快速檢測和鑑定生物物體的方法

2024-01-26 03:57:15

專利名稱：快速檢測和鑑定生物物體的方法
技術領域：
本發明涉及快速檢測和鑑定環境、臨床或其它樣品中的生物體的方法。該方法提供了檢測和特徵分析任何生物體，包括細菌和病毒的獨特鹼基組合籤名(BCS)。這種獨特的BCS可用於快速鑑定該生物體。
背景技術：
快速和明確的微生物鑑定對各種工業、醫學、環境、質量和研究原因是需要的。傳統上，微生物學實驗室的功能是通過直接檢查和培養樣品來鑑定傳染性疾病的病原體。自從1980年代中期以來研究者們反覆證明了分子生物學技術在實踐上的用途，許多這些技術形成了臨床診斷試驗的基礎。這些技術中的一些包括核酸雜交分析、限制性酶分析、遺傳序列分析和核酸的分離及純化(參見，如J. Sambrook, E. F. Fritsch和T. Maniatis,分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。這些方法一般費時且冗長。另一選擇是聚合酶鏈式反應(PCR)，或其它擴增方法，根據所用側翼引物擴增特異性靶DNA序列。最後，檢測和數據分析可將雜交轉換成分析結果。其它檢測生物體的技術包括高解析度質譜(MS)、低解析度MS、螢光、放射性碘化、DNA晶片和抗體技術。這些技術中沒有一個是完全令人滿意的。質譜提供了被分析分子的詳細信息，包括很高的質量準確性。它也是一種可容易地自動化的方法。然而，高解析度MS單獨不能用來對未知的或生物工程改造的生物體進行分析，或運用於存在高背景水平生物體(「混亂的」背景)的環境中。低解析度MS不能檢測某些已知的生物體，如果它們的光譜線足夠弱或足夠接近樣品中其它活生物體的光譜線。具有特異性探針的DNA晶片只能夠測定具體的預計的生物體的存在與否。因為有幾十萬種良性細菌，一些細菌在序列上十分類似於有威肋的細菌，即使有10，000個探針的晶片陳列仍缺乏檢測具體生物體所需的寬度。抗體面對的多樣性限制比陳列更嚴峻。如果抗體設計是針對高度保守的靶子以提高多樣性，假報警問題就會是主要問題，還是因為危險生物體十分類似於良性生物體。抗體只能檢測相對不混亂環境中的已知生物體。一些研究中組報導了用高解析度電噴射離子化-傅立葉變換-離子迴旋共振質譜法(ESI-FT-ICR MS)檢測PCR產物。準確測定確切的質量與至少一種核苷的數量的知識相結合,可計算出大約100個鹼基對的PCR雙鏈體產物的總鹼基組成。(Aaserud等.，J. Am. Soc. Mass Spec. 7 :1266-1269,1966 ;Muddiman 等·，Anal. Chem. 69 :1543-1549,1997 ；Wunschel 等.，Anal. Chem. 70 :1203-1207,1998 ；Muddiman 等.，Rev.Anal. Chem. 17 :1-68,1998)。電噴射離子化-傅立葉變換-離子迴旋共振(ESI-FT-ICr)MS可通過平均分子質量來確定500喊基對雙鏈體，PCR產物的質量(Hurst等.，Rapid Commun. Mass. Spec. 10 377-382,1996)。已報導了採用基質-輔助的雷射解吸離子化飛行時間(MALDI-T0F)質譜來特徵鑑定 PCR 產物。(Muddiman 等.,Rapid Commun. Mass. Spec. 13 :1201-1204,1999)。然而，用MALDI只能觀察75個核苷以上的DNA的降解限制了此方法的應用。
美國專利5，849，492描述了挽回系統發育信息DNA序列的方法，包括搜索兩個高度保守片斷包圍的基因組DNA的高度趨異區段，設計了用PCR擴增此高度趨異區域的通用引物，用此通用引物經PCR技術擴增該基因組DNA，然後測是比基因序列以確定該生物體的身份。美國專利5，965，363公開了用質譜技術分析擴增的靶核酸來篩檢核酸多態性的方法，和提高這些方法的質量解析度及質量準確性的方法。WO 99/14375描述了通過質譜分析預選的DNA串聯核苷酸重複等位基因所用的方法、PCR引物和試劑盒。WO 98/12355公開了通過質譜分析測定靶核酸的質量的方法，通過切割靶核酸以減少其長度，產生靶單鏈並用MS測定單鏈變短的靶子的質量。還公開了製備用於MS分析的雙鏈靶核酸的方法，包括擴增靶核酸，使一條鏈結合於固相載體，釋放第二條鏈，並隨後釋放第一條鏈，接著用MS分析。也提供了製備靶核酸的試劑盒。PCT WO 97/33000公開了檢測靶核酸中突變的方法，通過使靶子非隨機斷裂成一組單鏈非隨機長度的片斷，並用MS測定它們的質量。美國專利5，605，798報導了快速和高度準確的以質譜儀為基礎的方法，檢測生物樣品中特定核酸的存在用於診斷目的。WO 98/21066描述了通過質譜測定特定靶核酸序列的方法。公開了用PCR擴增和質譜檢測來檢測生物樣品中靶核酸存在的方法，也報導了通過用含有限制性酶切位點和標記的引物擴增樣品中的靶子，延伸和切割擴增的核酸，並檢測延伸產物的存在來檢測靶核酸的方法，其中存在不同於野生型質量的DNA片斷表明有突變。通過質譜方法測定核酸序列的方法也有報導。WO 97/3704UW0 99/31278和美國專利5，547，835描述了用質譜測定核酸序列的方法。美國專利5，622，824,5, 872，003和5，691，141描述了用於外切核酸酶_介導的質譜測序的方法、系統和試劑盒。因此，需要一種特異和快速的生物體檢測和鑑定的方法，其中不需要給核酸測序。本發明符合此需求。

發明內容
本發明的一個實施方案是一種鑑定未知生物體的方法，該方法包括(a)使該生物體的核酸接觸至少一對寡核苷酸引物，此引物能與該核酸序列雜交並側接有一可變的核酸序列；(b)擴增此可變的核酸序列產生擴增產物；(c)測定此擴增產物的分子量；(d)將此分子量與在多種已知生物體上進行步驟(a)-(c)所獲得的一種或多種擴增產物的分子量相比較，其中一種匹配可鑑定該未知的生物體。在此優選實施方案的一個方面，能與至少一對寡核苷酸引物雜交的序列高度保守。優選擴增步驟包括聚合酶鏈式反應。或者，擴增步驟包括連接酶鏈式反應或鏈置換擴增。在此優選實施方案的一個方面，生物體是細菌、病毒、細胞或孢子。有利的是此核酸是核糖體RNA。在另一方面，此核酸編碼RNA酶P或RNA-依賴的RNA聚合酶。優選擴增產物在分子量測定前離子化。該方法還可包括在使該核酸接觸至少一對寡核苷酸引物前，從生物體中分離得到核酸的步驟。該方法還可包括使用一對不同的寡核苷酸引物進行步驟(a)-(d)的步驟，並將結果與在步驟d)的不同的多種已知生物體上進行步驟(a)-(c)獲得的一種或多種擴增產物的分子量相比較。優選一種或多種分子量包含在分子量資料庫中。在此優選實施方案的另一個方面，擴增產物通過電噴射離子化、基質-輔助的雷射解吸或快速原子轟擊而離子化。有利的是，分子量通過質譜測定。優選質譜是傅立葉變換離子迴旋共振質譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時間(TOF)、Q-T0F或三重四極。該方法還可包括在存在具有與腺苷、胸苷、鳥苷或胞苷不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鳥苷或胞苷類似物時進行步驟(b)。在一方面，互寡核苷酸引物在引物中各個三聯體位置I和2上含有鹼基類似物或替換鹼基，其中此鹼基類似物或替換鹼基能以比天然鹼基更高的親和力與其互補物相結合。優選該引物在引物中各個三聯體位置3上含有通用鹼基。此鹼基類似物或替換鹼基可以是2，6_ 二氨基嘌呤、丙炔T、丙炔G、吩嗪或G-夾子。優選此通用鹼基是肌苷、胍、尿苷、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、dP或dK或1-(2-脫·氧-β -D-呋喃核糖)-咪唑-4-醯胺。本發明另一個實施方案是一種鑑定未知生物體的方法，該方法包括(a)使該生物體的核酸接觸至少一對寡核苷酸引物，此引物能與該核酸序列雜交並側接有一可變的核酸序列；(b)擴增此可變的核酸序列產生擴增產物；(c)測定擴增產物的鹼基組成；(d)將此鹼基組成與在多種已知生物體上進行步驟(a)-(c)獲得的擴增產物的一種或種種鹼基組成相比較，其中一種匹配可鑑定該未知生物體。在此優選實施方案的一個方面，能與至少一對寡核苷酸引物雜交的序列高度保守。優選擴增步驟包括聚合酶鏈式反應。或者，擴增步驟包括連接酶鏈式反應或鏈置換擴增。在此優選實施方案的一個方面，生物體是細菌、病毒、細胞或孢子。有利的是，此核酸是核糖體RNA。在另一方面，此核酸編碼RNA酶P或RNA-依賴的RNA聚合酶。優選擴增產物在分子量測定前離子化。該方法還可包括在使該核酸接觸至少一對寡核苷酸引物前，從生物體中分離得到核酸的步驟。該方法還可包括使用一對不同的寡核苷酸引物進行步驟(a)-(d)的步驟，並將結果與在步驟d)的不同的多種已知生物體上進行步驟(a)-(c)獲得的一種或多種擴增產物的鹼基組成相比較。優選一種或多種鹼基組成包含在鹼基組成資料庫中。在此優選實施方案的另一個方面，擴增產物通過電噴射離子化、基質一輔助的雷射解吸或快速原子轟擊而離子化。有利的是，分子量通過質譜測定。優選質譜是傅立葉變換離子迴旋共振質譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時間(TOF)、Q-T0F或三重四極。該方法可進一步包括在存在具有與腺苷、胸苷、鳥苷或胞苷不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鳥苷或胞苷類似物時進行步驟(b)。在一方面此寡核苷酸引物在引物中各個三聯體位置I和2上含有鹼基類似物或替換鹼基，其中此鹼基類似物或替換鹼基能以比天然鹼基更高親和力與和其互補物相結合。優選該引物在引物中各個三聯體位置3上含有通用鹼基。此鹼基類似物或替換鹼基可以是2，6_ 二氨基嘌呤、丙炔T、丙炔G、吩嗪或G-夾子。優選此通用鹼基是肌苷、胍、尿苷、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、dP或dK獲I-(2-脫氧-β -D-呋喃核糖)-咪唑-4-醯胺。本發明也提供檢測個體中單個核苷多態性的方法，該方法包括以下步驟(a)分離個體的核酸；(b)使該核酸與寡核苷酸引物接觸，此引物能與側接有一含有潛在多態性的區域的該核酸雜交；(C)擴增此區域產生擴增產物；(d)測定擴增產物的分子量；(e)將該分子量與個體中已知具有多態性的區域的分子量相比較，其中如果兩分子量相同，則該個體具有此多態性。在此優選實施方案的一個方面，使引物與高度保守的序列雜交。優選多態性與其疾病相關連。或者，多態性是一種血型抗原。在此優選實施方案的一個方面，擴增步驟是聚合酶鏈式反應。或者，擴增步驟是連接酶鏈式反應或鏈置換擴增。優選擴增產物在質量測定前離子化。一方面，擴增產物通過電噴射離子化、基質-輔助的雷射解吸或快速原子轟擊而離子化。有利的是，分子量通過質譜測定。優選質譜法是傅立葉變換離子迴旋共振質譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時間(TOF)、Q-TOF或三重四極。


圖1A-1I顯示保守區域例子的共有序列圖，此保守區域來自16S rRNA(圖1A-1B)(SEQ ID N0:3)、23S rRNA (3，-半，圖 1C-1D ;5』-半，圖 1E-F) (SEQ ID N0:4)、23S rRNA 結構域1(圖1G)、23S rRNA結構域IV (圖1H)和16S rRNA結構域III (圖II)，它們適合用於本發明。帶箭頭的線是設計用於PCR引物對所針對的區域的例子。各引物對的標記代表該共有序列圖上被擴增區域的起始和終止鹼基的編號。大寫字母的鹼基95%以上保守；小寫字母的鹼基90-95%保守；實心圓80-90%保守；空心圓低於80%保守。各引物對的標記代表該共有序列圖上被擴增區域的起始和終止鹼基的編號。圖2顯示圖IC中所示的16S rRNA結構域III的典型的引物擴增區域。圖3顯示RNA酶P中保守區域的示意圖。大寫字母的鹼基90%以上保守；小寫字母的鹼基80-90%保守；實心圓代表的鹼基70-80%保守；空心圓代表的鹼基低於70%保守。圖4是鹼基組成籤名測定的示意圖，用核苷類似物「標誌」來確定鹼基組成籤名。圖5顯示炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)具有或沒有質量標誌硫代磷酸A(A*)區域的去卷積質譜。這兩個質譜的區別在於含該質量標記的序列測定的分子量大於未修飾的序列。圖6顯示金黃色葡萄球菌(S. aureus 16S_1337F)和炭疽桿菌(B. anthr. 16S_1337F)的PCR產物的鹼基組成籤名(BCS)質譜，，擴增採用了相同的引物。兩條鏈的差別僅為兩個(AT — CG)替換並且根據它們的BCS可清楚地鑑別。圖7顯示兩種序列(炭疽芽胞桿菌的A14對蠟樣芽胞桿菌的A15)之間的一個差別可容易地用ESI-TOF質譜檢測。圖8是炭疽桿菌芽孢桿菌包膜蛋白sspE 56聚體加校準的ESI-T0F。此信號明確地鑑定了其它芽胞桿菌和炭疽桿菌。圖9是炭疽桿菌合成的16S_1228雙鏈體(反向和正向鏈)的ESI-T0F。此技術可容易的鑑別正向和反向鏈。圖10是合成的炭疽桿菌16S_133746鹼基對雙鏈體的ESI-FTICR-MS。
圖11是炭疽桿菌saspB基因的56聚體寡核苷酸(3次掃描)的ES I-TOF-MS，採用內部質量標準。此內部質量標準用星號表示。圖12是用5mM TBA-TFA緩衝液配的內部標準品的ESI-T0F-MS，顯示含三丁銨三氟醋酸鹽的帶電條帶降低了最大豐度的帶電狀態，從[M-8H+]8_降到[M-3H+]3_。
具體實施例方式本發明提供了非PCR生物量檢測模式，優選高解析度MS，與採用「智能引物」的以PCR為基礎的BCS技術相結合，此智能引物能與衍生自某生物體的核酸的保守序列區域雜交並包含能獨特地鑑定該生物體的可變序列區域。高解析度MS技術用於測定被擴增序列區域的分子量和鹼基組成籤名(BCS)。然後將此獨特的「鹼基組成籤名」(BCS)輸入最大可能性檢測算法中，用於匹配同一被擴增區域中鹼基組成籤名的資料庫。本方法結合了以PCR 為基礎的擴增技術(提供特異性)和分子量檢測模式(提供速度且不需要測定被擴增的靶序列的核酸序列)，用於生物體檢測和鑑定。本方法與現有方法相比能非常迅速和精確地檢測和鑑定生物體。此外，即使當樣品物質不純時，此快速檢測和鑑定也是可行的。因此，此方法在各種領域中是有用的，包括但不限於，環境測試(如檢測和區別水或其它樣品中的病原和非病原菌)、細菌戰爭(可立即鑑定生物體和適當治療)、藥物遺傳分析和醫學診斷(包括根據突變和多態性作出癌症診斷；藥物抗性和易感性試驗；篩檢和/或診斷遺傳疾病和狀況；診斷傳染病和狀況)。此方法影響了正在進行的關於毒性、病原性、藥物抗性和基因組測序的生物醫學研究，提供了與現有方法相比大為改進的靈敏性、特異性和可靠性，假陽性率更低的方法。本方法可用於檢測和分類任何生物體，包括細菌、病毒、真菌和毒素。作為一個例子，當該生物體是一種生物威脅，所得的信息可用於確定對策所需的實踐信息，包括毒素基因，病原分離和抗生素抗性基因。此外，此方法可用於鑑定天然事物或仔細考慮的基因工程事物，包括染色體片斷交換、分子繁殖(基因改組)和冒出的傳染病。細菌具有一套共同的絕對需要的基因。約250個基因存在於所有種類的細菌中(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93 :10268，1996 !Science 270 :397，1995)，包括小基因組，如支原體(Mycoplasma)、脲原體(Ureaplasma)和立克次體(Rickettsia)。這些基因編碼的蛋白，參與翻譯、複製、重組和修復、轉錄、核苷酸代謝、胺基酸代謝、脂類代謝、能量產生、吸收、分泌等。這些蛋白質的例子是DNA聚合酶ΙΙΙβ、延伸因子TU、熱激蛋白groEL、RNA聚合酶B、磷酸甘油酸激酶、NADH脫氫酶、DNA連接酶、DNA拓撲異構酶和延伸因子G。操縱子也可用本方法靶向。操縱子的一個例子是腸道致病性大腸桿菌的bfp操縱子。多種核心染色體基因可用於在屬或種水平上分類細菌來確定某生物體是否具有潛在威脅。此方法也可用於檢測病原性標記(質粒或染色體)和抗生素抗性基因來證實某生物體的潛在威脅和指導對策。理論上理想的生物體檢測器應能鑑定、定量測定和報告到達傳感器的各生物體的全核酸序列。病原體核酸組分的全序列應提供關於威脅的所有相關信息，包括它的身份和藥物抗性或病原性標記的存在。這個理想還未達到。然而，本發明提供了採用鹼基組成籤名(BCS)獲得具有用相同實際值信息的簡單策略。雖然基因片斷的鹼基組成不如序列本身那樣富含信息，但如果適當選擇短的分析物序列片斷，就不需要分析該基因的全序列。可製備參考序列資料庫，其中將各序列指數化成獨特的鹼基組成籤名，從而某序列的存在可精確地從其籤名的存在來推知。鹼基組成籤名的優點是它們可以整塊平行方式，採用多重PCR(在PCR中兩對或多種引物對同時擴增靶序列)和質譜定量測定。這些多對引物擴增的區域能獨特地鑑定最有感脅的和普遍的背景細菌和病毒。此外，簇-特異引物對能分辨重要的本地簇(如炭疽群)。在本發明的上下文中，「生物體」是任何生物體，活的或死的，或衍生自這種生物體的核酸。生物體的例子包括但不限於細胞(包括但不限於人臨床樣品、細菌細胞和其它病原體)、病毒、毒素基因和生物調節化合物)。樣品可以是活的或死的或處在生長狀態(例如，生長繁殖細菌或孢子)且可以是被包裹的或經生物工程改造的。如本文所用，「鹼基組成籤名」(BCS)是能獨特地鑑定靶基因和來源生物體的核酸序列所選片斷的精確鹼基組成。BCS可認為是特定基因的獨特指數。如本文所用，「智能引物」是能與側接有一價入可變區的序列區域相結合的引物。在一個較佳實施方案中，這些側接有可變區的序列區域在不同種類的生物體中高度保守。 例如，此序列區域可在所有種類芽孢桿菌中高度保守。術語「高度保守」，意味著這些序列區域顯示約80-100%的相同性，更優選約90-100%、最優選約95-100%相同性能擴增16S和23S rRNA區域的智能引物的例子見圖2。箭頭代表能與側接有16S rRNA結構域III可變區的高度保守區域相結合的引物。被擴增的區域是「 1100-1188 」下的莖環結構。如本文所用，「匹配」指任何統計學上有顯著性的概率確定或結果。本法明檢測方法的一個主要優點是不需要具體細菌種類或者菌屬的特異性引物，如芽胞桿菌(Bacillus)或鏈黴菌(Streptomyces)。此引物能識別橫跨數百個細菌種類的高度保守區域，包括但不限於，本文所述的種類。因此，同一引物對可用於鑑定任何期望的細菌，因為它會與側接有一可變區，此可變區對一個菌種是特異的或對若干菌種是共同的保守區域結合，從而能使該介入序列的核酸擴增和測定它的分子量及鹼基組成。例如，16S_971-1062、16S_1228-1310 和 16S_1100_1188 區域在約 900 種細菌中 98-99%保守(16S=16S rRNA，數字表示核苷酸位置)。在本發明的一個實施方案中，本方法所用的引物能結合一個或多個這些區域或其部分。本發明提供了非PCR生物量檢測模式，優選高解析度MS，與採用「智能引物」的以核酸擴增為基礎的BCS技術相組合，該智能引物能與保守區域雜交並含有能獨特鑑定該生物體的可變區域。雖然採用PCR是優選的但其它核酸擴增技術也可使用，包括連接酶鏈式反應(LCR)和鏈置換擴增(SDA)。高解析度MS技術可在高度混雜的環境中從背景譜線中分離出生物體的線。然後將被分辨的譜線翻譯成BCS，輸入到最大可能性檢測算法中，與一種或多種已知的BCS譜線作匹配。較佳的是，生物體BCS譜與許許多多生物體的BCS的資料庫的一種或多種相匹配。優選採用最大可能性檢測算法進行此種匹配。在一個較佳實施方案中，鹼基組成籤名以整塊平行方式定量測定，採用聚合酶鏈式反應(PCR)，優選多重PGR和質譜(MS)方法。必須存在足夠量的核酸用於MS檢測生物體。本領域技術人員熟知多種製備大量純化核酸或其片斷的技術。PCR要求能與側接有待擴增靶序列的區域相結合的一對或多對寡核苷酸引物。這些引物引導了 DNA不同鏈的合成，合成發生時一個弓I物朝向另一個弓丨物的方向。將引物、待擴增的DNA、熱穩定的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)、四種脫氧核苷三磷酸和緩衝液相混合起動DNA合成。加熱變性此溶液，然後冷卻使新加入的引物退火，接著進行又一輪的DNA合成。此過程通常重複約30個循環，導致靶序列的擴增。「智能引物」明確了待擴增和分析的靶序列。在一個實施方案中，靶序列是核糖體RNA (rRNA)基因序列。現在可得到許多最小的微生物基因組的全序列，故有可能鑑定一套定義為「最小生命」的基因和鑑定能獨特分辨各基因和生物體的組成籤名。編碼核心生命功能，如DNA複製、轉錄、核糖體結構、翻譯和轉運的基因廣泛分布於細菌基因組中且是BCS分析的優選區域。核糖體RNA (rRNA)基因包含有提供有用鹼基組成籤名的區域。像許多參與核心生命功能的基因，rRNA基因包含橫跨細菌結構域的非常保守的序列，散布著對各菌種更特異的高度不同的區域。可利用這些不同區域來構建鹼基組成籤名的資料庫。策略包括建立rRNA基因小亞基(16S)和大亞基(23S)序列的以結構為基礎的排列對比。例如，目前核糖體RNA資料庫中已有超過13，000種序列由Robin Gutell, University of Texas atAustin創建和維持,並且公眾可在 the Institute for Cellular and Molecular Biology網頁(www.rna.icmb.utexas.edu/)中得到。公眾也可得到由 University of Antwerp,比利時網頁(www. rrna. uia. ac. be)創建和維持的rRNA資料庫。 已分析了這些數據確定了用作為鹼基組成籤名的區域。這些區域的特徵是a)在感興趣的具體生物種類中，作為序列擴增弓I物位置的上遊和下遊核苷酸序列的相同性在80-100%之間，優選> 95% ；b)介入的可變我顯示在諸種類中相同性不大於約5% ；c)保守區域之間，分隔約30至1000個核苷酸，優選不超過50-250個核苷酸更優選不超過約60-100個核苷。由於它們總體上保守，側翼的rRNA引物序列可作為優良的「通用」引物結合位點來擴增大多數(如果不是所有)菌種感興趣的區域。幾套引物之間的該介入區域在長度和/或組成上不同，因此提供了獨特的鹼基組成籤名。設計的此「智能引物」的優點是通用性，可能最大程度減少需合成的引物數量，可用一對引物檢測許多生物種類。這些引物對可用於擴增這些物種中的不同區域。因為物種中這些保守區域中的任何變化(由於密碼子第三個位置的不穩定)可能發生在DNA三聯體的第三個位置，可設計寡核苷酸引物使對應這個位置的核苷酸是可結合一種以上核苷酸的鹼基，本文稱為「通用鹼基」。例如，在這種「不穩定的」配對中，肌苷⑴能結合U、C或A;鳥嘌呤(G)能結合U或C，尿苷(U)能結合U或C。其它通用鹼基的例子包括硝基吲哚如5-硝基卩引哚或 3_ 硝基卩比咯(Loakes 等，Nucleosides and Nucleotides 14:1001-1003,1995)、簡併核苷dP或dK (Hill等)、含5-硝基吲唑的無環核苷類似物(Van Aerschot等.，Nucleosidesand Nucleotides 14:1053-1056,1995)或嘌呤類似物 I-(2_ 脫氧-β _D_ 呋喃核糖)-咪唑-4-醯胺(Sala 等·，Nucl. Acids. Res. 24 :3302-3306,1996)。在本發明的另一個實施方案中，為補償「不穩定」鹼基的較弱結合，設計了寡核苷酸引物使各個三聯體的第一和第二個位置為比未修飾的核苷酸親和力更高的核苷酸類似物所佔據。這些類似物的例子是能結合胸腺嘧啶的2，6_ 二氨基嘌呤、能結合腺嘌呤的丙炔T和丙炔C和吩嗪，包括能結合G的G-夾子。丙炔描述見美國專利5645958、5830653和5494908其整個內容納入本文參考文獻。吩噴嗪的描述見專利5，502，177,5, 763，588和6，005, 096，它們的完整內容納入本文參考義·。G-夾子描述見美國專利號6，00, 992和6，028，183，它們的完整內容納入本文參考文獻。
能被現有方法檢測的細菌生物戰物質包括炭疽芽孢桿菌(炭疽熱)、耶爾森鼠疫桿菌(鼠疫性肺炎)、土拉熱弗朗西斯菌(土拉熱)、豬布魯菌、流產布魯菌、馬爾他布魯菌(波狀熱)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(鼻疽)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(類鼻疽)、傷寒沙門菌(傷寒症)、斑疹傷寒立克次體(流行性斑疹傷寒症)、普氏立克次體(地方性斑疹傷寒)和伯納特立克次體(Q熱)、莢膜紅細菌、肺炎衣原體、大腸桿菌、志賀痢疾菌、弗氏志賀菌、蠟樣芽胞桿菌、肉毒梭菌、伯納特立克次體、綠膿假單胞菌、嗜肺軍團菌和霍亂弧菌。除了 16S和23S rRNA，其它適合用於本發明檢測的細菌靶區域包括5S rRNA和RNA酶P(圖3)。生物戰真菌生物戰物質包括immitis球孢子菌球孢子菌病。能通過本發明的方法檢測的生物戰毒素基因包括肉表毒素、T-2黴菌素素、篦麻毒素、葡萄球菌腸毒素B、志賀菌毒素、相思豆毒素、黃麴黴毒素、產氣莢膜梭菌ε毒素、芋螺毒素、蛇形菌素、河豚毒素和蛤蛘毒素。·
生物戰病毒威脅物質主要是RNA病毒(正鏈和負鏈)，除天花外。每種RNA病毒是一個相關病毒的家族(準種)。這些病毒變異迅速且作為工程發行改造株的潛力(天然或仔細考慮的)很高。RNA病毒聚簇形成諸家族，它們在病毒基因組上具有保定的RNA結構域(如病毒粒子組分，輔助蛋白)和編碼核心病毒蛋白的保守管家基因，包括單鏈正鏈RNA病毒、RNA依賴的RNA聚合酶、雙連RNA解旋酶、胰凝乳蛋白酶樣和木瓜蛋白酶樣蛋白酶及轉甲基酶。(-)_鏈RNA病毒的例子包括沙粒病毒(如sabia病毒、拉沙熱、Machupo、阿根廷出血熱、flexal病毒)、木雅病毒(如漢坦病毒屬、納伊羅病毒、白蛉病毒、漢坦病毒、剛果-克裡米亞半島出血熱、裡夫特裂谷熱)和單負病毒(mononegavirales)(如纖絲病毒、副粘病毒、伊波拉病毒、馬爾堡病毒、馬麻疫病毒)。(+)_鏈RNA病毒的例子包括小核糖核酸病毒(如柯薩奇病毒、艾柯病毒、人柯薩奇病毒A、人艾柯病毒、人腸道病毒、人脊髓灰質炎病毒、A肝病毒、人parechovirus、人鼻病毒)、星狀病毒(如人星狀病毒)、隹丐病毒(calcivimses)(如千葉病毒(chiba)、chitta病毒、人韓病毒、諾沃克病毒)、nidovirales (如人冠狀病毒、人torovirus)、黃病毒(如登革熱病毒1-4、日本腦炎病毒、森林出血熱病毒、Murray河谷腦炎病毒、Rocio病毒、聖路易斯腦炎病毒、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、C肝病毒)和披膜病毒(如屈曲病毒、東部馬腦炎病毒、Mayaro病毒、O』 nyong-nyong病毒、羅斯河冰毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、風疫病毒、戍型肝炎病毒)。C型肝炎病毒有340個核苷酸的5』 -非翻譯區域，編碼9種蛋白質的開放讀框有3010個胺基酸和240個核苷的3』 -非翻譯區域。5』 -UTR和3』 -UTR在C型肝炎病毒中99%保守。在一個實施方案中，靶基因是RNA依賴的RNA聚合酶或由(+) _鏈RNA病毒編碼的解旋酶，或(_)-鏈RNA病毒的RNA聚合酶。(+)-鏈RNA病毒是雙鏈RNA且能通過採用RNA依賴的RNA聚合酶和正鏈作為模板的RNA-指導的RNA合成來複製。解旋酶解旋RNA雙鏈使得單鏈RNA複製。這些病毒包括來自小核糖核酸病毒家族的病毒(如脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒)、披膜病毒(如甲病毒、黃病毒、風疹病毒)、沙粒病毒(如淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、拉沙熱病毒)、cononaviridae (如人呼吸病毒)和A肝病毒。編碼這些蛋白的基因包含可變區和側接該可變區的高度保守區域。
在一個較佳實施方案中，對生物體產生PCR產物的檢測方案有三個特徵。首先，該技術可同時檢測和區分多種(一般約6-10種)PCR產物。第二，該技術提供了從可能的引物位置獨特鑑定生物體的BCS。最後，該檢測技術快速，使多個PCR反應平行進行。在一個實施方案中，此方法可用於檢測細菌種類中抗生素抗性和/或毒素基因的存在。例如，含有四環素抗性質粒和編碼一種或兩種炭疽毒素(pxOl和/或px02)的質粒的炭疽芽胞桿菌可用抗生物抗性引物對和毒素基因引物對檢測。如果炭疽桿菌四環素抗性是陽性，可用一種不同的抗生素，如quinalone。以質譜(MS)為基礎的PCR產物檢測提供了所有這些特點和另外的優點。MS本身是一種平行的檢測方案，無需放射性或螢光標記，因為具有獨特鹼基組成的各擴增產物可 通過其分子量鑑定。本領域在質譜上的當前狀況是可以容易地分析小於毫微微摩爾量的物質以提供關於樣品分子成分的信息。物質分子量的精確測定可迅速獲得，無論樣品分子量是幾百還是超過十萬原子質量單位(amu)或道爾頓。完整的分子型離子可用使樣品轉變成氣相的多種電離技術之一從擴增產物中產生。這些電離技術包括但不限於，電噴射離子化(ES)、基質-輔助的雷射解吸離子化(MALDI)和快速原子轟擊(FAB)。例如，核酸的MALDI，和用於核酸MALDI的矩陣的例子一起，描述見WO 98/54751 (Genetrace, Inc·)。在離子化上，由於形成了帶不同電荷的離子，可從一個樣品中觀察到幾個峰。平均單個質譜中獲得的多個分子量讀數提供了對該生物體子量的估計。電噴射離子化質譜(ESI-MS)對分子量非常高的多聚體，如蛋白質和分子量超過IOkDa的核酸特別有用，因為它產生了該樣品的多種電荷分子的分布，而不引起顯著量的斷裂。本發明方法中所用的質量檢測器包括但不限於，傅立葉變換離子迴旋共振質譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時間(TOF)、Q-TOF或三重四極。通常可用於本發明的質譜技術包括但不限於，串聯質譜、紅外多光子解離和熱解氣相色譜質譜(PGC-MS)。在本發明的實施方案中，生物體檢測系統採用沒有PCR的熱解GC-MS以生物體檢測模式連續操作，快速檢測生物量的增加(例如，飲用水或細菌戰爭介質糞便汙染的上升)。為使等待最短，使樣品流連續直接流入PGC-MS的燃燒室。當檢測到生物量的增加，PCR過程自動啟動。生物體的存在引起100-7，OOODa大分子片斷的水平上升，這些片斷在PGC-MS質譜中可觀察到。將所見質譜與閾值水平相比，當測定的生物量水平超過預定的閾值時，啟動本文上述的生物體分類過程(結合PCR和MS，優選FT-ICR-MS)。任選地此種檢測到的生物量水平也可啟動報警和其它過程(停止通風氣流、物理分離)。大DNAs分子量的精確測定受到每條鏈PCR反應的陽離子加合、自然界豐富的13C和15N同位素的同位素峰的分辨和離子帶電狀態排布的限制。陽離子可用流經晶片的在線透析去除，在電場梯度與液流正交的情況下，使含PCR產物的溶液接觸含醋酸銨的溶液。後兩個問題通過以分辨能力> 10，000操作和加入同位素衰竭的核苷三磷酸到DNA中可解決。儀器的分辨能力也是考慮因素。分辨能力為10，000時，84聚體PCR產物的[M-14H+]14—帶電狀態的模式信號特徵表現弱且此帶電狀態的排布或確切質量測定是不可能的。分辨能力為33，000時，可看見各同位素組分的峰。分辨能力為100，000時，可分辨相對於基線的同位素峰且離子帶電狀態的排布是簡單易懂的。為獲得[13C，15N]-衰竭的三磷酸，例如，可通過在耗盡的培養基上生培養收集核苷的(Batey等·，Nucl. Acids. Res. 20 :4515_4523，1992)。雖然完整核酸區域的質量測定被認為足以確定大多數生物體串，但聯質譜(MSn)技術可提供關於分子相同性或序列的更明確的信息。串聯MS包括聯合使用質量分析的兩個或更多階段，當分離和檢測步驟都以質譜為基礎時。第一個階段用於選擇樣品的離子或組分，從中進一步獲得結構信息。用如黑體輻射、紅外多光子解離或碰撞活化然後使所選的離子斷裂，。例如，電噴射離子化(ESI)產生的離子可用IR多光子解離斷裂。活化導致糖苷鍵與磷酸骨架分離，產生兩種系列的碎片離子，稱為ω-系列(內部切割後含有完整的3』末端和5』磷酸)和α -鹼基系列(含有完整的5』末端和3』呋喃)。然後將質量分析的第二個階段用於檢測和測定這些產物離子所得片斷的質量。這種片段化後的離子選擇可以進行多次以基本上完全剖析樣品分子序列。如果有兩個或多個鹼基組成或質量類似的靶子或如果一次擴增反應產生的產物質是與兩種或多種生物體參考標準品相同，它們可採用質量修飾的「標誌」來區分。在本發明的實施方案中，可在擴增時加入與未修飾的鹼基具有不同分子量的核苷酸類似物或「標誌」(如5_(三氟甲基)脫氧胸苷三磷酸)而提高質量的區分。這些標誌的描述見PCT W097/33000。這更限制了與任何質量相符合可能的鹼基組成的數量。例如，5-(三氟甲基)脫氧胸苷三磷酸可用於在分離的核酸擴增反應中代替dTTP。測定常規擴增產物和標記產物之間的質量轉變可用於定量測定每條單鏈中胸苷核苷酸的數量。因為二鏈是互補的，也可測定每條鏈中腺苷核苷酸的數量。在另一個擴增反應中，測定每條鏈中G和C殘基的數量，可採用例如胞苷類似物5-甲基胞嘧啶(5-meC)或丙炔C。聯合A/T反應和G/C反應，然後測定分子量，這提供了獨特的鹼基組成。此方法總結於圖4和表I。表I
權利要求
1.一種鑑定未知生物體的方法，其特徵在於，所述方法包括 a)使所述生物體的核酸接觸至少一對寡核苷酸引物，此引物能與所述核酸的序列雜交，其中所述序列側接有該生物體的可變核酸序列； b)擴增所述可變核酸序列產生擴增產物； c)測定所述擴增產物的分子量； d)將所述分子量與在多種已知生物體上進行步驟a)-c)獲得的一種或多種擴增產物的分子量相比較，其中一種匹配可鑑定所述的未知生物體。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，與所述至少一對寡核苷酸引物雜交的所述序列是聞度保守的。
3.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述擴增步驟包括聚合酶鏈式反應。
4.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述擴增步驟包括連接酶鏈式反應或鏈置換擴增。
5.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述生物體是細菌、病毒、細胞或孢子。
6.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述核酸是核糖體RNA。
7.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述核酸編碼RNA酶P或RNA依賴的RNA聚合酶。
8.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述擴增產物在分子質量測定前離子化。
9.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，該方法還包括在使所述核酸與所述至少一對寡核苷酸引物接觸之前，從所述生物體中分離核酸的步驟，。
10.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，該方法還包括用不同寡核苷酸引物對進行步驟a)-d)的步驟，並將結果與在步驟d)的不同的多種已知生物體上進行步驟a)-C)獲得的一種或多種擴增產物的分子量相比較。
11.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述一種或多種分子量包含在分子量資料庫中。
12.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述擴增產物通過電噴射離子化、基質輔助的雷射解吸或快速原子轟擊來離子化。
13.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述分子量用質譜測定。
14.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述質譜選自傅立葉變換離子迴旋共振質譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時間(TOF)、Q-TOF或三重四級。
15.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，該方法還包括在存在與腺苷、胸苷、鳥苷或胞苷有不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鳥苷或胞苷類似物時進行步驟b)。
16.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述寡核苷酸引物在所述引物中各個三聯體位置I和2上含有鹼基類似物，其中所述鹼基類似物能以比天然鹼基更高的親和力結合其互補物。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述引物在所述引物中各個三聯體位置3上含有通用喊基。
18.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述鹼基類似物選自2，6_二氨基嘌呤、丙炔T、丙炔G、吩嗪和G-夾子。
19.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述通用鹼基選自肌苷、胍尿苷、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、dP、dK和I-(2-脫氧-β -D-呋喃核糖)-咪唑-4-醯胺。
20.一種鑑定未知生物體的方法，其特徵在於，所述方法包括 a)使所述生物體的核酸接觸至少一對寡核苷酸引物，此引物能與所述核酸的序列雜交，其中所述序列側接有一可變核酸序列； b)擴增所述可變核酸序列產生擴增產物； c)測定所述擴增產物的鹼基組成； d)將所述鹼基組成與在多種已知生物體上進行步驟a)-c)獲得的一種或多種擴增產物的鹼基組成相比較，其中一種匹配可鑑定所述的未知生物體。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，與所述至少一對寡核苷酸引物雜交的所述序列是聞度保守的。
22.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述擴增步驟包括聚合酶鏈式反應。
23.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述擴增步驟包括連接酶鏈式反應或鏈置換擴增。
24.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述生物體是細菌、病毒、細胞或孢子。
25.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述核酸是核糖體RNA。
26.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述核酸編碼RNA酶P或RNA依賴的RNA聚合酶。
27.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述擴增產物在鹼基組成測定前離子化。
28.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，該方法還包括在使所述核酸與所述至少一對寡核苷酸引物接觸之前，從所述生物體中分離核酸的步驟。
29.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，該方法還包括採用不同寡核苷酸引物對進行步驟a)_d)的步驟，並將結果與在步驟d)的不同的多種已知生物體上進行步驟a)_c)獲得的一種或多種擴增產物的鹼基組成相比較，。
30.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述一種或多種鹼基組成籤名包含在鹼基組成籤名資料庫中。
31.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述擴增產物通過電噴射離子化、基質輔助的解吸或快速原子轟擊來離子化。
32.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述鹼基組成籤名用質譜測定。
33.如權利要求32所述的方法，其特徵在於，所述質譜選自傅立葉變換離子迴旋共振質譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時間(TOF)、Q-TOF或三重四極。
34.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，該方法還包括在存在與腺苷、胸苷、鳥苷或胞苷有不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鳥苷或胞苷類似物時進行步驟b)。
35.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述寡核苷酸引物在所述引物中各個三聯體位置I和2上含有鹼基類似物，其中所述鹼基類似物能以比天然鹼基更高的親和力結合其互補物。
36.如權利要求35所述的方法，其特徵在於，所述引物在所述引物中各個三聯體位置3上含有通用喊基。
37.如權利要求35所述的方法，其特徵在於，所述鹼基類似物選自2，6_二氨基嘌呤、丙炔T、丙炔G、吩嗪和G-夾子。
38.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述通用鹼基選自肌苷、胍尿苷、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、dP、dK和1-(2-脫氧-β -D-呋喃核糖)-咪唑-4-醯胺。
39.一種檢測個體中單個核苷多態性的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟 a)分離所述個體的核酸； b)使所述核酸與寡核苷酸引物接觸，此引物能與側接了一含有所述潛在多態性的區域的所述核酸區域雜交； c)擴增所述區域產生擴增產物； d)測定所述擴增產物的分子量； e)將所述分子量與已知具所述多態性的個體的所述區域的分子量相比較，其中如果分子量相同，所述個體具有所述多態性。
40.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述多態性與某疾病相關。
41.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述多態性是血型抗原。
42.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述擴增步驟是聚合酶鏈式反應。
43.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述擴增步驟是連接酶鏈式反應或鏈置換擴增。
44.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述擴增產物在質量測定前離子化。
45.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述擴增產物通過電噴射離子化、基質-輔助的雷射解吸或快速原子轟擊來離子化。
46.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述引物能與保守序列雜交。
47.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述分子量用質譜測定。
48.如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述質譜選自傅立葉變換離子迴旋共振質譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時間(TOF)、Q-TOF或三重四極。
全文摘要
檢測和鑑定未知生物體，包括細菌、病毒等的方法，採用了能與生物體的核酸的保守序列區域雜交的並含有能獨特分辨法生物體的可變序列區域的引物。結果是一種「鹼基組成籤名」(BCS)，然後與鹼基組成籤名資料庫匹配，由此鑑定該生物體。
文檔編號C12N15/09GK102912036SQ201210348178
公開日2013年2月6日 申請日期2002年3月4日 優先權日2001年3月2日
發明者D·J·埃克, R·H·格裡菲, R·桑帕斯, S·霍夫施塔勒, J·邁克尼爾 申請人:Ibis生物科學股份有限公司