肺癌標誌物檢測用免泵SERS微流控晶片及其製備方法和使用方法

2024-04-15 00:16:05

肺癌標誌物檢測用免泵sers微流控晶片及其製備方法和使用方法
技術領域
1.本發明涉及生物醫學材料工程技術領域，尤其涉及一種肺癌標誌物檢測用免泵sers微流控晶片及其製備方法和使用方法。


背景技術：

2.肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，主要分為小細胞肺癌(sclc)和非小細胞肺癌(nsclc)，其中nsclc約佔89％。nsclc早期發病無明顯症狀，難以及時發現，導致死亡率高。因此，急需尋找一種特異性強和靈敏度高的生物標誌物用於nsclc的早期診斷。臨床研究表明，循環腫瘤dna(ctdna)作為一種特徵性的腫瘤生物標記，可以實時反映腫瘤的狀態。越來越多的證據表明ctdna水平可用於nsclc的早期檢測。tp53作為一種特徵明顯的腫瘤抑制基因，在nsclc患者中檢測到基因突變和表達水平上調。pik3ca-q546k的激活突變主要發生在p110α催化亞基的螺旋結構域或激酶結構域，與肺癌的發生密切相關，其中pi3k/akt/mtor通路在nsclc的發病機制中起重要作用。據報導，ctdna檢測可以通過多種方法完成，如下一代測序(ngs)和聚合酶鏈式反應(pcr)等。然而，這些方法有很多缺點，如時間長、成本高、靈敏度低和特異性差等。因此，迫切需要開發一種快速、低廉、高靈敏和特異性檢測ctdna的新方法。
3.表面增強拉曼散射(sers)作為一種高靈敏度的振動光譜技術，已被廣泛應用於各種rna、蛋白質和生化成分的檢測，具有微創、快速和高效的特點。sers主要通過納米金屬表面發生局部表面等離子體共振(lspr)以增強局部電磁場，從而進一步增強納米金屬粒子上待測分子的拉曼散射光強度，達到檢測物質的目的。研究發現，sers檢測很大程度上取決於納米金屬材料的形貌和光學特性。金銀納米梭是一種兩端尖銳的新型合金納米材料，合金外殼含有大量的銀。由於其高度各向異性的形貌，使金銀納米梭表現出更高的折射敏感性和出色的sers增強效應。有序的金屬納米碗陣列由於其獨特的光學特性，也吸引了越來越多的關注。有序的金屬納米碗陣列具有更大的角度，更寬的頻帶和更明顯的表面等離子體共振效應。它可以提供豐富的「熱點」、「熱線」甚至是「熱面」，從而大大提高檢測靈敏度。同時，金屬納米碗陣列具有高度均勻的周期性結構，在生物免疫分析中具有良好的發展前景。
4.微流控晶片是一種對微尺度流體特別是亞微米結構進行精確控制和操縱的技術，也被稱為「晶片上的實驗室」。微流控晶片可以將生化和醫學分析的基本操作單元，如樣品製備、反應、分離和檢測，整合到一個微米級的晶片中，並在一平方英寸內自動完成樣品分析的全過程，是一個理想的生物傳感器檢測平臺。微流控晶片體積輕，易於攜帶，不受時間、專業操作等限制，使用的樣品量小，反應速度快，可同時處理多個樣品。這些優勢使得微流控晶片可以滿足護理點檢測(poct)的要求。傳統的微流控晶片受到外部驅動器的限制，大大降低了它們的便攜性，並阻礙了它們的應用和推廣。免泵sers微流控晶片是近年來出現的一種新型微流控晶片。將sers和微流控晶片檢測相結合可降低成本，同時提供更快的響應時間，以滿足臨床試驗的需求。
5.為了進一步提高檢測的靈敏度和特異性，需要在sers傳感器的構建中引入核酸信號擴增技術。研究人員建立了一系列基於核酸信號擴增的檢測技術，通過dna擴增識別目標對象，如pcr、環介導等溫擴增(lamp)、鏈式替代擴增(sda)和環路滾動複製(rca)。然而，pcr需要嚴格的實驗條件，容易出現交叉汙染，導致假陰性和假陽性結果。lamp、sda和rca可用於恆溫擴增，無需特殊加熱設備，但是這些方法使用的酶價格昂貴，儲存時間短，酶的活性易受複雜環境條件影響，從而限制了它們的進一步應用。催化髮夾自組裝(cha)是核酸信號轉導和擴增反應中的一種非酶促信號擴增方法。它克服了傳統酶促擴增的限制，在無酶和室溫條件下，dna鏈可以被吉布斯自由能或構型熵驅動。根據鹼基互補配對的原理進行自組裝，實現信號放大，具有很強的特異性。然而，結合cha策略檢測檢測肺癌標誌物tp53和pik3ca-q546k的sers微流控晶片未被報導。


技術實現要素：

6.本發明旨在解決現有技術中存在的技術問題。為此，本發明提供一種肺癌標誌物檢測用免泵sers微流控晶片及其製備方法和使用方法，目的是實現肺癌標誌物tp53和pik3ca-q546k的檢測，且具有靈敏度高、特異性強、組裝過程簡單和檢測速度快的特點。
7.基於上述目的，本發明提供了一種肺癌標誌物檢測用免泵sers微流控晶片的製備方法，包括如下步驟：
8.步驟一、依次利用垂直蒸發自組裝法、金溶膠反應、生長液還原、粒子濺射和氫氟酸腐蝕製備排列整齊緊湊的金銀納米碗陣列；其中，金銀納米碗記為au-agnbs；
9.步驟二、利用種子介導生長法製備金銀納米梭au-agnss，將拉曼信號分子dtnb和4-mba以及髮夾dna序列hp
1-1
和hp
1-2
分別通過au-s鍵耦合到au-agnss表面，得到sers探針au-agnss@dtnb@hp
1-1
和au-agnss@4-mba@hp
1-2
；
10.步驟三、將步驟一製得的au-agnbs陣列表面修飾髮夾dna序列hp
2-1
和hp
2-2
作為sers基底；
11.步驟四、製備基於催化髮夾自組裝的免泵sers微流控晶片。
12.本發明將金銀納米碗(au-agnbs)陣列和金銀納米梭(au-agnss)的sers增強效應結合催化髮夾自組裝(cha)反應，用於肺癌標誌物tp53和pik3ca-q546k的檢測。
13.作為一種可選的實施方式，所述步驟一中製備排列整齊緊湊的金銀納米碗陣列的方法包括如下步驟：
14.1.1)將清洗並乾燥後的載玻片垂直固定於sio2膠體溶液中，經sio2膠體溶液蒸發後，sio2微球自組裝於載玻片上以形成形成規則排列的sio2膠體晶膜，之後將sio2膠體晶膜插入乙醇與3-氨丙基三乙氧基矽烷-乙醇溶液的混合溶液中，24h後取出載玻片以得到氨基化的sio2膠體晶膜；
15.1.2)將氨基化的sio2膠體晶膜置於金納米粒子溶液中以得到sio2/aunps陣列；
16.1.3)將sio2/aunps陣列置於碳酸鉀-氯金酸生長液中，之後加入3％的雙氧水反應，得到aunss陣列；
17.1.4)在aunss陣列上採用粒子濺射儀在60pa，10a的條件下濺射銀納米顆粒得到金銀雙殼陣列；
18.1.5)利用雙面膠從金銀雙殼陣列上粘下一層，置於氫氟酸溶液中過夜腐蝕sio2膠
體晶膜，製備得到排列整齊緊湊的au-agnbs陣列。
19.所述步驟1.2)中金納米粒子溶液的製備方法是在100ml超純水中加入1ml 25mm的氯金酸溶液，加熱至沸騰，接著在攪拌條件下加入4ml 38mm的檸檬酸鈉溶液，混合溶液顏色由金黃色逐漸轉變為酒紅色，即得。
20.優選的，步驟1.4)中濺射時間是30s。
21.作為一種可選的實施方式，所述步驟二中製備au-agnss@dtnb@hp
1-1
和au-agnss@4-mba@hp
1-2
的方法包括如下步驟：
22.2.1)將金種子溶液置於26℃條件下劇烈攪拌，依次加入氫氧化鈉、氯金酸、硝酸銀和抗環血酸充分反應，製備得到au-agnss；其中，氫氧化鈉、氯金酸、硝酸銀和抗環血酸的摩爾比為2600：660:1.44：32；
23.2.2)取10ml製備的au-agnss，加入拉曼信號分子dtnb，經攪拌、靜置得到dtnb標記的au-agnss，即得au-agnss@dtnb；用同樣的方法製備得到4-mba標記的au-agnss，即得au-agnss@4-mba；
24.2.3)將au-agnss@dtnb和au-agnss@4-mba分別加入到活化後的hp
1-1
和hp
1-2
溶液中，經反應、分散於1wt％牛血清白蛋白溶液中，得到au-agnss@dtnb@hp
1-1
和au-agnss@4-mba@hp
1-2
。
25.優選的，2.1)中加入氫氧化鈉(26ml,1m)、氯金酸(30ml,22mm)、硝酸銀(0.18ml,8mm)和抗環血酸(0.16ml,0.2m)，經過50min的充分反應，製備得到au-agnss；在2.1)製備的au-agnss溶液(10ml)中加入拉曼信號分子dtnb(500μl,1mm)，隨後在850rpm條件下均勻攪拌20min；靜置2h，得到au-agnss@dtnb。
26.優選的，使用新鮮製備的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽緩衝液(220μl,1mm)激活髮夾dna序列1(hp
1-1
和hp
1-2
)；然後，將2.2)製備的au-agnss@dtnb和au-agnss@4-mba加入到含有激活的hp
1-1
和hp
1-2
的溶液中，反應持續10h。最後，將混合溶液分散在100ml牛血清白蛋白溶液中(1wt％)，得到au-agnss@dtnb@hp
1-1
和au-agnss@4-mba@hp
1-2
。
27.作為一種可選的方式，所述步驟三中au-agnbs陣列表面修飾髮夾dna序列hp
2-1
和hp
2-2
作為sers基底的製備方法包括如下步驟：
28.3.1)將活化後的hp
2-1
和hp
2-2
溶液滴加在1.5)製備得到的au-agnbs陣列上，經孵育，使hp
2-1
和hp
2-2
通過au-s鍵充分耦合到au-agnbs陣列上；
29.3.2)將3.1)處理後的au-agnbs陣列置於pbs緩衝液中浸泡以使髮夾結構保持穩定，之後，用超純水清洗au-agnbs陣列。
30.優選的，使用220μl新鮮製備的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽緩衝液(1mm)來激活髮夾dna序列2(hp
2-1
和hp
2-2
)。
31.優選的，所述孵育是在25℃，80％溼度的恆溫培養箱中孵育，且恆溫培養箱中反應時間不低於180min。
32.優選的，將au-agnbs陣列置於pbs緩衝液中浸泡30min，使髮夾結構保持穩定。
33.作為一種可選的方式，所述步驟四中製備基於催化髮夾自組裝的免泵sers微流控晶片的方法包括如下步驟：
34.4.1)根據autocad上設計的微流控晶片參數，對矽片進行光刻加工以作為模板，隨後，將聚二甲基矽氧烷預聚物和固化劑按照10:1的比例混合均勻，通過倒模法倒在準備好
的模板上，經固化、冷卻到室溫後，得到帶有微通道的上層pdms蓋片；
35.4.2)將4.1)製備的pdms蓋片浸泡在98％的乙醇溶液中，經超聲清洗、氮氣吹乾後，將3.2)製備的au-agnbs陣列嵌入下層的玻璃基片中，並將pdms蓋片與玻璃基片緊密貼合，得到預先設計的免泵sers微流控晶片。
36.優選的，整個晶片由六個平行通道單元組成，每個通道單元主要分為注射區、混合區、反應區和分流區。注射區由兩個直徑為2mm的圓孔組成，混合區由蛇形通道組成，反應區由面積為2
×
2mm2的au-agnbs陣列填充的矩形腔體組成，分流區由梳狀結構和廢液收集口組成。梳狀結構通道的寬度為100mm，其他通道的寬度為200mm，通道的高度為80mm。
37.本發明還提供一種肺癌標誌物檢測用免泵sers微流控晶片，採用所述製備方法製得，所述免泵sers微流控晶片用於檢測肺癌標誌物tp53和pik3ca-q546k。
38.本發明還提供一種所述肺癌標誌物檢測用免泵sers微流控晶片的使用方法，包括如下步驟：
39.s1、將tp53和pik3ca-q546k標準樣分散於血清中，配置得到不同濃度的tp53和pik3ca-q546k標準樣的混合溶液(10am-100pm)，將100μl不同濃度的tp53和pik3ca-q546k標準樣的混合溶液以及兩種sers探針混合液分別加入到免泵sers微流控晶片的兩個加樣口中，然後置於37℃恆溫培養箱中進行雜交反應，取出免泵sers微流控晶片並用pbs緩衝液清洗反應區後進行sers測試，檢測得到dtnb和4-mba的信號，根據在1337cm-1
(dtnb)和1594cm-1
(4-mba)的特徵信號，分別作出tp53和pik3ca-q546k濃度的對數值和sers信號強度變化量的工作曲線；
40.s2、收集健康人和肺癌患者的血清樣本，形成待檢測樣本，將待檢測血清樣本和兩種sers探針混合液分別加入到免泵sers微流控晶片的兩個加樣口中，然後置於37℃恆溫培養箱中進行雜交反應，取出免泵sers微流控晶片用pbs緩衝液清洗反應區後進行sers測試，檢測得到dtnb和4-mba的信號；
41.s3、將步驟s2檢測得到的待檢測樣本的dtnb和4-mba的特徵峰強度代入步驟s1所確定的工作曲線中，測定待檢測樣本中tp53和pik3ca-q546k的濃度。
42.優選的，所述雜交反應的時間為5min；加入每種sers探針的體積為4μl。
43.本發明的有益效果：
44.1)本發明涉及的au-agnbs陣列製備方法簡單，具有高度的均勻性和穩定性等優點，可以大批量製備。
45.2)本發明涉及的免泵sers微流控晶片具有體積小、便攜化、反應速度快和檢測效率高等優勢。
46.3)本發明製備的免泵sers微流控晶片的重複性良好，可實現規模化的製備。
47.4)本發明中cha被用作信號擴增反應中的一種非酶促信號擴增方法，它克服了傳統酶促擴增的限制。目標ctdnas可以在室溫下，誘導h1和h2結合形成更穩定的雙鏈結構h1-h2複合物，被置換出來的ctdnas會繼續引發下一輪cha反應，從而使sers信號得到放大，且具有很強的特異性。結合au-agnbs陣列的sers效應，可應用於多種目標物的高靈敏檢測。
48.綜上，本發明提供了一種用於同時檢測肺癌標誌物tp53和pik3ca-q546k的免泵sers微流控晶片及其製備方法。本發明首先利用垂直蒸發自組裝法、金溶膠反應、生長液還原、小型粒子濺射儀和氫氟酸腐蝕製備排列整齊緊湊的au-agnbs陣列，利用種子介導生長
法製備au-agnss。兩種拉曼信號分子(dtnb和4-mba)以及髮夾dna序列1(hp
1-1
和hp
1-2
)分別被修飾在au-agnss的表面，以製備兩種sers探針。另外兩個髮夾dna序列2(hp
2-1
和hp
2-2
)被結合在au-agnbs陣列的表面作為sers基底。在反應區，目標ctdnas引發h1和h2的組裝，形成h1-h2複合物。隨著反應的進行，目標ctdnas會被替換下來，引發下一輪cha反應，如此不斷循環，形成大量h
1-h2複合物，使得sers探針在au-agnbs陣列表面不斷聚集，引起拉曼信號分子的信號放大，很大程度上提高了分析精度。此外，梳狀結構的設計消除了對外部重型泵的要求，大大提高了sers微流控晶片的便攜性。多通道設計實現了對多個樣品的同時檢測，顯著提高了檢測效率。通過測定血清中不同濃度的tp53和pik3ca-q546k對應的sers信號強度，根據tp53和pik3ca-q546k濃度的對數值和sers信號強度建立標準曲線，並應用於檢測肺癌患者血清中tp53和pik3ca-q546k的含量。結果表明免泵sers微流控晶片可以在5min內快速、高靈敏檢測血清中tp53和pik3ca-q546k，檢測限(lod)低至am水平。該sers微流控晶片實現了肺癌患者血清樣本中tp53和pik3ca-q546k的檢測，是癌症早期診斷的一個極具前景的方法。
附圖說明
49.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
50.圖1是基於免泵sers微流控晶片檢測腫瘤標誌物tp53和pik3ca-q546k的示意圖。
51.圖2a是實施例1中所製備的au-agnss的sem照片；
52.圖2b是實施例1中所製備的au-agnss的tem照片；
53.圖2c是實施例1中所製備的au-agnss的高分辨tem照片；
54.圖2d是實施例1中所製備的au-agnss的saed衍射圖照片；
55.圖2e是實施例1中所製備的au-agnss中金元素的edx成像圖；
56.圖2f是實施例1中所製備的au-agnss中銀元素的edx成像圖；
57.圖2g是實施例1中所製備的au-agnss各種元素的edx成像圖
58.圖2h是實施例1中所製備的au-agnss的uv-vis-nir光譜；
59.圖2i是實施例1中dtnb標記的au-agnss的拉曼光譜圖。
60.圖3a是實施例2中所製備的sio2膠體晶膜的sem照片；
61.圖3b是實施例2中所製備的sio2/aunps陣列的sem照片；
62.圖3c是實施例2中所製備的aunss陣列的sem照片；
63.圖3d是實施例2中所製備的au-agnbs陣列的sem照片；
64.圖3e是實施例2中拉曼信號分子dtnb和dtnb標記的au-agnbs陣列的拉曼光譜圖；
65.圖3f是實施例2中au-agnbs陣列的電磁場分布；
66.圖3g是實施例2中dtnb標記的au-agnbs陣列的sers成像圖；
67.圖3h是實施例2中dtnb標記的au-agnbs陣列上隨機選取的ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、
ⅴ
五個點的sers光譜圖。
68.圖4a是實施例3中sers探針體積的優化；
69.圖4b是實施例3中孵育時間的優化。
70.圖5a是實施例3中油墨在微流控晶片中流動的照片；
71.圖5b是實施例3中sers微流控晶片中兩個功能區的照片；
72.圖5c是實施例3中cha反應前後的sers光譜圖；
73.圖6是實施例4中pik3ca-q546k和tp53混合溶液在1337cm-1
和1594cm-1
處對應的sers強度折線圖：(ⅰ)100am pik3ca-q546k+100pm tp53；(ⅱ)1fm pik3ca-q546k+100pm tp53；(ⅲ)10fm pik3ca-q546k+100pm tp53；(ⅳ)100fm pik3ca-q546k+100pm tp53；(
ⅴ
)1pm pik3ca-q546k+100pm tp53；(ⅵ)10pm pik3ca-q546k+100pm tp53。
74.圖7a是實施例5中tp53和pik3ca-q546k存在時，反應區的sers光譜圖；
75.圖7b是實施例5中只有pik3ca-q546k存在時，反應區的sers光譜圖；
76.圖7c是實施例5中只有tp53存在時，反應區的sers光譜圖；
77.圖7d是實施例5中tp53和pik3ca-q546k不存在時，反應區的sers光譜圖。
78.圖8a是實施例6中所製備的sers微流控晶片的重現性；
79.圖8b是實施例6中不同批次製備的sers微流控晶片檢測tp53和pik3ca-q546k在1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度的折線圖；
80.圖8c是實施例6中所製備的sers微流控晶片的穩定性；
81.圖8d是實施例6中所製備的sers微流控晶片檢測tp53和pik3ca-q546k在1337cm-1
和1594cm-1
特徵峰處強度與時間之間的關係圖；
82.圖8e是實施例6中本發明所製備的sers微流控晶片檢測tp53和pik3ca-q546k、兩種單鹼基錯配ctdna、兩種三鹼基錯配ctdna、隨機錯配ctdna以及空白對照的sers光譜圖；
83.圖8f是實施例6中所製備的sers微流控晶片檢測目標tp53和pik3ca-q546k、兩種單鹼基錯配ctdna、兩種三鹼基錯配ctdna、隨機錯配ctdna以及空白對照在1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度的柱狀圖。
84.圖9a是實施例7所製備的sers微流控晶片用於檢測分散在血清中不同濃度tp53和pik3ca-q546k的sers光譜圖；
85.圖9b是實施例7中不同濃度的tp53、pik3ca-q546k在1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度和tp53、pik3ca-q546k濃度的對數值之間的線性關係曲線。
86.圖10a是實施例7中健康人血清的平均sers光譜圖；
87.圖10b是實施例7中i期nsclc患者血清的平均sers光譜圖；
88.圖10c是實施例7中ii期nsclc患者血清的平均sers光譜圖；
89.圖10d是實施例7中iii期nsclc患者血清的平均sers光譜圖；
90.圖10e是實施例7中iv期nsclc患者血清的平均sers光譜圖；
91.圖10f是實施例7中健康人和不同分期nsclc患者血清的平均sers光譜在1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度的柱狀圖。
具體實施方式
92.為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，並參照附圖，對本發明進一步詳細說明。
93.需要說明的是，除非另外定義，本發明實施例使用的技術術語或者科學術語應當
為本公開所屬領域內具有一般技能的人士所理解的通常意義。
94.本發明所用的儀器設備以及測試條件如下：
95.掃描電子顯微鏡(sem)照片是由日本日立公司生產的s-4800ii型場發射掃描電子顯微鏡測得。
96.透射電子顯微鏡(tem)照片是由荷蘭飛利浦公司生產的tecnai 10型投射電子顯微鏡測得。
97.拉曼光譜是由英國雷尼紹公司生產的invia reflex型雷射顯微拉曼光譜儀測得。雷射波長為785nm，曝光時間為10s，雷射強度為50mw，50
×
物鏡。
98.sers成像是由美國賽默飛公司生產的dxrxi顯微拉曼成像光譜儀測得。
99.實施例1
100.au-agnss的合成及表徵
101.1)將金種子溶液在26℃條件下劇烈攪拌，依次加入26ml氫氧化鈉(1m)、30ml氯金酸(22mm)、0.18ml硝酸銀(8mm)和0.16ml抗環血酸(0.2m)。經過50min的充分反應，製備得到au-agnss。
102.2)au-agnss的形貌及sers效應的表徵
103.通過sem、tem、高分辨tem、saed成像圖和edx元素映射檢測au-agnss的形貌和結構。
104.如圖2a所示，au-agnss的形貌均一、分散性好，兩端都各有一個尖角，整體類似一個雙向箭頭。圖2b顯示，單個au-agns平均長度約120nm，平均寬度約30nm。au-agns箭頭頂點的高分辨tem圖像清楚地揭示了au-agns的核殼結構(圖2c)。圖2d顯示，au-agnss在{100}、{110}、{111}晶面生長，沒有其它雜質，納米粒子是純淨的晶體。由au-agnss的edx成像(圖2e和圖2f)可知，au-agnss的外層殼是由au和ag兩種元素構成，而金納米棒作為種子完全包埋在均勻的殼層中。圖2g顯示au-agnss中au的分布大於ag。圖2h顯示au-agnss在501nm和797nm處有2個很強的lspr吸收峰，分別對應其橫向吸收峰和縱向吸收峰。圖2i顯示dtnb標記au-agnss的拉曼信號強度非常高，而dtnb的拉曼信號極其微弱。因此，au-agnss可以作為製備sers探針的良好材料。
105.實施例2
106.au-agnbs陣列的組裝及表徵
107.1)將清洗並乾燥的載玻片垂直固定於sio2膠體溶液中。隨著sio2膠體溶液的蒸發，sio2微球開始在載玻片上進行自組裝，最終形成規則排列的sio2膠體晶膜。隨後在燒杯中加入乙醇(50ml)和3-氨丙基三乙氧基矽烷-乙醇溶液(1ml)，並將清洗過的sio2晶膜插入燒杯中。24h後，取出玻片並風乾，得到氨基化的sio2晶膜；
108.2)在100ml超純水中加入1ml的氯金酸溶液(25mm)，加熱至沸騰。隨後在700rpm條件下快速加入4ml檸檬酸鈉溶液(38mm)，混合溶液顏色逐漸由金黃色轉變為酒紅色，得到金納米粒子溶液。隨後，將氨基化後的sio2膠體晶膜置於金納米粒子溶液中。在靜電作用下，金納米粒子逐漸吸附到sio2膠體晶膜的表面，經過6h的反應，得到sio2/aunps陣列；
109.3)將步驟2)合成得到的sio2/aunps陣列置於碳酸鉀-氯金酸生長液中，然後將1ml的雙氧水(3％)加入碳酸鉀-氯金酸生長溶液中。經過50min的反應，形成了aunss陣列；
110.4)使用小型粒子濺射儀在60pa，10a的條件下在步驟3)合成得到的aunss陣列上濺
射銀納米顆粒30s得到金銀雙殼陣列；
111.5)利用雙面膠從4)製備得到的金銀雙殼陣列上粘下一層，置於氫氟酸溶液中過夜腐蝕sio2膠體晶膜，製備得到排列整齊緊湊的au-agnbs陣列；
112.6)使用220μl新鮮製備的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽緩衝液(1mm)來激活髮夾dna序列2(hp
2-1
和hp
2-2
)。之後，將含有激活hp
2-1
和hp
2-2
的溶液滴加在5)製備得到的au-agnbs陣列上，置於25℃，80％溼度的恆溫培養箱中共培養180min，hp
2-1
和hp
2-2
通過au-s鍵耦合到au-agnbs陣列上。
113.7)將au-agnbs陣列置於pbs緩衝液中浸泡30min，使髮夾結構保持穩定。之後，用超純水清洗au-agnbs陣列。
114.8)au-agnbs陣列的形貌及sers效應的表徵
115.通過sem檢測au-agnbs陣列基底的形貌。對sers基底的均一性進行評價。以dtnb作為拉曼信號分子對sers基底的均一性進行評價。取1片製備的基底，浸入濃度1
×
10-8
m的dtnb溶液中，靜置2h後取出晾乾。將晾乾的dtnb標記的基底置於拉曼光譜儀上，根據dtnb在1337cm-1
處特徵峰的強度對基底進行sers成像，雷射掃描基底上被選擇的區域，點與點的間隔為50mm，曝光時間為10s。
116.從圖3a可以看出，sio2膠體晶膜呈周期性緊密排列。sio2微球的直徑約為190nm。圖3b顯示金納米粒子均勻地吸附在sio2膠體晶膜的表面。如圖3c所示，sio2膠體晶膜的表面完全被金納米粒子覆蓋，形成了一層金殼。圖3d可以觀察到au-agnbs陣列具有周期性的孔隙結構，孔隙邊緣的厚度約為20nm，孔隙大小為190nm。圖3e顯示au-agnbs陣列對拉曼信號分子dtnb具有顯著sers增強效果。通過時域有限分差法(fdtd)模擬au-agnbs陣列的電磁場分布(圖3f)，碗狀結構邊緣產生大量「熱點」。使用dtnb在1337cm-1
處特徵峰對au-agnbs陣列進行sers標記成像，從藍色(最低強度)到綠色、黃色、橙色和紅色(最高強度)的配色方案顯示每個點在1337cm-1
處特徵峰強度。根據sers成像可知，au-agnbs陣列整體上顏色基本一致，顯示出非常均勻的增強效果(圖3g)。在dtnb標記的au-agnbs陣列上隨機選擇5個點並測量sers光譜(圖3h)，1337cm-1
處特徵峰強度的相對標準偏差(rsd)值為5.83％。以上結果表明製備的au-agnbs陣列具有周期性結構，表現出良好的sers增強效果和均勻性。
117.實施例3
118.免泵sers微流控晶片的優化製備
119.1)同實施例1製備au-agnss；
120.2)同實施例2製備au-agnbs陣列sers基底；
121.3)根據autocad上設計的微流控晶片參數，對矽片進行光刻加工作為模板。隨後，將聚二甲基矽氧烷(pdms)預聚物和固化劑按照10:1的比例混合均勻，通過倒模法倒在準備好的模板上，在100℃下固化1h後取出。冷卻到室溫後，得到帶有微通道的上層pdms蓋片。然後將製備的pdms蓋片浸泡在98％的乙醇溶液中，接著在超聲波環境下清洗30min，用氮氣吹乾。最後，將2)製備的au-agnbs陣列嵌入下層的玻璃基片中，並將pdms蓋片與玻璃基片緊密貼合，得到預先設計的免泵sers微流控晶片。整個晶片由六個平行通道單元組成，每個通道單元主要分為注射區、混合區、反應區和分流區。注射區由兩個直徑為2mm的圓孔組成，混合區由蛇形通道組成，反應區由面積為2
×
2mm2的au-agnbs陣列填充的矩形腔體組成，分流區由梳狀結構和廢液收集口組成。梳狀結構通道的寬度為100mm，其他通道的寬度為200mm，通
道的高度為80mm。
122.4)為篩選出最佳sers探針的用量，分別使用不同體積的sers探針(2μl、3μl、4μl、5μl、6μl)檢測100pm tp53和pik3ca溶液的sers光譜。圖4a顯示，當sers探針的體積小於4μl時，1337cm-1
處特徵峰強度隨著au-agnss@dtnb@hp
1-1
體積的增加而增強。當體積超過4μl時，由於背景信號的增加，1337cm-1
處特徵峰強度開始下降。因此，au-agnss@dtnb@hp
1-1
的最優體積為4μl。
123.5)將待測tp53和pik3ca溶液和sers探針(4μl au-agnss@dtnb@hp
1-1
和4μlau-agnss@4-mba@hp
1-2
)加入到免泵sers微流控晶片的兩個加樣口中，在37℃恆溫培養箱進行雜交反應。每隔1min，取出晶片用pbs緩衝液輕輕清洗反應區後進行sers測試，篩選出最佳孵育時間。在測試區域隨機選擇10個位置進行sers檢測，並獲得平均的sers光譜。
124.6)由於孵育時間對cha反應非常重要，因此必須達到最佳時間以保證cha擴增反應的充分進行。如圖4b所示，1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度隨著時間的推移而增加，當時間達到5min時，增長趨勢幾乎消失。因此，最佳孵育時間為5min。
125.7)為了驗證流體在微通道內運行效果和流速，向每條微通道的兩個加樣口分別加入50μl藍色墨水和50μl紅色墨水。如圖5a所示，紅色和藍色兩種墨水在微通道表面張力的作用下流動，在30s可以填充整個微通道，完全消除重型注射泵。另外。在測試期間未發現洩漏，封閉效果良好。將免泵sers微流控晶片置於常溫下兩周左右，再次使用時，其親水性不受影響，穩定性良好。結果表明該免泵sers微流控晶片通過毛細作用力在微通道中實現了液體的快速輸送，而無需使用外部泵。由於pdms有自己的拉曼信號，可能會影響檢測結果，因此有必要消除pdms的影響。圖5b和5c中i處和ii處分別代表cha反應前後的位置和相應sers光譜。ii處sers信號強度遠高於i處，表明微通道內目標ctdnas引發cha反應，導致測得更強的sers信號。
126.實施例4
127.兩種ctdnas之間的交叉反應性評估
128.1)同實施例3製備了免泵sers微流控晶片；
129.2)將濃度為10pm的tp53與濃度為10am至10pm的pik3ca-q546k的混合液和sers探針(4μl au-agnss@dtnb@hp
1-1
和4μl au-agnss@4-mba@hp
1-2
)分別加入到晶片的兩個加樣口，在37℃恆溫培養箱中反應5min後檢測sers光譜。
130.3)由圖6可知，無論pik3ca-q546k的濃度如何變化，tp53在1337cm-1
處特徵峰強度基本保持不變。因此，兩種ctdnas之間不存在交叉反應。
131.實施例5
132.ctdnas的定性分析
133.1)同實施例3製備了免泵sers微流控晶片；
134.2)為確定免泵sers微流控晶片能否有效識別tp53和pik3ca-q546k，分別將存在tp53(100pm)和pik3ca-q546k(100pm)的溶液、僅存在tp53(100pm)的溶液、僅存在pik3ca-q546k(100pm)的溶液、不存在tp53和pik3ca-q546k的溶液和sers探針(4μlau-agnss@dtnb@hp
1-1
和4μl au-agnss@4-mba@hp
1-2
)加入到晶片的兩個加樣口，在37℃恆溫培養箱中反應5min後檢測sers光譜。
135.3)圖7a顯示，當溶液中tp53和pik3ca-q546k都存在時，可以觀察到1337cm-1
(dtnb)
和1594cm-1
(4-mba)兩個明顯的特徵峰。當溶液中只有tp53或pik3ca-q546k存在時，只出現一個明顯的特徵峰(圖7b和圖7c)。當待測溶液中沒有目標ctdnas時，不會出現明顯的特徵峰(圖7d)。結果表明，免泵sers微流控晶片可以有效地識別tp53或pik3ca-q546k。
136.實施例6
137.免泵sers微流控晶片的重現性、穩定性和特異性
138.1)同實施例3製備了免泵sers微流控晶片；
139.2)使用五個不同批次製備的晶片檢測100pm tp53和pik3ca溶液的sers光譜，在測試區域隨機選擇10個位置進行sers檢測，並獲得平均的sers光譜，評估微流控晶片的重現性。將製備好的sers微流控晶片在室溫下存放不同天數(3天、5天、7天、15天和20天)，檢測100pm tp53和pik3ca-q546k溶液的sers光譜以評估其穩定性。實驗中引入了幾種幹擾序列(100pm)，包括單鹼基錯配序列(mt
1-1
和mt
1-2
)、三鹼基錯配序列(mt
3-1
和mt
3-2
)和隨機序列(random)(見表1)分別與免泵sers微流控晶片共同孵育，在37℃恆溫箱雜交反應5min，取出晶片，使用pbs緩衝液輕輕清洗反應區後進行sers測試，評估免泵sers微流控晶片的特異性。
140.表1實驗中使用的核苷酸序列
[0141][0142]
圖8a顯示，不同批次製備的免泵sers微流控晶片測得100pm tp53和pik3ca-q546k溶液的sers光譜幾乎沒有明顯差異。這些sers光譜在1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度的rsd值分別為5.68％和6.22％(圖8b)。在晶片放置在常溫下20天後，檢測同一濃度tp53和pik3ca-q546k溶液，1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度僅下降6.85％和7.62％(圖8c和圖8d)，證明了免泵sers微流控晶片具有良好的穩定性。圖8e和8f顯示，tp53和pik3ca-q546k在1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度遠高於比幹擾序列，表明該晶片可以有效的、特異性地識別目標ctdnas。
[0143]
實施例7
[0144]
免泵sers微流控晶片檢測臨床樣本中tp53和pik3ca-q546k
[0145]
1)同實施例3製備了免泵sers微流控晶片；
[0146]
2)將tp53和pik3ca-q546k分散到血清中，配置得到濃度為10am、100am、1fm、10fm、100fm、1pm、10pm、100pm的tp53和pik3ca-q546k的混合溶液，將100μl不同濃度的tp53和pik3ca-q546k的混合溶液以及sers探針(4μlau-agnss@dtnb@hp
1-1
和4μl au-agnss@4-mba@hp
1-2
)分別滴加到免泵sers微流控晶片的兩個加樣口，然後置於37℃恆溫培養箱內雜交反
應5min，取出晶片，使用pbs緩衝液清洗反應區後進行sers檢測，檢測得到dtnb和4-mba的信號。根據dtnb和4-mba在1337cm-1
和1594cm-1
的特徵信號作tp53和pik3ca-q546k濃度對數和sers信號強度的標準曲線。
[0147]
3)在圖9a中，隨著目標ctdnas濃度的增加，sers強度逐漸增加。在10am-100pm的範圍內，sers強度和目標ctdnas濃度的對數值之間呈現良好的線性關係(圖9b)。tp53的線性回歸方程為y＝1775.96x-746.139，r2＝0.985，lod為2.26am。pik3ca-q546k的線性回歸方程為y＝1414.54x-411.185，r2＝0.989，lod為2.34am。
[0148]
4)將30例健康人、30例i期nsclc患者、30例ii期nsclc患者、30例iii期nsclc患者、30例iv期nsclc患者的血清以及sers探針(4μl au-agnss@dtnb@hp
1-1
和4μlau-agnss@4-mba@hp
1-2
)分別滴加到免泵sers微流控晶片的兩個加樣口，然後置於37℃恆溫培養箱內雜交反應5min，取出晶片，使用pbs緩衝液清洗反應區後進行sers檢測。
[0149]
5)圖10a-10e為健康人和不同分期nsclc患者血清的平均sers光譜，每個光譜代表了30個不同臨床血清樣本的平均結果。圖10f為這些sers光譜在1337cm-1
和1594cm-1
處特徵峰強度的柱形圖。將這兩個特徵峰的強度帶入3)中線性回歸方程，計算得到tp53和pik3ca-q546k的表達水平。結果發現tp53和pik3ca-q546k的表達水平隨著nsclc發生發展而逐漸增加。通過qrt-pcr檢測以上臨床血清樣本中tp53和pik3ca-q546k的表達水平，qrt-pcr的測試結果與sers結果高度一致(表2)。
[0150]
表2臨床樣本的sers和qrt-pcr結果
[0151][0152]
所屬領域的普通技術人員應當理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，並非旨在暗示本公開的範圍(包括權利要求)被限於這些例子；在本發明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術特徵之間也可以進行組合，步驟可以以任意順序實現，並存在如上所述的本發明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節中提供。
[0153]
本發明的實施例旨在涵蓋落入所附權利要求的寬泛範圍之內的所有這樣的替換、修改和變型。因此，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。