在哺乳動物細胞中表達凝血因子8的一種新的重組質粒的製作方法

2023-06-15 22:38:11 1

專利名稱：在哺乳動物細胞中表達凝血因子8的一種新的重組質粒的製作方法
血友病是遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，包括8因子缺乏的血友病A、9因子缺乏的血友病B及10因子缺乏的血友病C，以血友病A最為多見。發病率為萬分之1～2。8因子是分子量為330千道爾頓的糖蛋白，它是血液凝固過程中的一個重要因子。該蛋白由三個區域構成由A1鏈與A2鏈構成的N端區，中心的B鏈區及由A3、C1和C2鏈構成的C端區。
凝血因子的基因位於X染色體上，其發病機理是X染色體上的凝血因子基因發生了突變，導致血漿中該凝血因子含量或活性大幅度下降，從而使得內源性凝血途徑受到阻礙，無法進行正常凝血，所以血友病患者需終身用藥。
血友病的藥物有兩大類。一是傳統的血製品提純物，從血液中提取和純化凝血因子，由於它存在著血漿中各種感染因子汙染的危險，如肝炎病毒、愛滋病毒、血栓因子等為血友病患者的輸血感染埋下了極大的隱患。為此，近年推出了另一類藥物，即基因重組凝血因子。由於其安全性，且不需要緊缺的血漿作為原料，在年銷售13億歐元的凝血藥物中已佔有半數份額，佔有率正以每年8～12％的速度增長。目前世界上能夠生產基因重組凝血因子的製藥公司只有四家BAXTER、AVENTIS、WYETH和BAYER。國內尚屬空白。
本發明涉及基因重組凝血因子8生產的關鍵環節，即在哺乳動物細胞中高水平表達凝血因子8的一種新的重組質粒，其調控元件由CMV啟動子與增強子構成，8因子中B鏈的DNA序列由一穩定短肽的DNA序列取代。將該質粒導入哺乳動物細胞之後，轉化細胞能穩定高效地表達有活性的凝血因子8。
本發明包括以下幾項技術1、啟動子的修飾將CMV啟動子與增強子構件成重組的調控元件。
2、將一穩定短肽的DNA序列取代精氨酸與穀氨酸之間的長B鏈DNA(740至1649)3、哺乳動物細胞的轉化。
4、凝血因子8的活性檢測。
5、凝血因子8的蛋白定量測定。
實施例1啟動子的修飾用內切酶EcoRv將增強子(TGACGTCA)序列插入到8因子起始密碼(ATG)前30bp的位置，(附圖1)經修飾的啟動子能增強8因子在CHO細胞中的表達水平。
實施例2重組質粒的構建從完整的人的肝細胞RNA庫逆轉錄獲得8因子的cDNA序列。然後用設計有內切位點的探針，通過PCR技術分別擴增兩個DNA序列，一個是8因子的A1+A2·序列，一個是8因子的A3+C1+C2序列，分別建成質粒pCRA1A2與pCRA3C1C2，設計中在A2與A3之間保留了B鏈的一個16胺基酸(SFSQNSRPPVLKRHQR)短肽的DNA序列(附圖2)，再從pCRA3C1C2切下SaII/SmaI片段插入到pCRA1A2的SaII位點，從而獲得了質粒pCRA1A2A3C1C2(附圖3)，最後將pCRA1A2A3C1C2質粒的NotI/XhoI片段連接到PspOMI質粒的NotI粘性末端，最終形成編碼4.3kb人8因子的真核表達載體質粒(附圖4)實施例3.細胞轉化將中國倉鼠卵巢細胞(CHO)以低密度接種到10cm平皿的6mlCD-3+10％FCS培養基中，按照Chen與Okayama(Mol.Cell.Biol，1987，72745)的方法，用12微克的pcFVIII質粒轉染，6小時後用新鮮培養液置換掉原培養基，3天後收集上清液進行析。
實施例4.凝血因子8的活性檢測用COAMATICFVIII顯色試驗(Chromogenix，Instrumantation Laboratory Company-LexingtonMA 02421-3125USA)檢測8因子的瞬間表達活性每個樣品取50微升移入96孔板中，在37℃下培育4分鐘後加入50微升試劑，在37℃下再培育2分鐘。然後再加入50微升S-2765+I2581試劑，在37℃下培育2分鐘。最後加入50微升20％的乙酸，以終止反應。樣本即刻用Dynex光度計在405nm處測定吸收光譜，從凝血時間差異可以檢測出8因子的活性。(附圖5)實施例5. 凝血因子8的蛋白定量測定用美國的IMUBIND fVIII ELISA診斷Kit(LotNo.022201)檢測轉化體上清液的8因子水平。
1、將100微升的測試液加到孔穴中，加蓋後在室溫下培育90分鐘。
2、洗滌按照微孔板洗滌程序2洗孔穴，每穴用250微升洗滌緩衝液洗4次。
3、檢測抗體的培育將100微升抗體的1％稀釋液加到每個穴中，加蓋後在室溫下培育60分鐘。
4、第二次洗滌同首次洗滌。
5、底物反應100微升的底物溶液立即加入到每穴中，加蓋後在室溫下培育20分鐘。
6、終止反應每穴中加50微升0.5N H2S04以終止反應。
7、檢測黃色反應產物在450nm處讀數，8因子ELISA測定值的校正曲線由附圖6顯示。


圖1顯示啟動子的修飾圖2顯示取代B鏈的短肽序列圖3顯示重組質粒的構建圖4顯示本發明的載體質粒pcFrVIII圖5顯示重組hFVIII的凝血活性，縱坐標為凝血時間圖6顯示凝血因子VIII的ELISA標準曲線。
與本發明有關的參考資料1.Xu Z-L，Mizuguchi H，Ishii-Watabe A，Uchida E，Maymi T and Hayakawa TOptimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.Gene2001，272149-1562.Kozak MAt least six nucleotides proceding the AUG initiator codon enhance translation inmammalian cells.EMBO J.1997，162482-24923.Wood WI，Capon DJ，Simonsen CCExpression of actiVe hnman factor VIII fromrecombinant DNA clones.Nature 1984，312330-3374.White GC，Courter S，Bray GLA multicemer study of recombinant factor VIII(recombinate)in previously treated patients with hemophilia A.Thromb Haemost 1997，77660-6675.Vehar GA，Keyt B，Easton Dstructure of human factor VIII.Nature 1984，312337-4326.Sandberg H，Almetedt A，Brandt J，et alStructural and functional characteristics of a B-domain deleted recombinant factor VIII molecule，r-FVIII SQ.Thromb Haemost 2001，8593-1007.Lind P，Larsson K，Spira JNovel forms of B-domain-deleted recombinant factor VIIImolecules.Construction and biochemical characterization.Eur J Biochem 1995，23219-278.Barrowcliffe TPotency issue with recombinant factor.Ann Hematol 1994，68S89-S919.Mann KGBiochemistry and physiology of blood coagulation.Thromb Harmost1999，82165-17權利要求
1.一種表達凝血因子8的重組質粒，含有CMV啟動子與一8鹼基增強子構成的調控元件，8因子中B鏈的DNA序列由一穩定短肽( SFSQNSRPPVLKRHQR)的DNA序列取代，其特徵在於被該質粒轉化的哺乳動物細胞能穩定高效地表達有活性的凝血因子8。
2.根據權利要求1所述的重組質粒，其特徵在於該質粒轉化並含有該質粒DNA序列的哺乳動物的細胞系。
3.根據權利要求2所述的細胞系，其特徵在於由該細胞系生產的凝血因子8。
4.根據權利要求3所述的凝血因子8，其特徵在於由該因子所製備的治療血友病的藥劑。
全文摘要
在細胞中高水平表達凝血因子8的一種新的重組質粒，其調控元件由CMV的啟動子與一個8鹼基的增強子構成，8因子中B鏈的DNA序列由一穩定短肽(SFSQNSRPPVLK RHQR)的DNA序列取代。將該質粒導入哺乳動物細胞後，轉基因細胞能穩定高效地表達有活性的凝血因子8。
文檔編號A61P7/04GK1970773SQ20051012385
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月23日 優先權日2005年11月23日
發明者顧文勇, 孫勇如, 閆蘊力, 冷煒 申請人:顧文勇, 孫勇如, 閆蘊力, 冷煒