一種抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列及其用途的製作方法

2024-01-20 20:19:15

專利名稱：一種抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物遺傳工程領域，具體涉及一種來自小麥近緣物種易變山羊草的抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列，以及基於該基因通過生物技術的方法在植物抗蟲改良方面的應用。
背景技術：
禾穀孢囊根線蟲(Cereal cyst nematode, Heterodera avenae,)是危害小麥等禾穀類作物的重要土傳病原線蟲，在我國華北小麥主產區均有分布，危害面積達100萬公頃以上，嚴重地區可導致小麥產量損失達27% 45%。因此，發掘抗禾穀孢囊線蟲基因資源，培育抗性小麥新品種迫在眉睫。普通小麥中抗禾穀孢囊線蟲基因資源十分匱乏。從其近緣植物克隆、轉移抗性基因，是培育抗根線蟲小麥新品種的重要途徑。目前，有關抗禾穀孢囊線蟲基因分離的報導極少。迄今，只有一個來自節節麥的抗禾穀孢囊線蟲基因fr^ 通過圖位克隆的被分離出來， 但對其進行功能驗證等後續研究卻未見報到。本申請的發明人發現易變山羊草iAegilops variabilis 2n=28, UvUvSS)對禾穀孢囊線蟲、根結線蟲(Meloidogyne ftrnsi)的雙重抗性主要受一對顯性基因Rkn-mrA控制， 並通過染色體工程將Ja variabilis 3SV染色體或其小片段轉移到小麥，獲得一些抗雙 avenae和ftaasi小麥附加系和重組系，並建立了抗禾穀孢囊線蟲近等基因系「E_10」。為了克隆該基因，應用DDRT-PCR技術和RAP-RCR技術，獲得與CCN抗性相關的 EST序列。通過序列比對搜索，發現其中含有與已知抗禾穀孢囊線蟲基因freJ同源的片段。於是，根據基因核苷酸結合區(NBS)設計引物，從E-IO基因組DNA中擴增得到一個528bp的非完整開放讀碼框敵(GenBank:AF320845)；接著，在敵基礎上，採用 SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)的方法將敵向 3，端延伸了 1209bp， 採用RACE技術分別向5 『和3 『端延伸了 1173 bp和449bp 3 『序列，最終拼接得到一個長度為3057 bp的基因序列，該序列含2775 bp的完整開放閱讀框，可編碼擬4個胺基酸， 與Cre3的胺基酸序列一致性為87%。

發明內容
本發明的一個方面提供了一種來自易變山羊草的抗禾穀孢囊線蟲基因(CreZE)核酸序列及其變體或片段。發明人在■序列基礎上，設計PCR引物，以E-IO基因組DNA 為模板擴增獲得一條長約3600bp左右的片段(圖1)，經DNA測序發現該片段包含本發明所提供的長度為3586 bp的抗禾穀孢囊線蟲基因完整編碼序列(frel)。該序列由3個外顯子和2個內含子組成(圖2)，可編碼934個胺基酸。CreZE的核苷酸序列如下 ATGGATCCAATTACCATTGCTGCCGTAGGATGGAGCGTGGCCATGGTTGGTTGGGTCGCCTCGGCCACCAT
CTCTAAGCTCCTCGCCAAAGGCTTCGATTACCTCGAATATGACACAGCAAAGAAGCTGGCACAACTTGAGCCAAAAATCTTGGTGCTGGAACGGGTCATGGAAGTTGTCGAGACGAGCCCATACAGGCCTCGTCTAGAGCAGCTGTTCAAGCGG CTTAAATACGCTTTCTATGAAGCCGAAGAAATCTTGGATGCTGTCGAGTATCACTGTCTAGAGAAGCAGATCAAAGC TGGAAAACTACAGCCGGGCGATGGCTCATCTCAACCTAAAAAGGATCGTCTGAAGAAAATAAGGTCTGCCGTGGCCA AGAGCTCGCTCCCGAAAAAGAAGGTACTTTCCTTTCTTCCATTTGTTTTGTGTTCTGTCAGTCCAGCTTTTGTTGTT CCATATATATGTTTGAAGGTACTAGAAACACATCATCAATGGTAAGTCAAATTTTGGCATATCAATGTTTCTTTGGT CATATCCTGTATTTTGCGACCAAAGGTACATAGATATGCCAAACTGGATGTAGCCTAAACCTACATTGAAACTTTTG CAAGGCAAAATTTGGGAAATTCGAACGCTGATCTTGTAGCACAAAATTGCAATACAAGTAGTAGAGAATATTTATTT CTCTTGTATATTGGCGCTGATACTGTAGTCGTCGATTCTGGCTCACATGTATTCCCTTAGATTACCCTTTTGCGGCA CAAAATTCTCTCTCCGAAATCAGCAAATTTCTAGCTCATGAGTATGTTCATATAGTCCATAGAGGGCATGCACACGT GTGTGTGTGTGCCAGATGGTATTGGTATACCTCGGTGATTCCTAGCTCAAGCAGTAGAGAACTAGGTTTAGGGCAAG TGATTTCTCGGTGTATCTAAAAAACCTTGGAGGTTAGACGATTTCCCTATACAAACATTGACTTATTTCTTCATTTA GCGTGGGGATAGTTCGATGTAAAAATTTCTCTCATCTGTATGGTCACGTACAATTATTTTGAAAGACTTTTCACTTG CTATTTGGTGTCGCAGGAGAGTCGTATGTCAAATAAGAAGCTGGTAAAGAGCCTAAAGAAGATAGAGAACATTATAA ATGAAGCACACCAGATTTTGGAGAAGCTTAACTTGTCAAGCATAAGTGATGGCAATATAAGACACACAAAGGTTGTC AATCCTACGACTACCGCAGTTTCCCCACAAAAAGTATTTGGTCGAGATAATGATCGCGACAAGATCATAGCAATGCT TCATGAAAAGGAAGCTGGTCTTGATCCAGGCACTAGCAAAGGTCTATGTTTTTCTGTAATTGGCATACATGGAGTCA GCGGGTCTGGGAAATCTACCCTTGCACAGTTTGTTTATGCCCACGAGAAAAATGACAAGCAAGACAACAAGGAAGAC CATTTTGACCTTGTTATGTGGGTTCATGTCTCTCAGGATTTTAGTGTGTGGGGCATCTTCAAGGAGTTGTATGAGGC AGCTTCAGATCCTAAGGTTCCATGCCCTCAATTTAATAACTTGAATGCCTTGGAAGAAGAACTGGAGAGGAAACTAG ATGGAAAGCGATTCCTTCTGGTACTGGATGATGTCTGGTGCAATGCGGATGTTGGTAACCAGGAGCTACCAAAGTTA CTTTCTCCATTGAAGAAAGGAAAGAAAGGAAGCAAGATCCTAGTGACAACTCGAAGTAAATATGCATTACCGGATCT ATGTCCTGGTGTGAGATATACTGCCATGCCGATAACTGAGGTTGATGATACCGCCTTCTTTGAGCTGTTCATGCATT ATGCCCTCGAAGATGGCCAAGATCAAAGCATGTTCCAGGACATTGGGGTTGAGATTGCAAAAAAGCTGAAGGGGTCA CCTCTAGCAGCTAGAACAGTGGGTGGGAATTTACGTCGACAGCAAGATGTTGACCATTGGAGAAGAGTCGGAGATCA AGACCTTTTCAAGGTATGGACGGGACCTCTGTGGTGGAGCTACTATCAGCTAGGTGAGCAGGCTAGGCGTTGCTTTG CTTACTGCAGTATTTTTCCTAGGAGACATCGCTTGTACCGTGATGAATTAGTTAGACTCTGGATGGCAGAAGGGTTC ATAAGAAACACAGATGAAGGGGCTGATGCTGAAGATGTTGGTCTGGGAATATTTAATGAACTATTGTCGATGTCATT TCTTCAACCAGGAGGCAAGGACTGGTACAATCATGGCAAGGAATACTATTTAGTTCATGATTTACTGCATGATTTAG CAGGGGCAGTAGCTGGAAGTGACTGCTTCAGAATTGACAATAACATGATCCAGAAAGGAGAAAGGTGGGCAAGAGAT GTACCCAGAGACGTTCGTCATCTTTTTGTTCAGAGTTATGATGCAGCATTGATTACAGGGAAGATTCTTTTATTGGA AAATTTACACACACTCATCATTTATAGTGTTGGAGGGGATACACCAGTTGAGGAAATAGTCATCAAGAACATACTCA AGAGTCTGCCGAAACTGCGGGTACTAGCAATAGCTTTATGTCTGGAAAAGGATGGATTTATTTGTAGACCAAATATA TTGTCTGTTCCAGAATCTATTAGCCAATTAAAACATCTACGATATCTTGCTTTCCGGACAGATATTGGATGCAGAGT AATTTTACCAAGCAGTCCAAACCAGCTTTACCAGATGCAGCTGCTAGATTTTGGTGTCTGCATGAATTTGGTATTTT CCTGTGGTGATCTTATCAACTTGCGGCATGTATTCAGCGGTCCTGGATTGCAATTTTCAAACATCGGTAGGCTTGTC TCACTCCAAACAATCCCAGCACTCAAAGTAAGTCATGAACAAGGACATGAGGCAAAGCAGTTGAGGTACCTAAACAG GCTCAGCGGCGAACTGAGTATATATGGTCTCCGAAGTGTTGAAAGCAGAGAGGAAGCTCTTGCATTCGATCTAGCTG CCAAGAAACGGCTCACAGAACTAACACTATCACTCGGTGGAAGTTCAAAAGTTGCGGCAGAGGTACTTGAGGGCCTT TGTCCTCCCGTGGGGCTTGTAACACTCGACATCCGTGACTACGATGGTTTGGTATACCCAAAGTGGATGGTGGGTAGGCAAAATGGCGGACCAGAGAAGCTGCAACAACTTGGTCTCTCTGGATGGAGCCAGCCAGGGCCTGCTCCTGCACTGA AGGCTTTCAATCATCTTCGTTGCCTCAATCTGATGCACTGCAGCTGGAACGCCTTGCCATGCAATATGGAGCACCTC AGCTCTCTGGAAACAGTAATCATTATTAAATGTTTGAATATCCGGTCGCTTCCAACGCTGCCACAGTCCCTTACGTA TTTTTGGCTCCTGAAGTGCGACGATGGGTTTATGGAGTCTTGTCAAACAGTTGGACATCCAAACTGGAAAAAGATTC AACATATCTGCAGGAAATATTTTAGGTGAAGAATGCAATCCCCCTTGTAGAGCGTTTCTTTATGAATTGTTATTAGT GACCACCACCTATGTTCTCTAACACATGTGCTTCCCTTTCTAGTGAATGA 。通過本發明獲得的CreZE基因序列得到的CreZE的胺基酸序列如下
MDPITIAAVGffSVAMVGffVASATISKLLAKGFDYLEYDTAKKLAQLEPKILVLERVMEVVETSPYRPRLEQL FKRLKYAFYEAEEILDAVEYHCLEKQIKAGKLQP⑶GSSQPKKDRLKKIRSAVAKSSLPKKKESRMSNKKLVKSLKK IENIINEAHQILEKLNLSSISDGNIRHTKVVNPTTTAVSPQKVFGRDNDRDKIIAMLHEKEAGLDPGTSKGLCFSVI GIHGVSGSGKSTLAQFVYAHEKNDKQDNKEDHFDLVMWVHVSQDFSVWGIFKELYEAASDPKVPCPQFNNLNALEEE LERKLDGKRFLLVLDDVWCNADVGNQELPKLLSPLKKGKKGSKILVTTRSKYALPDLCPGVRYTAMPITEVDDTAFF ELFMHYALEDGQDQSMFQDIGVEIAKKLKGSPLAARTVGGNLRRQQDVDHWRRV⑶QDLFKVWTGPLffffSYYQLGEQ ARRCFAYCSIFPRRHRLYRDELVRLWMAEGFIRNTDEGADAEDVGLGIFNELLSMSFLQPGGKDWYNHGKEYYLVHD LLHDLAGAVAGSDCFRIDNNMIQKGERWARDVPRDVRHLFVQSYDAALITGKILLLENLHTLIIYSVGGDTPVEEIV IKNILKSLPKLRVLAIALCLEKDGFICRPNILSVPESISQLKHLRYLAFRTDIGCRVILPSSPNQLYQMQLLDFGVC MNLVFSCGDLINLRHVFSGPGLQFSNIGRLVSLQTIPALKVSHEQGHEAKQLRYLNRLSGELSIYGLRSVESREEAL AFDLAAKKRLTELTLSLGGSSKVAAEVLEGLCPPVGLVTLDIRDYDGLVYPKWMVGRQNGGPEKLQQLGLSGWSQPG PAPALKAFNHLRCLNLMHCSWNALPCNMEHLSSLETVIIIKCLNIRSLPTLPQSLTYFWLLKCDDGFMESCQTVGHP NWKKIQHICRKYFSE 。在本申請的說明書和權利要求書中使用的以下術語具有如下的含義
「變體」是指對一個目的DNA序列進行一個或者多個鹼基的任何取代、變異、修飾、替換、 缺失或者添加所產生的序列，該序列仍然表現出類似於所述目的DNA序列的活性。「片段」 是指基本DNA序列的一個或多個區域，其仍然具有類似於基本DNA序列的活性。進一步研究發現，frel在E-IO的根部特異表達(圖3)，並且隨著侵染禾穀孢囊線蟲時間的增長，表達量顯著升高(圖3、圖4)。表明該基因表達受到禾穀孢囊線蟲侵染的調控。本發明的有益效果表現在
普通小麥中抗禾穀孢囊線蟲基因資源十分匱乏。從其近緣植物克隆、轉移抗性基因，是培育抗根線蟲小麥新品種的重要途徑。目前，有關抗禾穀孢囊線蟲基因分離的報導極少。雖然已報到通過圖位克隆從山羊草屬的節節麥Ma tauschii)中分離獲得了的抗禾穀孢囊線蟲基因fr^ ，但對其進行功能驗證等後續研究卻未見報到。本發明人通過數年研究，先後利用DDRT-PCR、RAP-RCR、SON-PCR、RACE等技術最終從抗禾穀孢囊線蟲近等基因系E-IO中獲得了抗禾穀孢囊線蟲基因CreZE。通過對E-IO人工接種線蟲，對CreZE的表達譜進行了深入分析，進一步驗證了其功能，表明CreZE與禾穀孢囊線蟲抗性密切相關，是重要的基因資源。可將本發明所提供的抗禾穀孢囊線蟲基因構建至植物真核表達載體中，通過基因槍、農桿菌介導、花粉管通道等本領域研究人員共知的方法導入普通大麥、青稞、小麥、水稻等單子葉植物，或番茄、菸草等雙子葉植物中，使其過量表達。該基因在提高植物對線蟲的抗(耐受)性、通過基因工程手段進行植物抗線蟲改良等領域具有重要的潛在應用價值。


圖1. CreZE的PCR擴增結果
M: DNA分子量標註，1 一 4為以E-IO總DNA為模板進行PCR擴增的檢測結果。圖2. CreZE基因結構簡圖
黑框表示外顯子，白框表示內含子，框中數值表示鹼基對數(單位bp)，ATG和TGA分別表示起始密碼子和終止密碼子。圖3. frel在不同組織和不同侵染階段的半定量PCR檢測結果
A 表示在被侵染的E-IO根部的表達水平，B 表示在未被侵染的E-IO根部的表達水平，C 表示在被侵染的E-IO葉內的表達水平，Un 表示未被侵染的ElO的根或葉，ld_15d 接種禾穀孢囊線蟲後的1天、5天、10天、15天。圖4.接種禾穀孢囊線蟲後frel在E-IO根部表達情況。χ軸表示接種天數，y軸表示基因表達水平；1(1、5(1、10(1、15(1、分別表示接種禾穀孢囊線蟲1天、5天、10天、15天後； 左側斜格線柱子表示在未接種線蟲的E-IO根部情況，右側網格線柱子表示fraZ 在接種線蟲的E-IO根部情況。
具體實施例方式
l.frel基因完整編碼區克隆及測序 1. ■全長基因序列擴增根據拼接得到的基因序列設計引物 Pl: 5' -GGACTAGTCTATCTGTCTGTAGTGATGGAT-3』
Ρ2: 5，-AAAGCTGGGATTCCAAGCCCGCGTCATTC-3，用於全長基因序列的擴增；
PCR擴增體系
ElO基因組DNA
10XLA PCR Buffer
dNTP (各 2. 5mmol/L)
正/反向引物(10ymol/L)
TaKaRa LA TaqDNA (5U/y L)
Mg2+ (25mmol/L)
1 μ L
2 μ L 5 μ L 4 μ L 各3 μ L
3 μ L
力口 dH20 M 50 μ L0
反應循環條件94°C 5min; 94°C 1 min, 60°C 1 min，72°C 2.5 min, 35 cycles; 72°C 7 min;4°C 保溫。
1. 2 PCR產物檢測和回收
(1)將50μ L PCR產物與DNA上樣緩衝液一起加入到1.洲的瓊脂糖凝膠點樣孔中，在 5v/cm的電壓下電泳；
(2)當溴酚藍達一定位置時，停止電泳，把凝膠放入EB中染色15-20min，在紫外燈下用一新的鋒利手術刀片對照DNA Marker切下所要回收的DNA目的帶，儘量去除不含DNA的瓊脂膠，轉入1. 5mL乾淨的離心管中；(3)按每IOOmg凝膠加入350μ L膠回收Binding Buffer,與60°C水浴鍋中放置&iiin， 每2-;3min搖動混勻一次；
(4)將融化的凝膠轉入回收柱中，並將回收柱放入收集管中，室溫下以8，OOOrpm離心 Imin ；
(5)取下回收柱，倒掉收集管中的溶液，重新將回收柱放入收集管中，加入Wash solution 700 μ L，室溫下以8，OOOrpm離心Imin後再重複洗滌一次；
(6)將回收柱放入另一個乾淨的1.5mL離心管中，加入20 40μ L Elution Buffer (如果加dH20, PH要高於7. 0)於回收柱膜上，室溫靜置2min，8，OOOrpm離心Imin ；
(7)回收目的基因片段通過電泳檢測後，於-20°C保存用於pMDlS-T連接轉化。1. 3大腸桿菌感受態細胞的製備
(1)用無菌鉬絲直接蘸取凍存的大腸桿菌JM109菌液，在LB瓊脂平板表面劃線，於 37 °C 培養 16h ；
(2)從培養後的新鮮平板中挑取一個單菌落接種於2mLLB液體培養基中，37°C振蕩 (200rpm)過夜培養；
(3)取0.5ml活化的菌液轉入含50ml LB液體培養基的三角瓶中，37°C振蕩(200rpm) 培養約2-3h，使0D_值為0. 35左右(活細胞數務必小於IO8個細胞/mL)；
(4)將菌液轉移到50mL離心管中，冰上放置IOmin；
(5)4000rpm, 4°C，離心 IOmin,回收細胞；
(6)倒出培養液，將管倒置Imin使培養液流盡；
(7)用冰冷的10mL 0. IM CaCl2溶液(經抽濾滅菌)懸浮沉澱，立即放在冰上保溫 30min ；
(8)6000rpm，4°C，離心lOmin，回收細胞；
(9)用冰冷的2mL 0. IM CaCl2溶液懸浮細胞(務必放在冰上)；
(10)分裝成200μ L/份。此細胞即為大腸桿菌感受態細胞； 1.4目的產物與T-載體連接
T-載體和連接緩衝液放在冰上融化。將T-載體和對照連接DNA (control insert DNA)作短暫離心；
建立連接反應體系(10 μ L總反應體積) 標準反應陽性對照
連接緩衝液5 μ L5 μ L
Τ-載體(50ng/y L)0. 5 μ L0. 5 μ L
PCR回收產物4.5yL-
對照連接DNA-2 μ L
去離子水加至終體積IOyLIOyL
將反應液混勻並短暫離心，在16°C下連接過夜。1.5大腸桿菌高效轉化
(1)取200 μ L新鮮配製的感受態細胞(若是冰存的，需在冰上融化後立即使用)加入 5μ L上述連接產物混勻，同時在一管感受態細胞中加入PUC18質粒作為陽性對照。冰浴 30min ；(2)42°C熱激90s(其間不能搖動)，立即冰浴5min ；
(3)加0.8mL 37°C保溫的SOC培養基(也可用LB培養基)，混勻37 °C在搖床中50r/min 恢復培養1. 5-2h ；
(4)4000印111，41，離心51^11，菌體沉澱用150μ L SOC培養基(或取上清，留下150 μ L SOC培養基)吹散；
(5)均勻地塗布在含ampicillin(50_100mg/L)的LB平板上，37°C過夜培養。1.6質粒DNA小量提取
(1)挑取E.coli單菌落接種於含有ampicillin (50_100mg/L)的3mL LB液體培養基， 37 °C，搖床培養12-1 ；
(2)取2mL菌液轉入1.5mL EP管中，13000rpm離心Imin (其餘菌液用做菌液保存)。 棄去上清液，將EP管倒立，使殘餘液體控幹；
(3)用100μ L溶液I懸浮沉澱，劇烈振蕩混勻；
(4)加入200μ L新鮮配置的溶液II，蓋上EP管，快速顛倒數次，混勻內含物(不要渦旋)JfEP管放置在冰上；
(5)加入150μ L冰預冷的溶液III，蓋上EP管，反覆顛倒數次，使溶液III在黏綢的細菌裂解物中分散均勻，冰浴3-5min ；
(6)40C，13000rpm離心5min，上清轉入另一個EP管；
(7)加等體積酚，氯仿，異戊醇(25^4:1)混合有機溶劑，振蕩混勻有機相和水相， 13000rpm 離心 5min ；
(8)轉移上清液到另一個1.5mL的EP管中，加2倍體積_20°C的無水乙醇，振蕩混合後， 室溫放置anin沉澱質粒DNA ；
(9)40C，13000rpm離心5min，棄去上清液，控幹；
(10)加入ImL70%乙醇洗滌沉澱，4°C，13000rpm離心5min回收質粒DNA ；
(11)控幹液體，並將EP管開口放置於37°C烘箱，使酒精揮發完；
(12)加入含20mg/LRNA酶的50 μ L無菌去離子水或TE溶解DNA，37°C保溫2h ； *溶液I (用前現配)
50mM葡萄糖(glucose )
25mMTris-Cl (pH 8. 0)
IOmMEDTA (pH 8.0)
*溶液II
0. 2mM NaOH (10mol/L 貯存液)、1% SDS，用前配製； *溶液III
5M KAC60mL
冰乙酸11.5mL
水28. 5mL 。1.7限制性內切酶酶切鑑定重組子
建立10 μ L酶切反應體系質粒DNA 5 μ L，IOX酶切緩衝液1 μ L，限制性內切酶幻w I (10U/yL)0. 5yL，限制性內切酶 Ai I (10U/μ L) 0. 5 μ L, ddH20 3 μ L0 37 °C 下保溫 3h， 65°C加熱IOmin以終止酶切反應。
1.8序列的測定與分析
陽性克隆送至上海英駿公司進行DNA序列測定。相似性比較在NCBI站點用BLAST完成。序列比對用 http://www. ebi. ac. uk/ 站點 CluatalW 完成。2.禾穀孢囊線蟲侵染及RNA提取。2. 1禾穀孢囊線蟲的收集和孵化
自然條件下，在禾穀孢囊線蟲的孵化期從感病的小麥田間採集土樣，置聚乙烯袋內運回，先通過漂浮法分離，再在解剖鏡下室內用毛筆收集孢囊；
將收集到的孢囊通過淺盤法孵化。取200目篩放培養皿中，加水置剛剛浸過篩底；將孢囊放入篩上，水中可加入小麥浸提物以刺激線蟲孵化，4°C培養30-60天；16-18°C左右孵化，其間隨時加水及注意線蟲孵化情況；逐日收集孵出的2齡幼蟲，孵化出的2齡幼蟲只能在水中存活一周左右，可放於4°C冰箱內延長線蟲生活期，待線蟲收集到足夠數量用於接種。2. 2孢囊線蟲接種
寄主種子催芽後分別播入盛有消毒土 (土與沙1 :1混合)的小缽(7X10cm)中，同時在培養小麥根部滴加幼蟲懸浮液Iml，接種量約3000條二齡幼蟲/缽。每種材料重複5次，在人工控制的光照生長室內生長，溫度控制在16-18°C，每天光照14小時。2. 3 總 RNA 提取
提取接種禾穀孢囊線蟲1天、5天、10天、15天後ElO根部總RNA，提取過程參照TaKaRa 公司RNAiso Reagent RNA提取試劑盒進行；
(1)將足夠的1.5mL和2. OmL離心管、吸頭、0. 5mL的PCR管浸泡於配製好的0. 1%的 DEPC水中，37°C放置過夜，取出，高壓滅菌30min，烘乾備用；玻璃器皿用0. 5N的NaOH處理， 80°C烘4小時以上；
(2)將待提植物根部用DEPC處理過的水清洗乾淨，分別剪取約500mg根和葉，馬上加入液氮，充分研磨後轉入2mL的離心管中，研磨過程中避免樣品潮解；
(3)立即加入TRNzol-RNA植物總RNA提取試lmL，上下顛倒20秒，室溫下靜置3-5min 後，加入600 μ L氯仿，劇烈震蕩混勻30秒後置於冰上約IOmin ；
(4)4°C，12000g離心15min，溶液分為三層，將最上層溶液轉移到RNase-free1. 5ml的離心管裡，加入等體積的異丙醇，室溫下放置5min ；
(5)4°C,12000g離心IOmin,小心地倒掉上清，用70%的酒精洗滌兩次，每次700 μ L， 12，000 rpm,室溫離心 2min ；
(6)沉澱用30-50 μ L DEPC-H2O (0.01%)溶解，加入 RNase-free DNA 酶，37°C，30min 除去溶液中的DNA;
(7)用酚氯仿異戊醇(2524 :1)抽提2次，小心倒掉上清，4°C，12000g離心lmin，用 RNase-free吸頭吸去殘留液，室溫放置IOmin ；
(8)提取出的總RNA 用無 RNase 的 DNase I (TaKaRa) (3 U /10 ng RNA)37°C處理 30
min ；
(9)加入0.01%的DEPC水30-40 μ L，於_70°C冰箱中保存備用。2. 4總RNA質量檢測
提取的總RNA質量對後續基因克隆影響較大，必須保證很高的完整性和純度。提取得到的總RNA可用1. 2%瓊脂糖電泳檢測完整性。電泳槽，梳子等試驗器材用95%酒精洗後， 3% H2O2浸泡lOmin，三蒸水衝洗兩遍，加入新鮮配製的TAE緩衝液。80V電泳30min，EB染色；
總RNA在核酸蛋白儀上測定濃度及OD26Q/OD28Q比值，並用DEPC處理過的水稀釋RNA至 1 μ g/ μ L備用。總RNA稀釋時，終濃度不應過低，否則容易降解。
2. 5 逆轉錄 PCR (RT-PCR)
第1鏈cDNA的合成將總RNA樣品通過分光光度計測定樣品在^Onm和觀0 nm的吸收值確定RNA的質量和純度，並將樣品稀釋為1. O μ g/ μ L，逆轉錄反應體系如下
(1)在Microtube管中配製模板RNA/引物混合液，全量6μL ；
模板 RNA (1.0 μ g/μ L)IuL
引物 Oligo(dT)w (50ymol/L)IyL
力口 RNase free dH20 至 6 μ L ；
70°C保溫IOmin後迅速冰上急冷^iin以上；離心數秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集於Microtube管底部；
(2)在上述Microtube管中配製下列反轉錄反應液；
6 μ L
2μ L 1 μ L
0. 25 μ L 0. 5μ L
上述模板RNA/引物的變性溶液 5X M-MLV Buffer dNTP (各 10mmol/L) RNase Inhibitor (40U/y L) RNase M-MLV (Rnase F) (200U/μ L) RNase free dH20 至 10 μ L ；
42°C保溫Ih (以Random Primers作為反轉錄引物時應先進行30°C反應lOmin，然後再在42V保溫Ih)；70°C保溫15min後冰上冷卻，得到的cDNA溶液可直接用於2nd-Mrand cDNA的合成或者PCR擴增等，PCR擴增時cDNA溶液的使用量為1 μ L -5 μ L。3 frel半定量表達分析
採用半定量PCR初步研究禾穀孢囊線蟲抗性基因CreZ在不同組織、不同誘導階段的的表達模式。採用先用小麥〃J 基因作為內參，以反轉錄產物單鏈cDNA為模板
進行PCR擴增，使不同的樣品所擴增的a-tubulin J 的量一致(以電泳條帶的光密度值計量)，進一步確定所需的單鏈cDNA的模板量，然後進行樣品的半定量PCR反應。PCR擴增體系
cDNA 模板LOyL
IOXBuffer2. 5 μ L
Mg2+ (25mmol/L)1. 5μ L
dNTP (2. 5mmol/L)2μ L
Primer(P1ZP2, 10ymol/L)各 IyL
TagOM 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ L
力口 dH20 至 25 μ L ；
反應循環參數94°C預變性5min，94°C 45 s,60°C 45 s, 72°C 1 min,經；35個循環後， 72°C終延伸7min。PCR反應產物在1. 2%瓊脂糖凝膠上分離。
11
4 frel實時螢光定量表達分析。4. 1目的基因和內參基因的引物專一性檢測
(1)以接種前後ElO的根部cDNA為模板，對freZ基因和內參a-toto/i/^基因進行引物專一性檢測，反應體系如下
逆轉錄產物l.OyL
ExTaqmk 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ L IOX Buffer2. 5 μ L
Mg2+ (25mmol/L)1. 5μ L
dNTP(2. 5mmol/L)2. 0 μ L
基因特異引物P1A32(IOymoVL)各2. 0 μ L
力口 dH20 至 25 μ L ；
反應參數為 95°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s, 72°C 30s，30 個循環；最後 72°C 延伸 8min。RT-PCR產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；
(2)以接種前後ElO根部的cDNA，進行目的基因和內參基因的SYBRGreen定量PCR，檢測它們的裂解曲線(Melt curve)與基準曲線(PCR base line substracted curve fit), 判斷目的基因和內參基因引物的專一性。4. 2擴增效率檢測
以接種前後ElO的根部cDNA為模板，同時對CreZ基因和內參α -toto/i/^基因進行擴增效率檢測；
用上述10倍梯度稀釋的PCR產物為模板，採用優化好的條件進行SYBR Green I螢光定量PCR，每個生物學樣品都至少進行6次重複實驗，每個稀釋度設2個平行，以Ct值為縱坐標，以稀釋倍數的對數為橫坐標，獲得相對定量標準曲。4. 3 SYBR Green 定量 PCR 檢測
根據目的基因和內參的反應參數，對接種及未接種ElO根總RNA逆轉錄樣品進行SYBR Green實時定量PCR反應，檢測在禾穀孢囊線蟲不同誘導時間處理後，CreZ基因在不同時間段相對表達水平；
反應體系為(20 μ L)
SYBR Green Supermix (TAKARA)10 μ L
Primer F1 μ L
Primer R1 μ L
cDNA (cDNA模板取IOyL加水30 μ L稀釋)8 μ L
目的基因CreZ和內參σ -tubulin 2的實時螢光定量PCR反應同時在Eppendorf Mastercycle realplex Real-Time Detection System實時PCR檢測儀上進行，相關反應參數為 94°C 4 min ；94°C 20 s, 54°C 20s, 72°C 20s 40 個循環；最後 72°C 延伸 8min。PCR 反應結束後進行擴增產物的溶解曲線分析來確定PCR產物的單一性。所有樣品在同一次試驗的同一 PCR模塊中進行。freZ基因在沒有侵染的ElO的根部不同時期的表達情況作為對照。4. 4重複性實驗與數據處理
每種材料的禾穀孢囊線蟲誘導處理樣品被取樣2次，用於freZ基因的相對表達水平檢測每次每個樣品被重複3個復管用於實時螢光定量PCR檢測，通過標準曲線確定目的基因(freZ基因)與內參基因(檢測的線性範圍，目的基因的相對表達水平通過 2 分析(Δ Ct-Ctj^rez-Ctj α -tubulin2) °
SEQUENCE LISTING 〈110〉中國科學院成都生物研究所 〈120〉一種抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸 序列及其用途 〈130〉說明書 〈160〉 2
PatentIn version 3. 3 〈210〉 1 〈211〉 3586 〈212〉 DNA
Aegilops variabilis 〈400〉 1
atggatccaa ttaccattgc tgccgtagga tggagcgtgg ccatggttgg ttgggtcgcc60
tcggccacca tctctaagct cctcgccaaa ggcttcgatt acctcgaata tgacacagca120
aagaagctgg cacaacttga gccaaaaatc ttggtgctgg aacgggtcat ggaagttgtc180
gagacgagcc catacaggcc tcgtctagag cagctgttca agcggcttaa atacgctttc240
tatgaagccg aagaaatctt ggatgctgtc gagtatcact gtctagagaa gcagatcaaa300
gctggaaaac tacagccggg cgatggctca tctcaaccta aaaaggatcg tctgaagaaa360
ataaggtctg ccgtggccaa gagctcgctc ccgaaaaaga aggtactttc ctttcttcca420
tttgttttgt gttctgtcag tccagctttt gttgttccat atatatgttt gaaggtacta480
gaaacacatc atcaatggta agtcaaattt tggcatatca atgtttcttt ggtcatatcc540
tgtattttgc gaccaaaggt acatagatat gccaaactgg atgtagccta aacctacatt600
gaaacttttg caaggcaaaa tttgggaaat tcgaacgctg atcttgtagc acaaaattgc660
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gattctggct cacatgtatt cccttagatt acccttttgc ggcacaaaat tctctctccg780
aaatcagcaa atttctagct catgagtatg ttcatatagt ccatagaggg catgcacacg840
tgtgtgtgtg tgccagatgg tattggtata cctcggtgat tcctagctca agcagtagag900
aactaggttt agggcaagtg atttctcggt gtatctaaaa aaccttggag gttagacgat960
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tttctctcat ctgtatggtc acgtacaatt attttgaaag acttttcact tgctatttgg1080
tgtcgcagga gagtcgtatg tcaaataaga agctggtaaa gagcctaaag aagatagaga1140
acattataaa tgaagcacac cagattttgg agaagcttaa cttgtcaagc ataagtgatg1200
gcaatataag acacacaaag gttgtcaatc ctacgactac cgcagtttcc ccacaaaaag1260
tatttggtcg agataatgat cgcgacaaga tcatagcaat gcttcatgaa aaggaagctg1320
gtcttgatcc aggcactagc aaaggtctat gtttttctgt aattggcata catggagtca1380
gcgggtctgg gaaatctacc cttgcacagt ttgtttatgc ccacgagaaa aatgacaagc1440
aagacaacaa ggaagaccat tttgaccttg ttatgtgggt tcatgtctct caggatttta1500
權利要求
1. 一種抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列，其特徵是含有以下基因片段 ATGGATCCAATTACCATTGCTGCCGTAGGATGGAGCGTGGCCATGGTTGGTTGGGTCGCCTCGGCCACCATC TCTAAGCTCCTCGCCAAAGGCTTCGATTACCTCGAATATGACACAGCAAAGAAGCTGGCACAACTTGAGCCAAAAAT CTTGGTGCTGGAACGGGTCATGGAAGTTGTCGAGACGAGCCCATACAGGCCTCGTCTAGAGCAGCTGTTCAAGCGGC TTAAATACGCTTTCTATGAAGCCGAAGAAATCTTGGATGCTGTCGAGTATCACTGTCTAGAGAAGCAGATCAAAGCT GGAAAACTACAGCCGGGCGATGGCTCATCTCAACCTAAAAAGGATCGTCTGAAGAAAATAAGGTCTGCCGTGGCCAA GAGCTCGCTCCCGAAAAAGAAGGTACTTTCCTTTCTTCCATTTGTTTTGTGTTCTGTCAGTCCAGCTTTTGTTGTTC CATATATATGTTTGAAGGTACTAGAAACACATCATCAATGGTAAGTCAAATTTTGGCATATCAATGTTTCTTTGGTC ATATCCTGTATTTTGCGACCAAAGGTACATAGATATGCCAAACTGGATGTAGCCTAAACCTACATTGAAACTTTTGC AAGGCAAAATTTGGGAAATTCGAACGCTGATCTTGTAGCACAAAATTGCAATACAAGTAGTAGAGAATATTTATTTC TCTTGTATATTGGCGCTGATACTGTAGTCGTCGATTCTGGCTCACATGTATTCCCTTAGATTACCCTTTTGCGGCAC AAAATTCTCTCTCCGAAATCAGCAAATTTCTAGCTCATGAGTATGTTCATATAGTCCATAGAGGGCATGCACACGTG TGTGTGTGTGCCAGATGGTATTGGTATACCTCGGTGATTCCTAGCTCAAGCAGTAGAGAACTAGGTTTAGGGCAAGT GATTTCTCGGTGTATCTAAAAAACCTTGGAGGTTAGACGATTTCCCTATACAAACATTGACTTATTTCTTCATTTAG CGTGGGGATAGTTCGATGTAAAAATTTCTCTCATCTGTATGGTCACGTACAATTATTTTGAAAGACTTTTCACTTGC TATTTGGTGTCGCAGGAGAGTCGTATGTCAAATAAGAAGCTGGTAAAGAGCCTAAAGAAGATAGAGAACATTATAAA TGAAGCACACCAGATTTTGGAGAAGCTTAACTTGTCAAGCATAAGTGATGGCAATATAAGACACACAAAGGTTGTCA ATCCTACGACTACCGCAGTTTCCCCACAAAAAGTATTTGGTCGAGATAATGATCGCGACAAGATCATAGCAATGCTT CATGAAAAGGAAGCTGGTCTTGATCCAGGCACTAGCAAAGGTCTATGTTTTTCTGTAATTGGCATACATGGAGTCAG CGGGTCTGGGAAATCTACCCTTGCACAGTTTGTTTATGCCCACGAGAAAAATGACAAGCAAGACAACAAGGAAGACC ATTTTGACCTTGTTATGTGGGTTCATGTCTCTCAGGATTTTAGTGTGTGGGGCATCTTCAAGGAGTTGTATGAGGCA GCTTCAGATCCTAAGGTTCCATGCCCTCAATTTAATAACTTGAATGCCTTGGAAGAAGAACTGGAGAGGAAACTAGA TGGAAAGCGATTCCTTCTGGTACTGGATGATGTCTGGTGCAATGCGGATGTTGGTAACCAGGAGCTACCAAAGTTAC TTTCTCCATTGAAGAAAGGAAAGAAAGGAAGCAAGATCCTAGTGACAACTCGAAGTAAATATGCATTACCGGATCTA TGTCCTGGTGTGAGATATACTGCCATGCCGATAACTGAGGTTGATGATACCGCCTTCTTTGAGCTGTTCATGCATTA TGCCCTCGAAGATGGCCAAGATCAAAGCATGTTCCAGGACATTGGGGTTGAGATTGCAAAAAAGCTGAAGGGGTCAC CTCTAGCAGCTAGAACAGTGGGTGGGAATTTACGTCGACAGCAAGATGTTGACCATTGGAGAAGAGTCGGAGATCAA GACCTTTTCAAGGTATGGACGGGACCTCTGTGGTGGAGCTACTATCAGCTAGGTGAGCAGGCTAGGCGTTGCTTTGC TTACTGCAGTATTTTTCCTAGGAGACATCGCTTGTACCGTGATGAATTAGTTAGACTCTGGATGGCAGAAGGGTTCA TAAGAAACACAGATGAAGGGGCTGATGCTGAAGATGTTGGTCTGGGAATATTTAATGAACTATTGTCGATGTCATTT CTTCAACCAGGAGGCAAGGACTGGTACAATCATGGCAAGGAATACTATTTAGTTCATGATTTACTGCATGATTTAGC AGGGGCAGTAGCTGGAAGTGACTGCTTCAGAATTGACAATAACATGATCCAGAAAGGAGAAAGGTGGGCAAGAGATG TACCCAGAGACGTTCGTCATCTTTTTGTTCAGAGTTATGATGCAGCATTGATTACAGGGAAGATTCTTTTATTGGAA AATTTACACACACTCATCATTTATAGTGTTGGAGGGGATACACCAGTTGAGGAAATAGTCATCAAGAACATACTCAA GAGTCTGCCGAAACTGCGGGTACTAGCAATAGCTTTATGTCTGGAAAAGGATGGATTTATTTGTAGACCAAATATAT TGTCTGTTCCAGAATCTATTAGCCAATTAAAACATCTACGATATCTTGCTTTCCGGACAGATATTGGATGCAGAGTA ATTTTACCAAGCAGTCCAAACCAGCTTTACCAGATGCAGCTGCTAGATTTTGGTGTCTGCATGAATTTGGTATTTTC CTGTGGTGATCTTATCAACTTGCGGCATGTATTCAGCGGTCCTGGATTGCAATTTTCAAACATCGGTAGGCTTGTCT CACTCCAAACAATCCCAGCACTCAAAGTAAGTCATGAACAAGGACATGAGGCAAAGCAGTTGAGGTACCTAAACAGGCTCAGCGGCGAACTGAGTATATATGGTCTCCGAAGTGTTGAAAGCAGAGAGGAAGCTCTTGCATTCGATCTAGCTGC CAAGAAACGGCTCACAGAACTAACACTATCACTCGGTGGAAGTTCAAAAGTTGCGGCAGAGGTACTTGAGGGCCTTT GTCCTCCCGTGGGGCTTGTAACACTCGACATCCGTGACTACGATGGTTTGGTATACCCAAAGTGGATGGTGGGTAGG CAAAATGGCGGACCAGAGAAGCTGCAACAACTTGGTCTCTCTGGATGGAGCCAGCCAGGGCCTGCTCCTGCACTGAA GGCTTTCAATCATCTTCGTTGCCTCAATCTGATGCACTGCAGCTGGAACGCCTTGCCATGCAATATGGAGCACCTCA GCTCTCTGGAAACAGTAATCATTATTAAATGTTTGAATATCCGGTCGCTTCCAACGCTGCCACAGTCCCTTACGTAT TTTTGGCTCCTGAAGTGCGACGATGGGTTTATGGAGTCTTGTCAAACAGTTGGACATCCAAACTGGAAAAAGATTCA ACATATCTGCAGGAAATATTTTAGGTGAAGAATGCAATCCCCCTTGTAGAGCGTTTCTTTATGAATTGTTATTAGTG ACCACCACCTATGTTCTCTAACACATGTGCTTCCCTTTCTAGTGAATGA。
2.權利要求1所述的抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列，其胺基酸序列如下MDPITIAAVGffSVAMVGffVASATISKLLAKGFDYLEYDTAKKLAQLEPKILVLERVMEWETSPYRPRLEQL FKRLKYAFYEAEEILDAVEYHCLEKQIKAGKLQPGDGSSQPKKDRLKKIRSAVAKSSLPKKKESRMSNKKLVKSLKK IENIINEAHQILEKLNLSSISDGNIRHTKVVNPTTTAVSPQKVFGRDNDRDKIIAMLHEKEAGLDPGTSKGLCFSVI GIHGVSGSGKSTLAQFVYAHEKNDKQDNKEDHFDLVMWVHVSQDFSVWGIFKELYEAASDPKVPCPQFNNLNALEEE LERKLDGKRFLLVLDDVWCNADVGNQELPKLLSPLKKGKKGSKILVTTRSKYALPDLCPGVRYTAMPITEVDDTAFF ELFMHYALEDGQDQSMFQDIGVEIAKKLKGSPLAARTVGGNLRRQQDVDHWRRV⑶QDLFKVWTGPLffffSYYQLGEQ ARRCFAYCSIFPRRHRLYRDELVRLWMAEGFIRNTDEGADAEDVGLGIFNELLSMSFLQPGGKDWYNHGKEYYLVHD LLHDLAGAVAGSDCFRIDNNMIQKGERWARDVPRDVRHLFVQSYDAALITGKILLLENLHTLIIYSVGGDTPVEEIV IKNILKSLPKLRVLAIALCLEKDGFICRPNILSVPESISQLKHLRYLAFRTDIGCRVILPSSPNQLYQMQLLDFGVC MNLVFSC⑶LINLRHVFSGPGLQFSNIGRLVSLQTIPALKVSHEQGHEAKQLRYLNRLSGELSIYGLRSVESREEAL AFDLAAKKRLTELTLSLGGSSKVAAEVLEGLCPPVGLVTLDIRDYDGLVYPKWMVGRQNGGPEKLQQLGLSGWSQPG PAPALKAFNHLRCLNLMHCSWNALPCNMEHLSSLETVIIIKCLNIRSLPTLPQSLTYFWLLKCDDGFMESCQTVGHP NWKKIQHICRKYFSEo
3.一種抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列為權利要求1所述的抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列的變體或片段。
4.權利要求1或3所述的抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列在植物抗性改良中的用途。
全文摘要
本發明涉及植物遺傳工程領域，具體涉及一種來自小麥近緣物種易變山羊草的抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列，以及基於該基因通過生物技術的方法在植物抗蟲改良方面的應用。本發明公開的抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列為長度是3586bp的抗禾穀孢囊線蟲基因完整編碼序列，由3個外顯子和2個內含子組成，可編碼934個胺基酸。本發明抗禾穀孢囊根線蟲基因核酸序列用於植物抗性改良中。
文檔編號C12N15/29GK102234651SQ20101015399
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者餘懋群, 徐德林, 潘志芬, 鄧光兵, 龍海 申請人:中國科學院成都生物研究所