含有基本上等摩爾量的每種預期化合物(即其中沒有單個化合物佔優勢)的混合物。每種庫形式都能夠鑑定分析中發現的活性化合物。測試化合物可以分別單獨篩選或平行篩選。並行篩選的實例是大型化學品文庫的高通量藥物篩選。該候選化合物的文庫可以產生或購買自例如ChembridgeCorp.,SanDiego,CA。可選的，在先試驗和無對照證據可以暗示一種類型或類別的具有增高的潛能的化合物。可以設計和合成文庫以含有該類化學品。組合文庫的合成是本領域公知的，並且已經進行了綜述(例如參見E.M.Gordon等，J.Med.Chem.(〗994)37:1385-1401;DeWitt，S.H.;Czamik,A.W.Acc.Chem.Res.(1996)29:114;Armstrong,R.W.;Combs,A.P.;Tempest,P.A.;Brown,S.D.;Keating,T.A.Acc.Chem.Res.(1996)29:123;Ellman,J.A.Acc.Chem.Res.(996)29:132;Gordon,RM.;Gallop,M.A.;Patel,D.V.Acc.Chem.Res.(1996)29:144;Lowe,G.Chem.Soc.Rev.(1995)309,Blondelle等TrendsAnal.Chem.(]995)14:83;Chen等.J.Am.Chem.Soc.(1994)116:2661;美國專利5,359,115，5,362,899和5,288,514;PCT出版物NO.WO92/10092,WO93/09668,WO91/07087,WO93/20242,WO94/08051)。化合物的文庫可以根據多種方法製備，其中一些是本領域已知的。例如，可以以下述途徑實施"split-pool"策略將功能化聚合支持物的珠子置於多個反應容器中；已知多種適於固相肽合成的聚合支持物，有些可以通過商業途徑購得(例如參見，如M.Bodansky"PrinciplesofPeptideSynthesis",2ndedition,Springer-Verlag,Berlin(1993))。向每個等分試樣的珠子中加入不同的激活胺基酸溶液，進行反應以產生多個固定的胺基酸，每個反應容器中一種。隨後洗滌衍生的珠子的等分試樣，"集中(pooled)"(即重組)，再次分開珠子的集合體(pool),將每個等分試樣置於分開的反應容器中。隨後將另一激活的胺基酸加入到每個珠子等分試樣中。重複合成循環，直到獲得預期的肽長度。可以隨機選擇每個合成循環中加入的胺基酸殘基；可選的，可以選擇胺基酸以提供"偏好的(biased)"文庫，例如，文庫中一定部分的抑制劑是非隨機選擇的，例如提供具有與能夠與抗體，例如抗獨特型抗體抗原結合位點相互作用的已知肽具有已知結構類似性或同源性的抑制劑。應當明白通過這種方法可以容易的產生多種肽的、肽模擬物的或非肽化合物。"split-pool"策略可以產生肽，如調製子的庫，其能夠用於製備本發明測試化合物的文庫。在另一說明性合成中，通過1IobbsDeWitt等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909(1993))的方法創建"diversomer文庫"。其它合成方法，包括Houghten的"茶葉袋(tea-bag)"技術(參見例如Houghten等，Nature354:84-86(1991))也可以用於合成本主題發明的化合物文庫。可以篩選化合物的文庫以確定是否文庫中任何成員都具有所需活性，並且假如是這樣的話，鑑定活性種類。篩選組合文庫的方法已有記載(參見例如，Gordon等，JMed.Chem.,同上)。通過採用合適受體的親合層析篩選可溶化合物文庫以分離受體的配體，隨後通過常規技術(例如質譜、NMR等)鑑定分離的配體。固定的化合物可以通過將化合物與可溶性受體接觸進行篩選，優選的，可溶性受體與可被檢測以指示配體結合的標記(例如，焚光團、比色酶(colorimetricenzymes)、放射性同位素、發光化合物等)結合。可選的，固定的化合物可以被選擇性地釋放，並且可以經由膜擴散以和受體相互作用。上面描述了用於篩選測試化合物文庫的示例性分析。篩選方法
技術領域：
：本發明提供鑑定能夠治療癌症，如肝癌的化合物的方法。雖然申化合物被認為特異性的調製(1)Wnt/FZD信號傳導(例如，通過結合FZD7、Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11多肽和/或減低(如防止)Wnt/FZD介導的轉錄)和/或(2)FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wntl1的表達。在本發明的某些方面，通過(i)從測試化合物組中鑑定與1'7X)7、Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11多肽結合，調製(即增加或降低)FZD7及其配體(如Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11)間相互作用和/或調製(即增加或降低)FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8b和Z或Wnt11的轉錄和/或翻譯的化合物；和可選的，(U)進一步測試這種化合物調製Wnt/FZD信號傳導、降低癌細胞移動性、降低癌細胞中聯蛋白積聚和/或在體外或體內治療癌症的能力完成這種化合物的篩選。結合FZD7、Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11多肽，調製FZD7及其配體(如Wm3、Wnt8b和/或Wnt11)之間的相互作用，或調製FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8b和/或Wntll的轉錄和/或翻譯的測試化合物在本文中表示為"候選抗癌劑"。被進一步檢測和發現能夠在體外或體內調製Wnt/FZD信號傳導，降低癌細胞移動性，降低癌細胞中卩-聯蛋白積聚和/或治療癌症的候選抗癌劑被認為是"抗癌劑"。在本發明的篩選方法中，候選抗癌劑可以，但不是必需被測試以確定它們是否是抗癌劑。本發明的分析可以在生物學樣本，完整細胞的製品和/或先體外後體內的無細胞系統中進行。在一方面，本發明包括篩選測試化合物以鑑定與FZD多肽，如FZD7多肽，和/或Wnt多肽，如Wnt3、8b和/或11多肽結合的化合物。通過可逆或不可逆的固定一個或多個測試化合物或Wnt或FZD多肽於基質，如96孔聚苯乙烯微量滴定板的孔表面，例如體外檢測測試化合物與FZD或Wnt多肽的結合。固定多肽和其它小分子的方法是本領域公知的。例如，用FZD或Wnt多肽包被微量滴定板，其可通過將溶液中的多肽(通常以1-100jil體積中0.05到1mg/ml的濃度)加入到每個孔中，並在室溫至37°C下溫育平板一定的時間，例如.l至36小時進行。過剩的溶液從平板中搖除以除去未與平板結合的多肽，隨後用水或緩沖液洗滌平板(一次或多次)。通常，多肽在水或緩衝液中。然後用沒有結合多肽的緩沖液洗平板。為封閉平板上游離的蛋白結合位點，用與結合多肽無關的蛋白封閉平板。例如，可以使用Tris-HCL中2mg/ml濃度的300pl牛血清白蛋白(BSA)。合適的基質包括含有規定的交聯化學的那些基質(例如塑料基質，如來自例如ComingCostarCorp.(Cambridge,MA)的聚苯乙烯、苯乙烯或聚丙烯基質)。如果需要，顆粒，如珠狀的瓊脂糖或珠狀的瓊脂糖凝膠可以用作基質。測試化合物隨後可以被加入到包被的平板中，使其與FZD或Wnt多肽結合(如在37。C下進行0.5-12個小時)。然後如上所述的漂洗平板。技術人員將明白這個方法的許多變體都是可行的。例如，該方法可以包4舌用測試化合物包被基質，並向與基質結合的化合物中加入Wm或1'7D多肽。FZD或Wnt與第二化合物，如本文所述的測試化合物或與結合配偶體的結合(例如FZD7與Wnt3、8b和/或11的結合；下文將進一步詳細討i侖)可以通過多種本領域已知的方法進行4全測。例如，與FZD或Wnt多肽特異性結合的抗體(即，抗I:ZD抗體或抗Wnt抗體，如實施例部分所述的多克隆抗Wnt3抗體)可用於免疫分析。如果需要，抗體可以被標記(如菱光的或用放射性同位素)和直接檢測(例如參見West和McMahon，J.CellBiol.74:264,1977)。可選的,第二抗體可用於檢測(例如與抗FZD或抗Wnt抗體的Fc部分結合的標記抗體)。在可選的檢測方法中，標記FZD或Wnt多肽(例如用放射性同位素、螢光團、發色團等)，並檢測該標記。在又另一方法中，FZD或Wnt多肽製備為含有能夠可視檢測的蛋白，如綠色螢光蛋白(其可在UV光下進行檢測)的融合蛋白。在另一可替換的方法中，製備多肽為含有具有可檢測酶活性的酶，如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、(3-半乳糖苦酶或葡萄糖氧化酶的融合蛋白。編碼所有這些酶的基因已經被克隆並且能夠被技術人員使用。如果需要，融合蛋白可以包括抗原或抗原決定簇，其能夠通過使用常規方法用多克隆或單克隆抗體進行檢測和測量。合適的抗原包括酶(如辣根過氧化物酶、^威性磷酸酶和(3-半乳#唐苷酶)和非酶多肽(例如血清蛋白，如BSA和球蛋白，和乳蛋白，如酪蛋白)。在鑑定與FZD或Wnt多肽結合的多肽(如試驗多肽)的各種方法中，可以使用常規的蛋白/蛋白相互作用的雙雜交體試驗(參見，例如Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578,199〗；l'、iclds等，美國專利No.5,283,173;Fields和Song,Nature,340:245，1989;LeDouarin等,NucleicAcidsResearch,23:876,1995;Vidal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:10315-10320,1996;和White,Proc.Na化Acad.Sci.USA,93:10001-10003,1996)。通常，雙雜交體方法涉及轉錄因子兩個分開的結構域的重構。一個融合蛋白包括與轉錄因子(如Gal4)的反式激活域或DNA結合結構域融合的FZI)或Wnt多肽。另一融合蛋白包括第一融合蛋白中所含多肽的測試多肽或結合配偶體，該測試多肽或結合配偶體與轉錄因子的DNA結合結構域或反式激活域融合。FZD或Wnt多肽與測試多肽或結合配偶體的結合重構轉錄因子。通過檢';貝"可操作的連接於與轉錄因子DNA結合結構域結合的DNA序列的基因(即報導基因)的表達，可檢測轉錄因子的重構。實行各種雙雜交體方法的試劑盒可以通過商業途徑購買得到(例如從Clontcch;Palo八lto，C八)。在另一方面，本發明包括篩選測試化合物以鑑定調製FZD和Wnt多肽間蛋白-蛋白相互作用的化合物。Lepourcdet等，CancerCell5:91-102(2004)中記載了用於高通量篩選能夠調製轉錄調節物間蛋白-蛋白相互作用的化合物的方法，其在此全文引入作為參考。通常，提供第一化合物。第一化合物是FZD(如FZD7)或Wnt(如Wnt3、8b或11)多肽或其生物學活性片段。提供的第二化合物不同於第一化合物，並且被標記。第二化合物是FZD(如FZD7)或Wnt(如Wnt3、8b或11)多肽或其生物學活性片段。提供測試化合物。將第一化合物、第二化合物和測試化合物互相接觸。然後確定與第一化合物結合的標記的量。通過所結合標記評估的第一化合物和第二化合物之間蛋白-蛋白相互作用的改變指示測試化合物可用於調製FZD和Wnt多肽之間的蛋白-蛋白相互作用。在某些實施方式中，所提供的第一化合物附著於固相支持體。固相支持體包括，例如樹脂(如瓊脂糖和珠子)和多孔板。在某些實施方式中，所述方法在接觸步驟之後含有洗滌步驟，從而將結合的和未結合的標記分開。在某些實施方式中，多種測試化合物與第一化合物和第二化合物某些實施方式中，每種測試化合物在單獨的孔中與第一化合物和第二化合物接觸。例如，所述方法可以篩選測試化合物的文庫。測試化合物的文庫已在上文中進行了詳細的論述。文庫可以包括，例如天然產物、有機化學品、肽和/或修飾的肽，其包括例如D-胺基酸、非常規胺基酸和N-取代的胺基酸。通常，所述庫的形式適於在多孔板，例如96孔板中進行篩選。所述分析特別用於以多孔形式自動進行，其中許多步驟由計算機控制，通過自動機械裝置運行。所述文庫還可以其它形式使用，例如固定於固相支持體並可釋放到微滴中的合成化學文庫。在某些實施方式中，所述第一化合物是FZD7多肽或其片段，所述第二化合物是Wm多肽，例如Wnt3、8b或l]或其片段。在其它實施方式中，所述第一化合物是Wnt多肽，例如Wnt3、8b或11多肽或其片段，所述第二化合物是FZD7多肽或其片段。所迷第一化合物所附著的固相支持物可以是，例如瓊脂糖珠子、SPA珠子(摻入閃爍體的微球)或多孔板。當進行的分析不含洗滌步驟時，例如在閃爍鄰近分析(scintillationproximityassay)中，可以寸吏用SPAJ朱子。當進行的分析含洗滌步驟時，可以使用瓊脂糖凝膠珠子。所述第二化合物可以用任何可檢測的標記，例如放射性標記、焚光試劑、生物素、肽標籤或酶片段進行標記。所述第二化合物還可以用1251或3H進行放射性標記。在某些實施方式中，與第一或第二化合物化學結合，或表達為第一或第二化合物的融合蛋白的酶的酶學活性可被用於檢測結合的蛋白。還包括使用標準免疫學方法檢測結合蛋白的結合分析。在某些其它實施方式中，通過與FZD或Wnt多肽共價連接的供體螢光團(例如與FZD或Wnt化學結合的螢光基團或表達為FZD或Wnt-GFP嵌合蛋白的綠色焚光蛋白(GFP)變體)和與基質蛋白共價連接的受體焚光團之間的螢光能量共振能量轉移(FRET)檢測Wnl和FZD多肽或其片段的相互作用，其中供體的放射光譜與受體的激發光i齊存在適當的重疊，從而在FZD和Wnt多肽的蛋白-蛋白相互作用導致螢光團緊密接近時產生有效的非放射的能量轉移。在另一實施方式中，蛋白-蛋白相互作用通過酶，例如(3-半乳糖芬酶結構域的重構進行檢測(參見Rossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:8405-8410(1997))。在又另一實施方式中，蛋白-蛋白相互作用通過細胞中FZD和Wnt多肽的適當嵌合構建體的螢光比率成像(Bacskai等，Science260:222-226(1993))，或通過應用FZD和Wnt多肽的適當構建體的雙雜交試驗的變體(Fearon等，ProcNatlAcadSciUSA89:7958-7962(1992);Takacs等，ProcNatlAcadSciUSA90:10375-10379(1993);Vidal等，ProcNatlAcadSciUSA93:10321-10326(1996))並加以調整用於高通量分析以衝全測抑制FZD/Wnt相互作用的化合物來進行評估。這些實施方式的優勢在於確保了測試化合物的細胞滲透性。例如，在一個分析中，l''ZI〕或Wnt多肽或其片段^t吸附到L'丄ISA平板上。然後將FZD或Wnt多肽暴露於測試化合物，之後再暴露於穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)-結合配偶體融合蛋白，例如GST_FZD或-Wnt多肽融合蛋白接觸。用山羊抗GST抗體、鹼性磷酸酶(AP)-偶聯的抗山羊IgG和AP底物檢測結合的蛋白。幹擾蛋白-蛋白相互作用的化合物在EUSA平板中產生降低的AP信號。在又另一方面，本發明提供鑑定調製(如增加或降低)FZD和/或Wnt多肽的表達的測試化合物的方法。方法包括將FZD和/或Wnt核酸與測試化合物接觸，然後測量所編碼FZD和/或Wnt多肽的表達。在有關的方面，本發明描述了鑑定調製(如增加或降低)FZD和/或Wnt多肽的表達的化合物的方法，其是通過測量存在測試化合物時或加入測試化合物後，FZD多肽在下列(a)摻入了包括FZD和/或Wnt核酸序列或其片段或等位基因變體在內的重組構建體的細胞系，或(b)天然選衝奪性表達FZD和/或Wnt的細胞群或細胞系中的表達，然後測量FZD和/或Wnt蛋白的表達而進行的。由於本文所述的FZD和Wnt核酸已經被鑑定，因此可以將它們克隆到各種宿主細胞(例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細諾或真菌)中以在完整細胞中進行該分析。在某些實施方式中，編碼FZI)和/或Wnt多肽的分離的核酸分子可以被用於鑑定在體內(例如，在生產FZD和/或Wnt的細胞中)調製(如增加或降低)FZD和/或Wnt表達的化合物。在這種實施方式中，培養表達FZD(如FZD7和/或8)和/或Wnt(如Wnt3、Wnt8b或Wntl1)的細胞,將暴露於測試化合物(或測試化合物的混合物),比較FZD和/或Wnt表達水平與除了沒有暴露於一種或多種測試化合物以外其它都一樣的細胞中FZD和/或Wnt的表達水平。可以使用標準的基因表達定量分析。可以使用本領域公知的方法測定FZD和Wnt的表達，例如通過Northern印跡PCR分析或RNAse保護分析，其使用本發明的核酸分子作為探針。其它實施例包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)或爽光激活細胞分類術(FACS)。存在測試化合物時表達水平與其不存在時表達水平的比較指示測試化合物是否調製1ZD和/或Wnt多肽的表達。在又另一方面，本發明提供使用對一種或幾種轉錄/翻譯組分的幹擾敏感的細胞系統篩選測試化合物的方法。在某些實施方式中，所述方法包括鑑定千擾有關FZD和/或Wnt翻譯準確性的步驟，例如在翻譯期間保持正確讀碼框和在終止密碼子終止翻譯的候選化合物。該方法包括構建細胞，其中可檢測的報導分子多肽只有在位於一個讀碼框中或在終止密碼子處終止翻"^的正常過程被幹擾時才產生。該方法進一步包括將細胞與測試化合物接觸以鬥全驗它是否增加或降低報導分子多肽的產生。在另一實施方式中，所述細胞系統是無細胞提取物，所述方法包括在體外檢測轉錄或翻譯。選擇條件使得通過向細胞提取物中加入轉錄調節物或翻譯調節物增加或降低報導基因的轉錄或翻譯。鑑定候選化合物的一種方法依賴於轉錄敏感的基因產物。該方法包括構建細胞，其中報導分子的產生在FZD和/或Wm核酸的細胞轉錄發生變化(即，增加或降低)的條件下改變(即，增加或降低)。特別的，報導分子由轉錄地連接於被構建和排列使得當FZD和/或Wnt碼報導基因的基因序列可以，例如融合於編碼轉錄敏感的基因產物的基因的部分或整個，和/或調控基因產物產生的遺傳元件的部分或整個。因的轉錄。所述方法進一步包括將細胞與測試化合物接觸，並確定測試化合物是否增加或降低細胞中報導分子的產生。可選的，鑑定候選化合物的方法可以依賴於翻譯敏感的基因產物。該方法包括構建細胞，其中FZD和/或Wnt核酸的細胞翻i奪發生改變(即，增加或降低)。特別的，報導分子由翻譯性連接於被構建和排列使得當FZD和/或Wnt核酸的轉錄改變時報導分子的產生也相對增加或降低的序列的核酸編碼。編碼報導分子的基因序列可以，例如融合於編碼翻譯敏感的基因產物的基因的部分或整個，和/或控制基因產物產生的遺傳元件的部分或整個。可選的，翻譯敏感的基因產物可以直接或間接刺激編碼報導子的基因的翻譯。所述方法進一步包括將細胞和測試化合物接觸，並檢測測試化合物是否增加或降低細胞中第一報導分子的產生。對於本文所述的這些和任何方法，可以使用多種報導基因，其中典型的報導基因提供可方便檢測的信號(例如，通過光譜法)。作為示報導基因分子的實例包括但不限於P-半乳糖苷酶、轉化酶、綠色螢光蛋白、螢光素酶、氯黴素乙醯轉移酶、P-葡萄糖醛酸酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖澱粉酶和放射性標記的報導基因。例如，報導基因分子的產生可以通過報導基因產物，例如P-半乳糖苷酶的酶活性進行測量。本文所述的任何方法都可以被用於高通量篩選大量測試化合物以鑑定候選抗癌劑。高通量篩選是指所述方法可以被用於相對容易和快速的篩選大量候選化合物。鑑定測試化合物為候選抗癌劑後，如果需要，化合物可以使用本領域已知的技術在體內或體外進一步測試以證實它是否是抗癌劑，即確定它是否能夠在體外(例如，使用分離的細胞或無細胞系統)或體內(例如，使用動物，如齧齒動物，模型系統)調製Wnt/FZD信號傳導；癌細胞移動性和/或FZD和/或Wnt表達。候選化合物的體外測試可以通過本領域技術人員已知的方法完成，例如涉及使用細胞，如野生型、癌症和/或轉基因肝細胞的測試.監控Wnl/FZD信號傳導、FZD和Wnt表達和癌細胞移動性的示例性分析，以及能夠用於該分析的有用的細胞在下面的實施例部分中描述。可選的或另外的，候選化合物的體內測試可以通過本領域技術人員已知的方法進行。例如可以將一種或多種候選化合物施用給哺乳動物，如齧齒動物(如小鼠)或兔。本領域認可將這些動物模型系統用於測試潛在的藥物試劑以確定它們在患者，如人類患者中的治療效力。對於體內測試特別有用的動物是野生型動物或過量產生FZI)和/或Wnt多肽的非野生型動物(如小鼠)，例如過量表達FZD或Wnt轉基因(如FZD7或Wnt3轉基因)和/或顯示FZD8和/或Wntl1多肽生產減少的動物。其它在體內分析中有用的動物是飼養來發生肝癌的動物。某些特別有用的發生肝癌的轉基因小鼠在實施例部分描述，並且包括在本發明中。在典型的體內分析中，動物(如野生型或轉基因小鼠)通過任何被認為適當的途徑(例如通過注射)施用候選化合物的劑量。常規的方法和標準可以被用於監控動物的所需活性。如果需要，存在候選化合物時獲得的結果可以與沒有用測試化合物處理的對照動物中的結果進行比較。藥物化學一旦確定目的化合物(或試劑)，可以採用藥物化學的標準原理產生化合物的衍生物以進行另一輪測試。篩選具有改善的藥理活性，例如效力、藥物動力學、穩定性、溶解度和清除率的衍生物。在上述分析中導致化合物活性的部分(moieties)可以通過本領域通常使用的結構活性關係(SAR)檢驗進行描述。藥物化學領域的普通技術人員可以修飾候選化合物或試劑的部分以及測定修飾對化合物或試劑效力的影響，從而生產具有增加效能的衍生物。例如，參見Nagarajan等(1988)J.Antibiot.41:1430-8。此夕卜，如果化合物(或試劑)的生化靶標已知或已經確定，耙標和化合物的結構可以為衍生物的設計和優化提供信息。用於該目的的分子建模軟體可以通過商業途徑購買得到(例如，MolecularSimulations,Inc.)。IV.抗體本發明描述了純化或分離的抗體，所述抗體結合於，如特異性結合於I《D和/或Wnt多肽，即抗FZD和抗Wnt抗體。當抗體結合那個抗原，但較少識別和結合(例如，不識別和結合)樣本中的其它分子時，所述抗體與特定抗原，如FZD7和/或8多肽"特異性結合"。本發明的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、人源化的或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')2片段和使用Fab表達文庫產生的分子。本發明中包括的一類抗體的實例是下面實施例部分所述的多克隆抗Wnt3抗體。生產多克隆抗體的方法是本領域技術人員公知的。本文中，術語"抗體"表示含有至少一個，如兩個重(H)鏈可變區(本文中簡寫為VH)，和至少一個，如兩個輕(L)鏈可變區(本文中筒寫為VL)的蛋白。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為"互補決定區"("CDR，，)，其散布在更加保守的稱為"構架區"(FR)的區域之中。構架區和CDR的範圍已有準確的定義(參見Kabat，E.A.,等(1991)SequencesofProteinsoflmmunologicalInterest,F〗fthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242,和Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.]96:901-917)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，其從氨基端到羧基端按以下順序排列FR1,CDRl，FR2,CDR2，FR3,CDR3，FR4。抗FZD或抗Wnt抗體可以進一步包括重4連和輕鏈恆定區，從而分別形成免疫球蛋白重和輕鏈。抗體可以是兩個免疫球蛋白重鏈和兩個免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中免疫球蛋白重和輕鏈通過例如二硫鍵相互連接。重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2和CH3。輕鏈恆定區包括一個結構域，CL。重鏈和輕鏈可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區通常介導抗體與宿主組織或因子的結合，其包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。抗體的"FZD結合片段"和"Wnt結合片段"表示全長抗體的一個或多個片段，其分別保留了分別與P'ZD或Wnt多肽或其部分特異性結合的能力。抗體多肽結合片段的實例包括，但不限於(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含通過鉸鏈區的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的一個臂上的VL和VII結構域組成的Fv片段；(v)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546);和(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域，VL和VH由分開的基因編碼，可以使用重組方法通過合成的連接體將它們連接，從而使它們能夠成為單個蛋白鏈，其中VL和VH區域配對形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv);參見例如，Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體也包含在術語抗體的"FZD結合片段，，和"Wnt結合片段"中。這些抗體片段可以通過使用本領域技術人員已知的常規技術獲得。為產生抗體，可以使用多肽(或抗原片段(如多肽片段，其根據諸如高頻率的帶電殘基的標準顯示可能為抗原的)或這些多肽的類似物)，例如通過重組或肽合成技術(參見，例如SolidPhasePeptideSynthesis,同上；Ausubel等，同上)製備的多肽。通常，多肽可以如Ausubel等,同上中所述的與載體蛋白，如KLH偶聯，與佐劑混合，並注入宿主哺乳動物。"載體"是穩定關聯分子，和/或幫助或增強其轉運或免疫原性的物質。例如，FZD或Wnt蛋白或其片段可以使用標準PCR技術產生，並克隆到pGEX表達載體中(Ausubel等，同上)。融合蛋白可以在大腸桿菌中表達，並使用穀胱甘肽瓊脂糖親合基質進行純化，其如Ausubel等，同上中所述。通常，將FZD和/或Wnt多肽注入多種宿主。合適的宿主動物的實例包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。根據宿主種類，多種佐劑可以被用於增加免疫應答，其包括但不限於弗氏(完全和不完全的佐劑)、佐劑礦物凝膠，如氬氧化鋁，表面活性物質，如溶血卯磷脂、聚氧丙烯多元醇(polyronicpoyo1)、聚陰離子、肽、油乳膠、匙孔血藍蛋白、二硝基酚、BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。這些過程導致產生多克隆抗體，即源自免疫動物血清的抗體分子的異種群體。抗體可以從獲自宿主動物的血液中純化，例如通過親和層析法，其中FZD和/或Wnt多肽抗原被固定在樹脂上。本發明還包括抗FZD和抗Wnt單克隆抗體。單克隆抗體(mAbs)是特異於特定抗原的抗體的同種群體，其能夠通過使用FZD或Wnt多肽和標準雜交瘤技術製備(參見，例如Kohlcr等，Nature,256:495,1975;Kohler等，Eur.J.Immunol"6:511,1976;Khler等，Bur.J.Immunol.,6:292,1976;Hammerling等,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,NY,1981;Ausubel等，同上)。通常，使用通過培養物中連續細胞系生產抗體分子的任何技術生產單克隆抗體，例如Kohler等，Nature,256:495,1975,和美國專利No.4,376,110中所述的那些技術；人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等，ImmunologyToday,4:72,1983;Cole等，Prc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026，1983);和EBV-雜交瘤技術(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96，1983)。這些抗體可以是任何的免疫球蛋白類型，其包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亞類。產生本發明mAb的雜交瘤可以在體外或體內培養。一旦產生，測試多克隆或單克隆抗體在免疫測定，如使用例如Ausubel等，同上中所述的標準-汰術的Western印跡或免疫沉澱反應分析中對FZD或Wnt多肽的識別，如特異性識別。與FZD或Wnt多肽(如FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11)特異性結合的抗體在本發明中是有用的。例如，這些抗體可以被用於免疫測定以檢測樣本，如組織樣本中的多肽，和/或調製FZD/Wnt信號傳導(例如治療癌症，如肝癌)。可選的或另外的，單克隆抗體可以重組產生，例如通過噬菌體展示，或者通過例如Ladner等美國專利No.5,223,409;Kang等國際公開No.WO92/18619;Dower等國際公開No.WO91/17271;Winter等國際公開WO92/20791;Markland等國際公開No.WO92Z15679;Brcitling等國際公開WO93/01288;McCarfcrty等國際公開No.WO92/01047;Garrard等國際公開No.WO92/09690;Ladner等國際公開No.WO卯/02809;Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huse寺(1989)Science246:1275-1281;Griffths等(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkins等(1992)JMolBiol226:889-896;Clackson等(1991)Nature352:624-628;Gram等(1992)PNAS89:3576-3580;Garrad等(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom等(1991)NucAcidRes19:4133-4137;和Barbas等(l99)PNAS88:7978-7982中所述的組合方法產生。抗FZD和抗Wnt抗體可以是全長的人抗體(例如在小鼠中製備的抗體，該小鼠被基因工程改造以產生來自人免疫球蛋白序列的抗體)，或非人抗體，例如齧齒動物(小鼠或大鼠)、兔、馬、母牛、山羊、靈長類動物(例如猴子)、駱駝、驢、豬或鳥抗體。抗FZD和抗Wnt抗體可以是其中可變區或其部分，例如CDR可以在非人生物體，例如大鼠或小鼠中生成的抗體。抗FZD和抗Wnt抗體也可以是，例如嵌合的、CDR移植的或人源化的抗體。抗FZD和抗Wnt抗體也可以在非人生物體，如大鼠或小鼠中生成，然後修飾，諸如在可變構架或恆定區中，以降低在人體中的抗原性。開發用於產生"嵌合抗體"(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851,1984;Neuberger等，Nature,312:604,1984;Takeda等，Nature314:452,1984)的技術可以被用於剪切來自具有適當抗原特異性的小鼠抗體分子的基因和來自具有適當生物學活性的人抗體分子的基因。嵌合抗體是其中不同部分來自於不同動物種類的分子，例如具有源自鼠mAb的可變區和人免疫球蛋白恆定區的那些抗體。可選的，描述用於生產單鏈抗體的技術(美國專利4，946，778;和美國專利4,946,778和4,704,692)適合生產特異於1'，ZD或Wnt多肽的單鏈抗體。單鏈抗體是通過用胺基酸橋(bridge)連接Fv區域的重鏈和輕鏈片段，產生單鏈多肽而形成。識別和結合特定表位的抗體片段可以通過已知技術生成。例如，這些片段可以包括但不限於可通過抗體分子的胃蛋白酶消化產生的F(ab')2片段和可通過還原F(ab')2片段的二硫鍵產生的Fab片段。可選的，可構建Fab表達庫(Huse等，Science,246:1275，]989)以快速和容易的鑑定具有所需特異性的單克隆Fab片段。與FZD和/或Wnt多肽特異性結合的多克隆和單克隆抗體(或其片段)可以被用於，例如檢測患者各種組織中FZD和/或Wnt的表達。例如，1'，ZD7和/或8多肽可以在生物組織或提取物的常規免疫測定中檢測。合適的測定的實例包括，但不限於，Western印跡、b:USA、放射性免疫測定等等。V.藥物組合物任何藥學活性化合物、試劑、核酸、多肽或抗體(其都可以在此表示為"活性化合物")都可以摻入藥物組合物。這樣的組合物通常包括活性化合物和可藥用的載體。"可藥用的載體，，可以包括適於藥學施用的溶劑、分散介質、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲試劑等等。額外的活性化合物也能夠摻入到組合物中。藥物組合物可以配製成劑型以適於其意定的施用途徑。施用途徑的實例包括腸道(例如口服和直腸)和非腸道，如靜脈內(例如向肝的門靜脈)、皮內、皮下、經皮、經黏膜和肺部施用。可以通過例如注射或手術期間的局部施用直接施用到肝臟。用於注射的溶液或懸浮液可以包括下列組分無菌稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、不揮發性油、聚乙烯乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或尼泊金曱酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或二硫化鈉；螯合試劑，如乙二胺四乙酸；緩衝液，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用於調節張性的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或鹼調節pH，例如鹽酸或氫氧化鈉。非腸道製劑可以裝入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料製得的多劑量小瓶。適於注射用的藥物組合物包括無菌水溶液(當水溶時)或分散體和用於即時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。為靜脈內施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorEL(BASF,Parsippany,NJ)、或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，並應該流質到使得能夠容易的用注射器進行注射的程度。在製備和存儲條件下它應該是穩定的，並且必須防止微生物，如細菌和真菌的汙染。載體可以是溶劑或分散介質，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙辨乙二醇(polyetheyleneglycol)等等)及其合適的混合物。適當流動性的維持可以通過，例如使用包衣，如卵磷脂，在分散體的情況下保持必需的顆粒大小和使用表面活性劑。防止微生物作用可以通過多種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥苯曱酸酉旨(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)等實現。在許多情況下，它優選包括等滲劑，例如糖、多元醇，如甘露醇或山梨醇和氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過包含延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠實現。製備無菌可注射溶液可以通過將所需量的活'f生化合物摻入具有一種上面所列成分或其組合的適當的溶劑中，如果需要，隨後再進行無菌過濾。通常，製備分散體是通過將活性化合物摻入含有基本分散介質和來自上面所列的那些所需的其它成分的無菌載體中。對於用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末，優選的製備方法是進行真空乾燥和凍幹，其產生來自前述無菌過濾的溶液的活性成分的粉末和任何其它所需成分。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。為了口服治療性施用，活性化合物可以與賦形劑混合，以片劑、含片或膠嚢，如明膠膠嚢的形式使用。口服組合物也可以使用流體載體進行製備以用作漱劑。可以包含藥學可接受的結合劑和/或佐藥材料作為組合物的部分。片劑、丸劑、膠嚢、含片等可以含有任意下述成分或類似性質的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖，崩解劑，例如褐藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes;鬆散劑，例如膠狀二氧化矽；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或調味劑，例如薄荷、曱基水楊酸酯或橙調味劑。為通過吸入施用，化合物以氣霧劑的形式遞送，其來自加壓容器或含有合適的推進劑，例如氣體，如二氧化碳的分配器，或噴霧器。全身施用也可以通過經黏膜或經皮膚的方式。為經黏膜或經皮膚施用，在製劑中使用適於需滲透的屏障的滲透劑。該滲透劑通常是本領域已知的，例如為經黏膜施用其包括去汙劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經黏膜施用可以通過使用鼻噴劑或栓劑(例如，具有常規的栓劑基質，如可可脂和其它甘油酯)完成。為經皮膚施用，如本領域所公知的將活性化合物配製成軟膏(ointment)、藥骨(salves)、凝膠劑或享L齊寸。在一個實施方式中，活性化合物與防止化合物從體內快速排除的載體一起製備，例如控制釋放的劑型，包括埋植劑和微膠嚢化的遞送系統。使用可生物降解、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯(ethylenevinylacetate)、聚酐、聚乙醇酸、月交原、多正酯類(polyorthoesters)和聚乳酸。製備這些製劑的方法對於本領域糹支術人員而言是顯然的。材衝十也可以從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc購買得到。脂質體懸浮液可以用作可藥用的載體。這些可以根據本領域技術人員已知的方法進行製備，例如如美國專利No.4,522,811中所述的。將口服或胃腸外組合物配製成便於施用和劑量均一的劑量單位形式是有利的。本文所用的劑量單位形式表示物理分離的單位，其適合作為被治療的受試者的單一劑量；每個單位含有計算產生所需治療效果的預定質量的活性化合物和所需的藥用載體。每種化合物的毒性和治療效力可以通過標準的藥學程序在細胞培養物或試驗動物中測定，例如測定LD50(50%的群體的致死劑量)和ED50(在群體的50%中具有療效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比率是治療指數，它能夠表示為比率LD50/ED50。優選顯示高治療指數的化合物。當使用顯示毒性副作用的化合物時，需要小心設計遞送系統，其將這些化合物靶向到染病的組織，如肝，以將對健康細胞的潛在傷害降到最小，從而降低副作用。從細胞培養分析和動物研究獲得的數據可被用於制定在人體中使用的劑量範圍。這些化合物的劑量優選處於循環濃度(circulatingconcentration)範圍中，其包括具有很少或沒有毒性。劑量在這個劑量範圍中根據應用的劑量形式和採用的施用途徑而改變。對於本發明方法中使用的任意化合物，可以首先通過細胞培養測定估計治療有效的劑量。可以在動物模型中制定劑量以獲得包括如細胞培養中所測定的IC50(即，獲得症狀的半最大抑制作用的測試化合物濃度)在內的循環血漿濃度範圍。這些信息可以用於更準確的確定人體中的有效劑量。血漿中的水平可以通過例如高效液相層析進行測量。本文中所用術語"有效量"和"治療有效"表示使用一段時間的本文所述化合物的數量或濃度(包括急性或慢性施用和定期或連續施用)，其在施用的情況下有效導致意訂的效慄或生理學成果。對於本文所述的化合物，例如多肽的有效量(即有效劑量)的範圍從約.Ol到500mg/kg體3t,例4口約0.01到50mg/kg體重，例如約0.1到20mg/kg體重。多肽可以在約1到10周之間，如在約2到8周，約3到7周之間，或約4、5或6周中每周施用一次。技術人員可知某些因子影響有效治療患者所需的劑量和時間，其包括但不限於待治療的患者的類型、疾病或紊亂的嚴重程度、以前的治療、患者的綜合健康情況和Z或年齡，和存在的其它疾病。此外，用治療有效量的化合物治療患者可以包括單一治療，或優選的包括系列治療。至於抗體，部分人抗體和全長人抗體在人體中具有比其它抗體更長的半衰期。因此，更低的劑量和更低的施用頻率是可能的。修飾，例如脂質化(lipidation)可用於穩定抗體和增強吸收和組織滲透。抗體脂質化的方法記載於Cmikshank等((1997)J.AcquiredImmuneDeficiencySyndromesandHumanRetrovirology14:193)中。如果化合物是小分子，示例劑量包括每千克受試者或樣本重量毫克或微克量的小分子(例如，每千克約1微克到每公斤約500毫克，每公斤約100微克到每公斤約5毫克，或每公斤約1微克到每公斤約50微克。可進一步理解小分子的適當劑量取決於小分子調製表達或活性的能力。當將一個或多個這些小分子施用給動物(如人類)以調製FZD或Wnt多肽或核酸的表達或活性時，醫生、獸醫或石開究人員例如可以首先指定相對較低的劑量，然後增加劑量直到獲得適當的反應。此外，應理解用於任何特定動物受試者的特定劑量水平取決於多種因素，其包括所使用的特定化合物的活性、受試者的年齡、體重、綜合健康狀況、性別和飲食、施用時間、施用途徑、排洩率、任何藥物組合和待調製的表達或活性的程度。核酸分子(如FZD7，FZD8，Wnt3，Wnt8b和/或Wm11DNA)可以插入到載體中，用作基因治療載體。基因治療載體可以通過例如靜脈內注射、局部施用(參見，例如美國專利5，328，470)或通過定向(stereotactic)注射(參見，例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057)遞送到受試者中。基因治療載體的藥學製品可以包括在可接受稀釋劑中的基因治療載體，或者可以包含植入基因遞送載體的緩釋基質。可選的，當整個基因遞送載體可以完整的從重組細胞例如逆轉錄病毒載體中產生時，藥學製品可以包括一個或多個產生基因遞送系統的細胞。下述實施例部分記載了潛在能夠用於基因治療方法的示例構建體。藥物組合物可以和施用說明書一起包括在容器、包裝或分配器中。VI.癌症及其治療術語"癌症"表示具有自主生長能力的動物細胞。這種細胞的實例包括具有異常狀態或情況的細胞，其特徵為快速增殖的細胞生長。術語意指包括癌生長，例如腫瘤；致瘤過程、轉移的組織和惡性轉化的細胞、組織或器官，不論其組織病理學類型或侵襲階段。還包括多種器官系統的惡性腫瘤，例如呼吸、心血管、腎臟、生殖、血液、神經、肝、腸胃和內分泌系統；以及腺癌，其包括癌症例如大部分結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫瘤、肺非小細胞癌、小腸癌和食道癌。"自然出現"的癌症包括任何不是通過移植癌細胞到受試者實驗誘導的癌症，並且包括例如，自發出現的癌症、由於患者接觸一種或多種致癌物而導致的癌症、由於插入轉基因的致癌基因或敲除肺瘤抑制基因而導致的癌症，和通過感染，例如病毒感染導致的癌症。術語"癌"是本領域公知的，表示上皮或內分泌組織的惡性狀態。該術語包括癌肉瘤，其包括由癌瘤性和肉瘤樣組織組成的惡性腫瘤。"腺癌"表示源自腺狀組織，或其中腫瘤細胞形成可識別的腺狀結構的癌。術語"肝癌"(HCC)表示從肝細胞，肝臟的主要細胞類型發生的癌。術語"患者"在整個說明書中被用於表述動物、人或非人，齧齒動物或非齧齒動物，它們被依照本發明的方法進行治療。預期進行獸類和人類的臨床應用。術語"患者，，包括，但不限於鳥、爬行動物、兩棲動物和哺乳動物，如人、其它靈長類動物、豬、齧齒動物，如小鼠和大鼠、兔、豚鼠、倉鼠、母牛、馬、貓、狗、綿羊和山羊。優選的受試者是人、農場動物(farmanimals)和家庭寵物，例如貓和狗。術語"治療"在本文中用於表示延緩患有病症，如癌症的患者的發作、抑制、減輕其作用或延長其生命。可使用本發明的方法和組合物治療的癌症除了別的以外包括，但不限於肝、胃、結腸、直腸、口/咽、食道、喉、胰腺、肺、小腸和膽管的癌症。被認為具有患癌症風險的個體可以明顯的從本發明中獲益，主要因為可以在出現腫瘤任何跡象前開始預防性治療。"有風險"的個體包fe,例如通過如才聶入(consumption)，例如通過如"及入和/或損—耳又，以統計學上顯示在易感個體中促進癌症的水平接觸到致癌物質的個體。還包括接觸病毒，如肝炎病毒，如B肝病毒(HBV)的個體。還包括由於暴露於紫外線輻射、或他們的環境、職業和/或遺傳而具有風險的個體，以及顯示前癌症症狀跡象的那些個體。類似的，在癌症的非常早期階段或轉移發生階段(即，只有一個或少量異常細胞出現在個體身體中或個體組織的特定位點)的個體可以從這些預防性治療中獲益。技術人員了解，醫生(或獸醫，取決於要診斷的患者)可以使用本文所述的方法診斷患者患有癌症或具有患癌症的風險，其任選的使用附加的方法，例如評估患者的病史、進行其它診斷試驗和/或通過使用成像技術。治療患有癌症或具有患癌症風險的患者的一種策略是調製患者中的Wnt/FZD信號傳導。目的是在信號傳導太低的地方增加信號傳導，在信號傳導太高的地方降低信號傳導。Wm/FZD信號傳導的調製分成兩個基本類型降低(即減少，如消除)Wnt/FZD信號傳導，和當不足或沒有活性時增加(即補充或提供)Wnt/FZD信號傳導。Wnt/FZD信號傳導是否應當被抑制或增加取決於預期的應用。Wnt/P'ZD信號傳導可以使用本文所述的活性化合物(例如，抗Wm抗體、siRNAs、候選化合物和/或抗癌劑)進行調製。通過例如降j氐FZD7和/或Wnt3的表達和/或幹擾FZD7和它的配體(例如，Wnt3、8b和/或11)之間的相互作用降低Wnt/FZD信號傳導活性的化合物可以被用於例如治療癌症，如肝癌。通過例如增加FZD8的表達增加活性的化合物也可以一皮用於例如治療癌症，如肝癌。降低Wnt/FZD信號傳導可以使用本領域已知的用於降低患者中特定蛋白表達的方法降低Wnt/FZD信號傳導。例如，可以使用有效抑制內源FZD或Wnt基因，如FZD7或Wnt3基因表達的反義核酸。本文中，術語"反義寡核苷酸"或"反義"描述寡核苷酸，其為寡核糖核苷酸、寡脫氧核糖核苷酸、修飾的寡核糖核苷酸或修飾的寡脫氧核糖核苷酸，其在生理條件下與包含特定基因或該基因的mRNA轉錄本雜交，並因此抑制該基因的轉錄和/或該mRNA的翻i奪。設計反義分子使其通過與目標基因或轉錄本的雜交幹擾靶基因(例如，編碼FZD7或Wnt3、8b或11的基因)的轉錄或翻譯。反義核酸可以包括與整個FZD或WntRNA或RNA的一部分互補的核苷酸序列。一方面，反義核酸需要足夠長以便有效的的與FZD或WntRNA雜交。因此，最小長度為大約12到25個核苷酸。另一方面，當長度增加到超過約150個核苷酸時，抑制轉錄的效力僅有微小的增加，而將反義核酸導入靶細胞的困難將明顯增加。因此，反義核酸的合適長度可以為乂人約15到約150個核苷酸，如20、25、30、35、40、45、50、60、70或80個核苷酸。反義核酸可以與FZD或WntmRNA的編碼區或者FZD或WntmRNA的5，或3'非編碼區或者兩者互補。一種方法是設計反義核酸使其與FZD或WntmRNA翻譯起始位點兩側的區域互補。基於本文所公開的序列，本領域技術人員能夠容易的選擇和合成大量適於本發明使用的反義分子的任意一個。例如，可以製備含有與FZD或WntmRNA互補並跨越其長度的一系列15-30個核苷酸的寡核苦酸的"基因步移(genewalk)"，隨後檢驗FZD或Writ表達的抑制。可選的，可以在寡核苷酸之間留5-10個核苷酸的缺口以減少合成和測試的寡核芬酸的數量。可以例如根據售貨方的說明例如使用商業購得的核酸合成儀化學合成反義核酸。可選的，可以使用重組DNA技術生產反義核酸。反義核酸可以只4參入天然存在的核苦酸。可選的，它可以摻入各種修飾的核芬酸或核苷酸類似物以增加它在體內的半衰期或增加反義分子與它的靶RNA之間形成的雙鏈體的穩定性。核苦酸類似物的實例包括硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核普酸。給定靶標和序列的描述，生產合適的反義核酸屬於本領域的常規技術。對於有關反義核酸的指導，參見例如Goodchild,"InhibitionofGeneExpressionbyOligonucleotides,"inTopicsinMolecularandStructuralBiology,Vol.12:Oligodeoxynucleotides(Cohen,ed.),MacM'illanPress,London,pp.53-77(1989)。反義寡核苷酸的遞送可以通過本領域技術人員已知的任何技術完成。例如，為細胞培養物和/或先體外後體內的工作遞送反義寡核苷酸可以通過標準方法，例如脂質體法或者只是通過加入能透過膜的寡核苦酸完成。為體內應用遞送反義寡核苷酸可以例如通過在所選位點，如肝臟局部注射反義寡核苷酸實現。這個方法以前被證實可抑制牛皮癬生長和抑制細胞巨化病毒。參見例如，Wraight等，(2001).PharmacolTher.90(1):89-104;Anderson等，(1996)AntimicrobAgentsChemother40:2004-201l;和Crooke等，(1996)JPharmacolExpTher277:923-937。類似的，RNA幹擾(RNAi)技術可以被用於抑制FZD或Wnt表達，另外的或可選的應用反義技術。例如，針對FZD或Wnt核酸的'J、千擾RNA(siRNA)雙鏈體可被合成，並用於防止所編碼的一個或多個蛋白的表達。下述實施例部分記載了示例性Wnt3siRNAs。另一個抑制Wnt/FZD信號傳導的途徑包括施用給患者化合物，例如候選化合物或抗癌劑，其與FZD多肽(例如1'7D7多肽)和/或它們的結合配偶體(例如Wnt2、8b和/或11)結合，從而防止兩者之間的相互作用。這些化合物和試劑可以，例如與FZD多肽(例如與FZD多肽的CRD結構域)和/或與Wnt多肽(例如與Wnt多肽的結合結構域)以防止蛋白間相互作用的方式結合。這種候選化合物和抗癌劑可以使用本文所述的篩選方法鑑定。可以與Wnt多肽，例如Wnt3、8b和/或11結合的化合物的實例是FZD7受體或其截短的形式，和抗Wnt抗體(或其FZD結合片段)，例如下述實施例部分所述的抗Wnt3抗體。又另一個抑制Wnt/FZD信號傳導的途徑包括施用給患者編碼突變(例如截短的)形式的FZD受體，如FZD7受體的載體(例如基因治療載體)。摻入構建體的患者細胞中突變形式受體的表達可以幹擾細胞中的Wnt/FZD信號傳導。例如，可以使用編碼分泌和可溶形式的FZD受體(例如FZD7受體)的構建體。靶細胞中這種構建體的表達將導致細胞分泌可溶形式的FZD受體，其將與Wnt多肽結合，使得它們不能與細胞表面的完整FZD受體結合。可選的或另外的，可以使用編碼膜結合但無活性形式的FZD受體(即，無法行使一些由類似的野生型FZD受體行使的功能的突變FZD受體)的構建體。細胞中這種構建體的表達可以結合Wnt多肽或通過不涉及Wnt多肽的內在機制幹擾Wnt/FZD信號傳導。又另一個抑制Wnt/FZD信號傳導的途徑包括施用給患者編碼Wntll多肽的載體(例如，基因治療載體)，其是HCC中經典Wnt途徑的抑制物。該載體可以源自不複製的線性或環形DNA或RNA載體，或來自自主複製的質粒或病毒載體。構建合適的表達載體的方法是本領域已知的，有用的材料可以通過商業途徑購買得到。增加Wnt/FZD信號傳導通過增加患者中FZD多肽(例如，FZD8多肽)和/或Wnt多肽(例如，Wnt3多肽)的表達可以在體內提供新的或補充的Wnt/FZD信號傳導。例如，通過在生物體的細胞中表達含有編碼FZD多肽(例如，FZD8多肽)和/或Writ多肽(例如，Wnt3多肽)的核苷酸序列的核酸構建體可以直接在生物體，例如人中產生FZD或Wnt多肽。為這個目的可使用任何適於轉染目的生物體細胞的合適的表達載體。VII.轉基因動物本發明還描述了發生肝癌和在它們的肝細胞中過量表達l''ZD7的轉基因動物。這些動物代表用於研究肝癌和開發能夠調製Wnt/I'7D信號傳導和治療癌症的治療試劑的模型系統。轉基因動物可以為，例如農場動物(豬、山羊、綿羊、母牛、馬、兔等)、齧齒動物(例如，大鼠、豚鼠和小鼠)、非人靈長類動物(例如，狒狒、猴子和黑猩猩)和家庭寵物(例如，狗和貓)。可使用任何本領域已知的技術將轉基因導入動物中以產生轉基因動物的建立者系(founderlines)。這些技術包括，但不限於前核顯微注射(美國專利No.4,873,191);逆轉錄病毒介導的向種系中的基因轉移(VanderPutten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA82:6148，985);向胚胎幹細胞中的基因導向(Thompson等，Cell56:313,1989);和胚胎的電穿孑L(Lo，Mol.Cell.Biol.3:1803,1983)。特別有用的是Yang等(Proc.NatlAcac.Sci.USA94:3004-3009,1997)中所述的方法。為回顧可用於產生和評估轉基因動物的技術，技術人員可參考Gordon(Intl.Rev.Cytol.115:171-229，1989)，並且可以從例如:Hogan等ManipulatingtheMouseEmbryo,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY,1986);Krimpenfort等(Bio/Technology9:86，1991)，Palmher等(Cell41:343，1985)，Kraemer等(GeneticManipulationoftheEarlyMammalianEmbryo,ColdSpringI-larborPress,ColdSpringHarbor,NY,1985),Hammer等(Nature315:680，1985)，Purcel等(Science:244:1281，1986),Wagner等(美國專利No.5,175,385)和Krimpenfort等(美國專利No.5,]75，384)獲得其它指導。實施例本發明部分通過下述實施例進4亍舉例說明，其不被一見為以任4可形式限制本發明。實施例1.鑑定天然Wnt配體對HCC生長的抑制方法勿應^面//S屍G的斜備和遞《艱腐潛^^的為、斂在10%FBS(Sigma,St.Louis,MO)MEM(Mediatech，Hemdon,VA，USA)中培育Huh7細胞至70%鋪滿。溫育後24小時將培養基改變為0%FBSMEM,並在0.1%FBSMEM中使用或不使用肝素(50ug/ml)處理細胞12小時。用冰冷的PBS洗滌細胞5次，在Tris緩沖的鹽水/m)TA中用結晶化的胰蛋白酶(20ug/ml)於冰上孵育細胞層10分鐘。加入終濃度100ug/ml的大豆胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶活性。通過4°C下400xg離心5分鐘從胰蛋白酶消化產物(trypsinate)中除去被汙染的細胞。對胰蛋白酶消化產物進行肝素瓊脂糖層析。簡要的，4。C下用肝素(4%)瓊脂糖^朱子孵育胰蛋白酶消化產物過夜，並通過2000xg離心4分鐘收集珠子，用20體積的PBS中的0.1MNaCl洗滌珠子。用PBS中的0.25、0.5、0.75和1.0MNaCl收集洗脫的級分。二舉凝履*泳，嚴力潘化("/"-ge/d/geW/owJ#口應通過沉澱和用IPG緩沖液再水合製備來自肝素瓊脂糖層析的分級樣本以用於等電聚焦(IEF)。根據製造商的步驟使用ZOOMIPGRunner(Invitrogen,Carlsbad,CA)進行IEF。用樣本再水合ZOOM條帶(pH3-10)過^復，然後如下進4亍階3夭式電壓在牛線上升(stepvoltageramping)方法200V20分鐘，450V15分鐘，750V15分鐘和2000V120分鐘。對聚焦的凝膠進行SDS-PAGE,使用ZOOM凝膠(Invitrogen)作為第二維電泳。電泳後，使用SilverQuest銀染試劑盒(Invitrogen)染色凝膠。從銀染凝膠切下的蛋白斑點被脫色和乾燥，然後用序列級別的改良的胰蛋白酶(Promega，Madison,WI)酶促消化。胰蛋白酶消化的肽一皮脫鹽和用ZipTipcl8(Millipore，Bedford,MA)濃縮。濃縮的月夷蛋白酉爭消化的肽^皮用於SENDProteinChip和使用PBSII(Ciphergen,Fremont,CA)進行肽作圖。通過程序ProteinProspector中的資料庫搜索工具MS-fit進行肽質量指紋鑑定，該搜索工具可從hUp:Z/prospector.ucsf.ecki獲得。基於斑點在2-D凝膠上的位置對初始搜索進行若干限制物種=人，pi範圍=6-9.5,質量範圍=35—50kDa。用TRIzolReagent(Invitrogen)從HepG2、Hep3B、Huh7和Focus細胞系中提取總細胞RNA。釆用用於RT-PCR的第一鏈cDNA合成試劑盒(AMV)(RocheDiagNOtics,Indianapolis,IN)用隨機六聚物(randomhexamers)和AMVRT從250ng的總RNA在20|al反應混合物中合成第一鏈cDNA。在熱循環4義(M〕ResearchInc.,Waltham，MA)中使用50ng的cDNA和高保真PCRMaster(RocheDiagNOtics)進行PCR。每個Wnt配體的引物對列於下面表1中。每個引物的終濃度為250nM。在94°C初始變性4分鐘之後，反應進行35個循環的下述熱程序94°C30秒，55°C30秒，和72°C1分鐘，然後在72°C下進行最後的延伸步驟10分鐘。擴增產物在溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠上進行分析。^r-PO為Vf如上所述進行肝組織和HCC細胞系的總RNA提取和RT反應。為測定Wnt3、Wnt11和FZD7的mRNA表達水平，使用iCycleriQMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystem(Bio-Rad，Hercules,CA)用由SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)、400nM每種引物、和5ng來自未知樣本的cDNA(相等的總RNA)組成的混合物進行qR丁-PCR。熱循環條件包括初始步驟95。CIO分鐘，然後是40個循環的95。C15秒，60°C30秒和72。C30秒。Wnt3、Wntl、FZD7和18SrRNA的？1物序列如下(1)Wnt3,5，-ACTTCGGCGTGTTAGTGTCC-3，(正向)(SHQ11)NO:68)和5,-CATTTGAGGTGCATG丁GGTC-3，(反向)(SEQ11)NO:69);(2)Wntll,5'-TTCCGATGCTCCTATGAAGG-3，(正向)(SEQIDNO:70)和5，-AGACACCCCATGGCACTTAC-3，(反向)(SL:QI[)NO:71);(3)FZD7,5'-GCCGCTTCTACCAC八G八CT-3，(正向)(SP:QIDNO:72)和5,-TTCATACCGCAGTCTCCCC-3，(反向)(SEQIDNO:73);(4)18SrRNA，5'-GGACACGGACAGGATTGACA-3，(正向)(SEQII)NO:74)和5,-ACCCACGGAATCGAGAAAGA-3，(反向)(SEQII)NO:75)。對於Wnt3而言，擴增子的大小為130bp，對於Wntll為133bp，對於FZD7為54bp，和對於18SrRNA為50bp。通過J.5%瓊脂糖凝膠電泳和澳化乙錠對PCR產物顯像後，切下PCR產物，克隆到pCR2.1栽體(Invitrogen)中。使用T7正向和M13反向引物進行雙向測序。確認核苷酸序列之後，將每種PCR產物的10倍稀釋物克隆到pCR2.1載體中制定實時PCR的標準。在與每個基因的標準曲線比較後，通過測量Ct值，隨後標準化至18SrRNA,定量未知樣本中Wnt3、Wntll和FZD7mRNAs的拷貝數。進行重複實驗。l在和友ff""yl6的*備由於來自人Wnt3質粒C末端的22個胺基酸在原始質粒(22)中缺失，所以使用三輪基於人Wnt3序列的PC.R擴增將它延伸為全長序列，其中人Wnt3通過Hincim和F:coRI限制性酶切位點克隆到pcDNATM3.1/myc-HisA(Invitrogen)中。引物序列為5'-TAGTTAAGCTTACCATGGAGCCCCACCTGCTC-3'(正向)(SEQIDNO:76),向-l)(SEQIDNO:77)，向-2)(SEQIDNO:78)，ACA-3，(反向—3)(SEQIDNO:79)。製備針對合成肽的兔多克隆抗體，所述合成肽相當於人Wnt3的胺基酸259—274(25YRAKYSLFKPPTCRDL271)(S1':QI[)NO:80)。該肽序列與Wnt家族的其它成員或其它已知蛋白沒有明顯的同源性。抗體的特異性通過Western印跡分析驗證，所述分析使用用myc標記的Wnt3質粒轉染的HCC細胞系。Hep3B，Huh7和Focus細胞系生長於MHM中，該培養基補充有10%FBS和IX極限必需培養基非必需胺基酸溶液(Sigma)。因為p-聯蛋白基因中的缺失突變(31),HepG2細胞被排除在外。根據生產商的指示使用LipofectAMINE2000(Invitrogen)或TransIT-LTl(Mims，Madison,WI)在70%鋪滿時進行轉染試驗。用pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH轉染細胞後(32),使用LuciferascAssaySystem(Promega，Madison,Wl)分析Tcf轉錄活性。用卩-半乳糖苷S爭活性作為轉染對照對焚光素酶活性的原始數據進行標準化。實驗一式三份的進行，重複三次以驗證結果。77CC勿應『"di^4這的放^用pcDNA3.1/myc-HisA(對照質粒)或Wnt3質粒，pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH,和卩-半乳糖苷酶質粒轉染HCC細胞。轉染後24小時，用0%FBSMEM孵育細胞24小時，然後用1%FBSMEM進行刺激。在刺激後2小時和24小時收集細胞，進行Wnt3和)3-聯蛋白的螢光素酶分析和Western印跡分析。在『wd我體的放果對於阻斷試驗，將細胞接種到12孔平板中，用如上所述的pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH和p-半乳糖芬酶質粒進行轉染。血清飢餓24小日寸後，細胞用含有抗Wnt3Ab或對照Ab(10pg/ml)的1%FBSMEM溫育，溫育24小時之後進行收集。採用正常的兔IgG(Upstate，Waltham,MA)作為對照抗體。對照siRNA和Wnt3siRNA(WNT3-1:5,-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3，(SEQIDNO:81)，WNT3-2:5'-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3，(SEQIDN:82),WNT3-3:5，-GGCUUAUCUUUGCACAUGIJ-3，(SEQIDNO:83))購自Ambion(Austin,TX),以10或100nM的濃度，和pSUPKR8xTOPFL八SI1或pSUPLiR8xl'，OP「LASII和p--半乳糖芬fi爭質粒一起，使用TransIT-LTl或DharmaFECT4(Dharmacon,Chicago,IL)轉染入HCC細胞。轉染後48小時，分別通過qRT-PCR和螢光素i酶分析檢測Wnt3的mRNA表達水平和Tcf轉錄活性。逸錄在W"/J^"務口,奮合/^參詢Focus細胞鋪板於6孔平板中。用無菌的塑料200)il微量移液管尖端損傷鋪滿的單層細胞。然後用含有抗Wnt3Ab或兔IgG的培養基處理細胞，在不同時間點拍照。,曾《伊遊為、浙為提取總蛋白，將細胞在含有蛋白酶抑制劑(RocheDiagNtics)的溶胞緩衝液(30mMTris,pH7.5,150mM氯化鈉，1%NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS,10%甘油和2mMEDTA)中同質化並進行超聲處理。使用BCAProteinAssayKit(Pierce,Rockford,IL)以BSA為標準確定蛋白濃度。等量的蛋白(150]ug)用12-15%SDS-PAGE分開，並轉移到PVDF膜(PerkinElmer，Wellesley,MA)。膜用含有0.1%Tween20的Tris緩衝鹽水中的5%BSA封閉，然後在4°C下用1:1000稀釋的小鼠單克隆4元mycAb(SantaCmzBiotechnologyInc.,SantaCruz，CA)、1:200稀釋的兔多克隆抗Wnt3Ab、1:1000稀釋的小鼠多克隆抗(3-聯蛋白Ab(TransductionLaboratories,SanDiego,CA)、或1:2000稀釋的兔多克隆抗hsp90Ab(SantaCmzBiotechnologyInc.)培養過4艾。用含有0.1%Twcen20的Tris緩衝的鹽水洗滌後，膜在室溫下用1:10000稀釋的第二HRP抗體溫育1.5小時，並用化學發光成像WesternLightning(PerkinElmer)顯像。乂//CC邀歡17對HCC和相匹配、未受累的、腫瘤周圍(pcritumoral)肝組織得自南韓和南非。12對樣本來自接受手術切除的韓國病人。12名患者中9個是男性，中位數年齡為52歲(範圍從22歲-67歲)。11名患者是B肝表面抗原(HbsAg)陽性，餘下的一名患者的病因不明。7名患者(58%)具有潛在的肝硬化。5個肝組織來自因為結腸直腸癌向肝臟的單個轉移而進行肝臟切除的韓國患者，該5個肝組織被用作正常肝組織的對照。4名患者是男性，中位數年齡為46歲(範圍從37歲-57歲)。組織學檢查在周圍的腫瘤周圍肝組織中沒有顯示任何病理。p_聯蛋《的兌^i^織化學曱醛固定、石蠟包埋的切片在二曱苯中脫石蠟，並通過降低乙醇濃度再水合。將切片浸於10mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中，在微波爐中煮沸10分鐘，室溫冷卻以恢復表位。隨後根據生產商的指示使用UniversalDakoCytomationLSAB+Kit,Peroxidase(I)AKOCorp"Carpinteria，CA)處理載玻片。通過用3%過氧化氫和EndogenousAvidin/BiotinBlockingKit(ZymedLaboratoriesInc.,SouthSanFrancisco,CA)醉育阻斷內源過氧化物酶、抗生物素蛋白和生物素的活性。切片在4。C下用1:500稀釋的抗人p-聯蛋白單克隆Ab孵育過夜。作為陰性對照，用PBS替換第一抗體。卩-聯蛋白的表達模式根據核染色的存在分為兩類。胂瘤組織中的細胞質染色也與腫瘤周圍組織中的進行比4交。對"-農奢^差/^外i子-J的關'^為Vi通過Wong等(1)的方法並加以修改來分析P-聯蛋白基因的外顯子3突變。簡要的，使用ExpandHighFidelityPCRSystem(RocheDiagNOtics)從來自HCC和周圍的胂瘤周圍組織的cDNA(50ng)擴增P-聯蛋白基因外顯子3的218bp片段。引物的序歹'J為5'-GATTTGATGGAGTTGGACATGG-3,(正向)(SHQIDNO:84)和5，-TGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3，(反向)(SEQIDNO:85)。熱循環條件包括94°C3分鐘的起始變性步驟，然後是35個循環的95°C30秒，58°C30秒和72°C30秒。PCR產物顯像後，將PCR產物克隆到pCR2.1載體(lnvitrogen)中，隨後使用T7正向和M13反向引物測序。測序分析每個PCR產物的至少5個克隆。結果在細應屑—#定^紀體由於Wnt蛋白主要與細胞表面的ECM相聯，嘗試在Huh7中以聯合的形式純化包含一種或多種Wnt蛋白的細胞表面HSPG。通過胰蛋白酶製備的Huh7-HSPG被用於肝素-瓊脂糖親和樹脂以進行預分級。洗脫的級分進行SDS-PAGE,並比較用肝素處理的和不用肝素處理的樣本的蛋白帶。從0.25MNaCl洗脫的級分中，在未用肝素處理的級分中可分辨出大約45kDa的蛋白帶(未顯示數據)。由於Wnt蛋白的預期分子量在35-45kDa的範圍中，認為該蛋白帶很可能包括Wnt蛋白。為定義該蛋白帶，進行二維電泳。如圖1A所示，有幾個銀染蛋白斑,與、，顯示用肝素處理和不用肝素處理的樣本間不f司蛋白表達水平。35-55kDa和pl5_9.5的蛋白斑點被認為是Wnt配體蛋白的候選物。研究在未用肝素處理的樣本中上調的兩個蛋白斑點，因為Wnt蛋白可以通過肝素處理釋放。從銀染的二維凝膠上切下的蛋白斑點被用於膠內消化，然後通過質語分析進行肽作圖。數據分析顯示九個肽與人Wntll蛋白相匹配，如圖IB所示。為進一步確證這個發現，通過RT-PCR檢測HCC細胞系中WntmRNA的表達，其使用19對特異於所有已知的人Wnt配體的引物。如圖1C所示，全部19個被4全測的Wnt基因中，只有Wnt3和Wntl1mRNA在HCC細胞系中表達。通過RT-PCR沒有4全測到其它已知的WntmRNAs。在HCC細月包系中鑑定了Wnt3和Wntl1後，使用定量實時RT-PCR(qRT-PCR)分析才企測HCC細胞系中mRNA的表達水平。HCC細胞系中Wnt3mRNA的表達水平(平均值士SE)為在HepG2中每10918S核糖體RNA(18SrRNA)370.0±10.3，在Hep3B中每10918S核糖體RNA381.3±2.7，在Huh7中每10918S核糖體RNA95.2±6.3，和每10918S核糖體RNA210.4士9.5個拷貝。WntllmRNA的表達水平為在HcpG2中每l918SrRNA8，499.3土845.0，在Hcp3B中每10918SrRNA290.9±40丄和在Iiuh7細胞中每10918SrRNA3.57±0.2個拷貝。通過實時RT-PCR無法在Focus細胞中檢測到WntllmRNA，這與常規RT-PCR的結果一致(圖2B)。人//CC邀織中、W"〃/#口/'，ZD7m/《AM的43當將截止水平定義為正常肝組織中平均值士3SI)時，17個HCC中的13個(76.5%)和17個腫瘤周圍組織中的10個(58.8%)與正常對照相比顯示增高的Wnt3mRNA的表達水平。只有1個腫瘤周圍組織與正常肝組織相比顯示表達降低。17對樣本中，12對(70.6%)顯示腫瘤與相應的腫瘤周圍組織相比Wnt3mRNA的表達增力口，但它不是統計學上顯著的(Wilcoxon符號秩檢驗的P=.435)(圖3A)。與Wnt3相反，17對配對樣本中的11對(64.7%)顯示腫瘤與相應腫瘤周圍組織相比WntllmRNA的表達降低，其也不是統計學上顯著的(Wilcoxon符號秩檢驗的P=.227)。然而，17個腫瘤組織中的7個(41.2%)顯示表達水平降至甚至低於正常肝組織的較低截止水平，但是在腫瘤周圍組織中沒有一個降低(Fischer精確檢驗的P=.0036)。17個腫瘤組織中有5個(29.4%)顯示與正常肝組織相比增高的WntllmRNA表達水平，而17個肺瘤周圍組織中有9個(52.9%)顯示與正常肝組織相比增高的Wntl1mRNA表達水平。HCC和腫瘤周圍組織都在17個樣本中的10個(58.8%)中顯示與正常肝組織相比增高的FZD7mRNA表達(圖3B)。17對成對樣本中的12對(70.6%)顯示腫瘤與相應的胂瘤周圍組織相比FZD7mRNA的表達增高，這個差別是統計學顯著的(Wilc函n符號秩檢驗的P=.031)(圖3C)。免疫組織化學染色顯示17個HCC組織中7個(41%)出現P-聯蛋白的細胞核積聚。在周圍的腫瘤周圍組織中沒有P-聯蛋白的細胞核積聚(圖4)。所有7個具有P_聯蛋白細胞核積聚的樣本也顯示細胞質中卩-聯蛋白的染色增強。沒有卩-聯蛋白細胞核積聚的IO個腫瘤組織中，1個樣本顯示與其相應的肺瘤周圍組織相比(3-聯蛋白的細胞質染色增加。通過測序分析，在17個HCC樣本中的4個(23.5%)中發現(3-聯蛋白基因的外顯子3突變，但在周圍的腫瘤周圍組織中一個也沒有。它們都是影響密碼子35、37和45的單個錯義突變(兩個135S、一個S37C和一個S45F)。通過免疫組織化學染色顯示|3-聯蛋白細胞核積聚的7個樣本中，有3個(42.9%)在負責卩-聯蛋白磷酸化和遍在蛋白化的區域具有突變。在卩-聯蛋白基因中具有突變(I35S)但沒有P-聯蛋白的細胞核積聚的一個樣本在免疫組織化學染色中細胞質染色增強。餘下的所有4個有p-聯蛋白細胞核積聚但P-聯蛋白基因沒有4壬何突變的樣本與成對的腫瘤周圍組織相比FZD7mRN八水平增高。FZD7mRNA水平與正常肝組織的平均值相比也增加了7-74倍。^f旦是，Wnt3和/或Wntl1的mRNA表達水平與P-聯蛋白的細胞核積聚無關。//CC勿應屑#『""d在這的放果為確定HCC中Wnt對經典Wnt途徑的影響，在用Wnt3質粒轉染後檢測T細胞因子(Tcf)轉錄活性的改變。用Wnt3質粒轉染導致mRNA和蛋白的表達水平都明顯增加(未顯示數據)，如圖5A中所示。與對照相比，Focus細胞中Tcf的轉錄活性也顯示增加約3倍，這在統計學上是顯著的(P<0.01)。然而，Tcf轉錄活性在Hep3B細胞中沒有改變，在Huh7細胞中甚至降低，特別是在刺激後24小時(圖5B)。與這些結果相一致的是，正如Western印跡分析所顯示的，用Wnt3質粒轉染後Focus細胞中細胞卩-聯蛋白水平增高，但是在Hep3B或Huh7細胞中則沒有改變或降低(圖5A)。遞d我減w'/M^乂,在『w-f傳^然後，檢測抗Wnt3Ab或siRNA對HCC細胞系中經典途徑的抑制效果，因為與Focus細胞相比，Huh7和Hcp3B細胞中Tcf轉錄活性和細胞P-聯蛋白水平的基線已經很高(圖5)。用多克隆抗Wnt3Ab孵育導致Huh7中螢光素酶活性降低60%,Hep3B中降低26%,Focus細胞中降低40%(圖6A)。為證實對經典途徑的這一抑制效果，使用針對Wnt3的siRNA。首先，使用qRT-PCR分析評估在Huh7和Hep3B細月包中3種不同類型的siRNA的抑制效力。發現siRNAWm3-3最有效力(未顯示數據)，其在100nM濃度時mRNA水平平均降低50-60%(圖6B)。與mRNAs的這些降低相一致的是，Huh7中Tcl'轉錄活性也降低48.5%，在Hep3B中降低33%，在Focus細胞中降低43.5%(圖6C)。因此，結論是Wnt3的抑制可以導致HCC細胞系中經典途徑的抑制。//CCi砂應哞在『""治^f乂,務口#合的放果還研究Tcf轉錄活性的抑制是否能夠導致HCC細胞行為的功能性改變。使用Focus細胞的傷口癒合分析顯示用抗Wnt3Ab處理的細胞中傷口癒合延遲，這些改變在24h時最明顯。在24h時，在用對照Ab處理的Focus細胞中大部分創傷被遷移的和/或增殖的細胞覆蓋，但在用抗Wnt3Ab處理的細胞中它繼續存在(圖7)。這個研究分析了肝和HCCs中Wnt配體的表達模式。使用常規RT-PCR和qRT-PCR方法，發現大部分被檢驗的HCC細胞系表達Wnt3和WntllmRNA。也可以使用蛋白質組學技術在其蛋白水平證明Wntll的表達。與HCC細胞系中的這些觀察相一致的是，在包括HCX在內的人肝組織中也證實了Wnt3和Wntl1mRNA的表達。在包括HCC和相應的腫瘤周圍組織在內的人肝組織中確定Wnt3、Wntll和FZD7的表達沖莫式。腫瘤組織中FZD7的mRNA水平高於相應的腫瘤周圍組織和正常肝組織中的水平。雖然HCC和腫瘤周圍組織之間的Wnt3mRNA表達沒有統計學上顯著的差異，但是71%的HCC與它們對應的腫瘤周圍組織相比顯示增高的Wnt3表達。此外，77%的HCC和59%的胂瘤周圍組織顯示Wnt3mRNA表達水平高於正常肝臟組織中的平均值士3SD。這些發現表明Wm3的上調可以是肝癌形成期間的早期事件，和/或在肝臟炎症和壞死期間的肝細胞再生中起重要作用。此外，65%的成對HCC樣本顯示腫瘤與對應的肺瘤周圍組織相比WntllmRNA的表達降低。41%的腫瘤組織顯示Wntl1表達水平甚至降低至低於正常肝組織的較低截止水平。這些發現與Wnt1作為經典途徑抑制劑的作用相一致。還發現Wnt3過表達激活了Focus細胞中的經典Wnt途徑，其跡象是Tcf轉錄活性增加了3倍和細胞卩-聯蛋白水平增高。然而，Hep3B細胞中Tcf轉錄活性沒有改變，在Huh7細胞中甚至略微降低，即使Wnt3mRNA和蛋白的表達在轉染後明顯增高。多克隆抗Wnt3Ab或siRNA對Wm3的抑制降低了所有3種HCC細胞系中的Tcf轉錄活性。在具有最高基線Tcf轉錄活性的Huh7細胞中這些改變最為顯著。此外，用抗Wnt3Ab處理Focus細胞抑制傷口癒合，這表明這種抑制的功能性結果是降低細胞遷移和增殖。在17個HCC組織中的8個(47%)中觀察到P-聯蛋白的細胞核和/或細胞質積聚，其中一半的例子具有卩-聯蛋白基因突變。餘下的4個具有(3-聯蛋白積聚但沒有突變的例子在腫瘤中具有明顯增高水平的FZD7，這表明FZD7的上調直接關係到這些腫瘤中經典Wnt信號傳導途徑的激活。Wnt3或Wntll的表達水平與f3-聯蛋白積聚或FZD7的表達水平都不相關。總之，在HCC細胞系和包括HCC組織在內的人肝組織中鑑定到Wnt3和Wntl1。與正常肝組織相比，HCC和腫瘤周圍組織中的Wnt3mRNA表達水平都上調。HCC組織中WnU1mRNA表達下調。通過抗Wnt3Ab或siRNA抑制Wnt3導致經典Wnt信號傳導途徑的降低，並降低傷口癒合，但是Wnt3刺激增加Focus細胞中的Tcf轉錄活性。這些發現表明Wnt3是天然的Wnt配體，其與肝癌形成期間FZD7的過表達和經典Wnt信號傳導途徑的激活且不涉及(3_聯蛋白突變有關。參考文獻1.Davila,J.A.，Morgan,R.O.,Shaib，Y.,McGlynn，K.A.，和I':l-Serag,H.B.2004.HepatitisCinfectionandtheincreasingincidenceofhepatocellularcarcinoma:apopulation-basedstudy.Gastroenterology127:1372-1380.2.Du，S丄，Purcell，S,M.，Christian,J丄"McGrcw，L丄.，和Moon,R.T.1995.IdentificationofdistinctclassesandfunctionaldomainsofWntsthroughexpressionofwild-typeandchimericproteinsinXenopusembryos.MolCellBiol15:2625-2634.3.Liang,H.,Chen,Q.,Coles,A,H.，和erson,S丄，Pihan，G.，Bradley,A.，Gerstein，R.,Jurecic，R.,andJones,S.N.2003.Wnt5ainhibitsBcellproliferationandfunctionsasatumorsuppressorinhematopoietictissue.CancerCell4:349-360.4.Maye，P"Zheng,J.，Li,L.,和Wu,D.2004.MultiplemechanismsforWnU1-mediatedrepressionofthecanonicalWntsignalingpathway.JBiolChem279:24659-24665.5.Iozzo,R.V"Eichstctter，I.,和Danielson,K.G.1995.AberrantexpressionofthegrowthfactorWnt-5Ainhumanmalignancy.CancerRes55:3495-3499.6.Lejeune,S.,Huguet,E丄.，Hamby,A.,Poulsom,R.,和Harris,A丄.1995.Wnt5acloning,expression,andup-regulationinhumanprimarybreastcancers.ClinCancerRes1:215-222.7.Weeraratna,A.T.，Jiang,Y.,Hostetter，G"Rosenblatt,K.,Duray,R,Bittner,M.,牙口Trent,J.M.2002.Wnt5asignalingdirectlyaffectscellmotilityandinvasionofmetastaticmelanoma.CancerCell1:279-288.8.Kinzler，K.W.，和Vogelstein,B.1996.Lessonsfromhereditarycolorectalcancer.Cell87:159-170.9.Devereux，T.R.,Stern,M.C.，Flake,G.P.，Yu,M.C.，Zhang,Z.Q.,London,S丄,和Taylor,J.A.2001.CTNNB1mutationsandbeta-cateninproteinaccumulationinhumanhepatocellularcarcinomasassociatedwithhighexposuretoaflatoxinBl.MolCarcinog31:68-73.10.Hsu,H.C.,Jeng,Y.M.,Mao,T丄.，Chu,J.S.,Lai，P丄.，和Peng,S.Y.2000.Beta-cateninmutationsareassociatedwithasubsetoflow-stagehepatocellularcarcinomanegativeforhepatitisBvirusandwithfavorableprogNOis.AmJPathol157:763-770.11.Wong,C.M.,Fan,S.T.,和Ng，I.O.2001.beta-Cateninmutationandoverexpressioninhepatocellularcarcinoma:clinicopathologkandprogNticsignificance.Cancer92:136-145.12.Huang,H.，Fujii,H.,Sankila,A,,Mahler-Araujo，B.M.,Matsuda，M.,Cathomas，(i,和hgaki,H.1999.Bcta-caleninmutationsarcfrequentinhumanhepatocellularcarcinomasassociatedwithhepatitisCvimsinfection.AmJPathol155:1795-1801.13.Laurent-Puig，P.,Legoix，R，Biuteau,.,Belghiti,J.，Franco,D.,Binot，F.,Monges,G.,Thomas,G.,Bioulac-Sage,R，和Zucman-Rossi,J.2001.Geneticalterationsassociatedwithhepatocellularcarcinomasdefinedistinctpathwaysofhepatocarcinogenesis.Gastroenterology120:1763-1773,14.Satoh,S.,Daigo,Y"Fumkawa,Y.,Kato,T"Miwa,N.,Nishiwaki:T"Kawasoe,T"Ishiguro,H.,Fujita,M"Tokino，T.，等2000.AX腿mutationsinhepatocellularcarcinomas,andgrowthsuppressionincancercellsbyvims-mediatedtransferofAXIN1.NatGenet24:245-250.15.Merle，R，delaMonte，S.，Kim,M.，Herrmann,M.,Tanaka，S.，VonDemBussche,A.,Kew,M.C.,Trepo，C.，和Wands,J,R.2004.Functionalconsequencesoffrizzled-7receptoroverexprcssioninhumanhepatocellularcarcinoma.Gastroenterology127:1110-1122.16.Merle,P.,Kim,M.,Herrmann,M.，Gupte,A.,Lefrancois,L.,Califano,S.,Trepo,C.，Tanaka，S.，Vitvitski，L.,Monte，S.D.，等2005.Oncogenicroleofthefrizzled-7/beta-cateninpathwayinhepatocellularcarcinoma.JHepatol.17.Lin，X.,和Perrimon，N.1999.DallycooperateswithDrosophilaFrizzled2totransduceWinglesssignalling.Nature400:281-284.18.Willert，K.,Brown,J.D.,Dancnberg,F…I)uncan，A.W.,Weissman,l丄.，Reya,T.,Yates,J.R.，3rd，禾口Nusse，R.2003.Wntproteinsarelipid-mdifiedandcanactasstemcellgrowthfactors.Nature423:448-452.19.Bradley,R.S.，和Brown,A.M.1990.Theprolo-oncogeneint-1encodesasecretedproteinassociatedwiththeextracellularmatrix.EmboJ9:1569-1575.20.Reichsman,I7.,Smith,L.，和Cumbcrledge,S.19%.Glycosaminoglycanscanmodulateextracellularlocalizationofthewinglessproteinandpromotesignaltransduction.JCellBiol135:819-827.21.Dhot,G.K.,Gustafsson,M.K"Ai,X.，Sun,W.，Standiford,D.M.:和Emerson,C.R,Jr.2001.RegulationofWntsignalingandembryopatterningbyanextracellularsulfatase.Science293:]663-1666.22.Roelink，H.，Wang,J,,Black,D.M.，Solomon,H.，和Nusse，R.1993.Molecularcloningandchromosomallocalizationto17q21ofthehumanWNT3gene.Genomics17:790-792.23.Shimizu,H.，Julius,M.A.,Giarre,M.,Zheng,Z.，Brown,A.M.,和Kitajewski,J.1997.TransformationbyWnifamilyproteinscorrelateswithregulationofbeta-catenin.CellGrowthDiffer8:1349-1358.24.Katoh,M.2001.MolecularcloningandcharacterizationofhumanWNT3.IntJOncol9:977-982.25.Gregorieff，A.，Pinto,D.，Begthel,H.，Destree，O.,Kielman，M.,和Clevers,H.2005.ExpressionpatternofWntsignalingcomponentsintheadultintestine.Gastroenterology129:626-638.26.Kirikoshi，H.，Sckihara,H.,和KaU)h,M.2001.MolecularcloningandcharacterizationofhumanWNTl1.JmJMlMed8:65卜656.27.Zhu,H.,Mazor,M.,Kawan，Y"Walker,M.M.,Leung,H.Y.，Armstrong,K.,Waxman,J.,和Kypta,R.M.2004.AnalysisofWntgeneexpressioninprostatecancer:mutualinhibitionbyWNT〗1andtheandrogenreceptor.CancerRes64:7918-7926.28.Smolich,B.D.,McMahn，J.A.,McMahon,A.P.,和Papkoff，J.1993.Wntfamilyproteinsaresecretedandassociatedwiththecellsurface.MolBiolCell4:1267-1275.29.Cha，M.Y.,Kim,C.M.,Park,Y.M.,和Ryu，W.S,2004.HepatitisBvimsXproteinisessentialfortheactivationofWnt/beta-cateninsignalinginhepatomacells.Hepatology39:1683-1693.30.Veeman，M.T"Slusarski，D.C.，Kaykas，A.，I乂)uie，S.H.,禾口Moon,R.T.2003.Zebrafishprickle,amodulatorofnoncannicalWnt/Fzsignaling,regulatesgastruladonmovements.CurrBiol13:680-685.31.Carruba,G.,Cervello,M.,Miceli,M.D.,Farmggio,R.,Notarbartolo,M.,Virruso,L.,Giannitrapani,L.，Gambino,R.,Montalto,G.,禾口Castagnetta，L.1999.Truncatedformofbeta-cateninandreducedexpressionofwild-typecateninsfeatureHepG2humanlivercancercells.AnnNYAcadSci886:212-216.32.Korinek，V.,Barker,N.，Morin,RJ.，vanWichen,D.,deWeger,R.,Kinzler，K,W.,Vogelstein，B,，和Clevers,H.1997.Constitutivetranscriptionalactivationbyabeta-catenin-TcfcomplexinAPC-/-coloncarcinoma.Science275:1784-1787.tableseeoriginaldocumentpage68tableseeoriginaldocumentpage69已經描述了大量本發明的實施方式。然而，應理解在不違背本發明的精神和範圍的情況下可以進行各種修改。因此，其它實施方式在下述權利要求的範圍中。權利要求1.鑑定抗癌劑的方法，該方法包括選擇與多肽結合的測試化合物，所述多肽包含Wnt3、Wnt8b或Wnt11蛋白的胺基酸序列或其FZD結合片段，和檢測測試化合物是否能夠(i)降低細胞中的Wnt/FZD7信號傳導；(ii)降低肝癌細胞移動性；(iii)降低肝癌細胞中β-聯蛋白的積聚；或(iv)在體外或體內治療肝癌；其中能夠達到(i)到(iv)中至少一項的測試化合物是抗癌劑。2.權利要求l的方法，其中測試化合物的選擇包括將測試化合物與多肽接觸，所述多肽含有Wnt3、Wnt8b或Wnt11蛋白的胺基酸序列或其FZD結合片段；檢測多肽與測試化合物間的結合；和如果所述測試化合物與多肽結合，則選擇該測試化合物。3.權利要求1或2的方法，其中將所述多肽作為下列提供(i)天然存在的多肽；(ii)重組多肽；(iii)在細胞表面表達的多肽；或(iv)分離的多肽。4.權利要求1或2的方法，其中多肽包含Wnt3蛋白的胺基酸序列。5.權利要求4的方法，其中所述胺基酸序列含有SEQII)NO:8到12中任何一個和至少一個非Wnt序列。6.權利要求1或2的方法，其中所述多肽包含Wntl]蛋白的胺基酸序列。7.權利要求6的方法，其中所述胺基酸序列含有SEQIDNO:22到26中任《可一個和至少一個非Wnt序列。8.通過權利要求1-7任一項的方法所鑑定的化合物用於治療肝癌。9.權利要求8的化合物用於治療肝癌，其中所述化合物為(i)抗Wnt抗體；或(ii)FZD7受體或其Wm結合片段。10.通過權利要求1-7任一項的方法所鑑定的化合物在製備用於治療肝癌或降低患者中肝癌細胞移動性的藥物中的用途。11.與WnG、8b或11結合併由此降低患者細胞中Wnt/FZD7信號傳導的化合物在製備用於治療肝癌或降低患者中肝癌細胞移動性的藥物中的用途。12.權利要求11的用途，其中所述化合物是抗Wnt3抗體。13.權利要求12的用途，其中所述抗Wnt3抗體與含有胺基酸序列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQIDNO:80)的多肽結合。14.降低Wnt3的表達並由此降低患者細胞中Wnt/FZD7信號傳導的化合物在製備用於治療肝癌或降低患者中肝癌細胞移動性的藥物中的用途。15.權利要求14的用途，其中所述化合物是降低患者中Wm3表達的siRNA。16.權利要求15的用途，其中所述siRNA包含選自下組的序列WNT3-1:5'-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3'(SEQII)NO:81)、WNT3畫2:5，-GGAGUGUAUUCGCAU(〕UAC陽3'(SEQIDNO:82)、和WNT3-3:5'-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3，(SEQIDN:83)17.鑑定候選抗癌劑的方法，該方法包含(a)提供第一多肽，所述第一多肽(i)含有FZD7多肽或其片段；和(ii)顯示Wnt結合能力;(b)提供第二多肽，所述第二多肽(i)含有Wnt3、Sb或ll多肽或其片段；和(ii)顯示FZD7結合能力；(c)在存在測試化合物的情況下，將所述第一和第二多肽接觸；和(d)將存在測試化合物時第一與第二多肽之間結合的水平與不存在測試化合物時的結合水平進行比較，其中存在測試化合物時與不存在時相比結合水平下降表明測試化合物是候選的抗癌劑。18.權利要求17的方法，其進一步包含(e)確定候選抗癌劑是否能夠(i)在表達FZD7的細胞中降低Wnt/FZD7信號傳導；(ii)降低癌細胞移動性；(iii)降低癌細胞中卩-聯蛋白的積聚；或(iv)在體外或體內治療癌症；其中能夠達到(i)至(iv)中至少一項的候選物是抗癌劑。19.權利要求17的方法，其中測試化合物選自下組多肽、核糖核酸、小分子和脫氧核糖核酸。20.權利要求17的方法，其中所述第一多肽是含有FZD多肽的第一融合蛋白，所述FZD多肽與(a)轉錄因子的轉錄激活結構域或(b)轉錄因子的DNA結合結構域融合；所述第二多肽是含有Wnt多肽的第二融合蛋白，所述Wnt多肽與(c)轉錄因子的轉錄激活結構域或(d)轉錄因子的DNA結合結構域融合，其中FZD多肽融合於與Wnt多肽所融合的結構域不同的結構域；並且根據轉錄因子的重構測定第一和第二多肽的結合。21.權利要求7的方法，其中所述第二多肽含有Wnt3多肽或其片段。22.權利要求17的方法，其中所述第二多肽含有SEQIDNO:8到12中任4可一個和至少一個非Wnt序列。23.權利要求17的方法，其中所述第二多肽含有Wmll多肽或其片段。24.權利要求17的方法，其中所述第二多肽含有SEQII〕NO:22到26中任何一個和至少一個非Wnt序列。25.通過權利要求17-24中任一項的方法所鑑定的候選抗癌劑或抗癌劑用於治療癌症。26.通過權利要求17-24中任一項的方法所鑑定的候選抗癌劑或抗癌劑在製備用於治療癌症的藥物中的用途。27.檢測肝細胞是否是癌細胞或具有成為癌細胞的風險的方法，該方法包含(a)提供測試肝細胞；(b)確定細胞的Wnt3表達水平是否高於對照細胞的Wnt3表達水平；和(c)如果測試細胞的Wnt3表達水平高於對照細胞的Wnt3表達水平，將測試細胞分類為癌細胞或具有成為癌細胞的風險。28.確定測試組織樣本是否來自患有肝癌或具有患肝癌風險的患者的方法，該方法包含0)提供從患者獲得的肝臟測試組織樣本；和(b)確定測試組織樣本中Wnt3的表達水平是否高於從健康個體中獲得的可比較的組織樣本中Wnt3的表達水平，其中測試樣本中表達水平較高指示患者患有癌症或具有患癌症的風險。29.權利要求27或28的方法，其中確定Wnt3的表達水平包括確定測試細胞或測試組織樣本中Wnt3mRNA的量。30.權利要求29的方法，其中使用Northern印跡分析或R'l'-PCR分析確定Wnt3mRNA的量。31.權利要求27或28的方法，其中確定Wnt3的表達水平包括確定測試細胞或測試組織樣本中Wnt3蛋白的量。32.權利要求31的方法，其中使用抗體確定Wnt3蛋白的量。33.權利要求32的方法，其中抗體與胺基酸序列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQIDNO:80)結合。34.權利要求27或28的方法，其進一步包括確定測試細胞或測試組織的Wntll表達水平是否低於對照細胞或對照組織的Wntll表達水平，其中Wntll表達水平較低指示(i)測試細胞是癌細胞或具有成為癌細胞的風險，或(ii)患者患有癌症或具有患癌症的風險。35.權利要求28的方法，其中(a)中所提供的組織樣本是腫瘤組織或肺瘤周圍的組織。36.權利要求28的方法，進一步包含(c)確定測試組織樣本中Wntll的表達水平是否低於從健康個體中獲得的組織樣本中Wntll的表達水平，其中Wntll的表達水平較低指示患者患有癌症或具有患癌症的風險。37.與胺基酸序列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQIDNO:80)結合的抗體。38.藥物組合物，其含有權利要求37的抗體和可藥用的載體。39.治療患者中癌症的方法，該方法包括向患有癌症或具有患癌症風險的患者施用有效量的含有權利要求37的抗體的組合物。40.權利要求39的方法，其中所述癌症是肝癌。41.治療患者中癌症的方法，該方法包括向患有癌症或具有患癌症風險的患者施用有效量的含有siRN八的組合物，所述siRNA含有選自下組的序列WNT3-1:5，-GGAAAAAUGCCACUGC八UC-3，(SEQIDNO:81),WNT3-2:5,-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3，(SEQIDNO:82)和WNT3-3:5，-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3'(SEQ1DNO:83)。42.權利要求41的方法，其中所述癌症是肝癌。43.治療患者中癌症的方法，該方法包括向患有癌症或具有患癌症風險的患者施用有效量的組合物，該組合物含有Wntl]多肽或編碼Wntll多肽的遺傳構建體。44.權利要求43的方法，其中將所述組合物直接原位施用於患者的肝臟。45.權利要求43的方法，其中所述癌症是肝癌。全文摘要本說明書除其它內容之外特別提供了使用Wnt和FZD蛋白、基因、FZD和Wnt特異性抗體和探針診斷和治療癌症、以及篩選測試化合物治療癌症的能力的方法。還公開了用於治療癌症，如肝癌的化合物。文檔編號G01N33/574GK101416058SQ200580039735公開日2009年4月22日申請日期2005年9月21日優先權日2004年9月21日發明者傑克·R·萬茲,米蘭·金申請人:羅德島醫院,終身合伙人