核桃乳飲品中大豆、花生成分的雙重pcr檢測方法
2023-06-16 03:41:11 2
核桃乳飲品中大豆、花生成分的雙重pcr檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種運用雙重PCR技術同時檢測核桃乳中摻入大豆和花生成分的方法，該方法針對大豆、花生成分設計特異性引物，建立核桃乳中主要摻雜成分大豆、花生的雙重PCR檢測方法，包括設計的針對大豆、花生成分的特異性引物以及與之配套的PCR反應條件，本方法設計的引物與其他常見豆科植物以及花生、榛子、核桃、松子、開心果、碧根果、腰果、杏仁、芝麻、蘋果等非豆科植物沒有交叉反應，具有良好特異性；本發明方法可以用於同時檢測核桃乳主要摻雜的大豆、花生成分，結果快速準確可靠，對市面上檢測大豆和花生蛋白代替核桃蛋白具有實際應用價值。同時，可對其他低價植物蛋白代替核桃蛋白及相關乳製品的快速、特異性檢測有重要參考價值。
【專利說明】核桃乳飲品中大豆、花生成分的雙重PCR檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於食品質量安全監測【技術領域】，具體地說涉及應用雙重PCR法對核桃乳飲品中摻入的大豆、花生成分的同時快速檢測 方法。
【背景技術】
[0002]隨著人們生活水平的日益提高，對保健營養食品的需求越來越大；隨著人們消費意識的轉變，追求「營養、安全、健康」的消費意識也更加濃厚。核桃是一種營養豐富的食品原料，不含膽固醇，含有豐富的核黃素、卵磷脂、微量元素、維生素、胺基酸及大量不飽和脂肪酸，可以防止機體早衰、促進腦細胞發育、減少膽固醇的合成、防止動脈硬化，是一種理想的營養保健食品。而核桃蛋白中含有對人體有益的多種胺基酸成分，核桃乳飲料憑藉其健康、營養、安全、時尚的優勢得到迅猛發展，核桃乳飲品的產業化發展令人矚目，市場前景十分廣闊。在以核桃為主要成分的食品未加工前，根據形態很容易將核桃和其他物種進行鑑另IJ，但在食品加工處理後，往往失去直觀的可鑑別特徵。不法商家為追求眼前利益，採用價格相對低廉的大豆、花生仿造核桃乳飲料，以次充好並以低價爭搶市場，嚴重侵害了消費者的合法權益，甚至給消費者的健康安全帶來威脅，也嚴重影響了核桃產業的健康發展。目前核桃乳(露)執行的檢測標準，以物理和化學法檢測核桃乳的感官和各種理化值，如:蛋白質、脂肪等，雖能對其作出初步判斷，但理論依據不充分，不能適應現今社會發展的需要。在文獻報導及國家相關植物蛋白飲料標準中，都沒有同時對核桃乳中摻入大豆、花生蛋白進行快速鑑別的有效方法。
[0003]目前國內對含核桃成分食品中核桃蛋白成分的鑑定主要為以抗體-抗原特異性識別為基礎的酶聯免疫吸附(ELISA)檢測，對於摻入常見低價蛋白如大豆、花生蛋白的DNA檢測仍未見報導。由於在核桃乳的生產過程中，在飲品中有少量殘留的原材料DNA，且DNA比蛋白穩定，所以PCR方法較ELISA方法更為準確，並且避免了對大量抗體的需求。本研究針對大豆、花生成分設計特異性引物，建立了運用雙重PCR技術同時檢測核桃乳中摻入大豆、花生成分的方法。
【發明內容】
[0004]針對上述情況，本發明克服了現有技術中的缺點，目的就在於建立一種運用PCR技術快速同時檢測核桃乳中主要摻雜物質大豆和花生成分的方法，為各類核桃蛋白食品和保健品的中摻假成分的鑑別提供技術支持。為實現上述目的，本發明的方法為:針對大豆設計一組特異性引物Bd 28K-F和Bd 28K-R ;針對花生設計一組特異性引物Arahl-F和Arahl-R ;提取不同植物乳品的DNA，利用兩對引物進行雙重PCR擴增，對引物進行物種特異性的驗證，觀察是否有大豆特異性擴增條帶(216bp)和花生特異性擴增條帶(150bp);提取不同核桃乳材料中的DNA，利用參照引物即植物通用引物(CP03-F、CP03-R)對所提取DNA進行PCR擴增，觀察是否有123bp條帶擴增，防止假陰性，利用所設計兩對引物進行目的基因的PCR特異性擴增；對PCR擴增結果進行分析。[0005]本發明技術內容包括:
(一)該方法使用大豆、花生特異性引物對不同植物乳飲品進行雙重PCR檢測: 大豆引物:
Bd 28K-F:5』 -GCAGCATTGACCCCTCTACAAGC-3』，
Bd 28K-R:5』 -TTCGAATCCAGAAAGCACCGAGT-3』，
花生引物:
Ara hl-F:5』 -GCCATCAACGCTTCCTCCGAACTCC-3J,
Ara hl-R:5』 -TTCACCCGACCCAGGGAATGCT-3』。[0006]本發明中雙重PCR反應體系中各組分構成比例如下:
成分加樣量
2X Premix Taq (TaKaRa)12.5 μ I
引物 Bd 28K-F (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Bd 28K-R (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Ara hl-F (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Ara hl-R (10 μ Μ)0.5 μ I
DNA 樣品Ι.ΟμΙ
Rnase Free dH209.5 μ I
總體積25 μ I。
[0007]本發明雙重PCR方法中擴增程序為:
(1)94°C IOmin
(2)94°C 30s
(3)58°C 30s
(4)72。。30s
(5)回到第2步，重複40次。
[0008](6)72。。 7min。
[0009](二)使用植物通用引物對不同植物乳飲品進行PCR檢測:
通用引物:
CP03-F:5，-CGGACGAGAATAAAGATAGAGT-3，
CP03-R:5』-TTTTGGGGATAGAGGGACTTGA-3』
本發明中PCR反應體系中各組分構成比例如下:
成分加樣量
2X Premix Taq (TaKaRa)12.5 μ I
引物 CP03-F (10 μ Μ)0.5μ I
引物 CP03-F (10 μ Μ)0.5μ I
DNA 樣品Ι.ΟμΙ
Rnase Free dH2010.5 μ I
總體積25 μ I
植物通用PCR方法擴增程序為:
(I)94°C IOmin(2)94°C 30s
(3)56°C 30s
(4) 72℃30s
(5)回到第2步，重複40次
(6)72℃7min
本發明的方法具體包括以下步驟:
(O 基於從NCBI下載的大豆基因序列設計大豆特異性PCR引物:
Bd 28K-F:5』 -GCAGCATTGACCCCTCTACAAGC-3』，
Bd 28K-R:5』 -TTCGAATCCAGAAAGCACCGAGT-3』 ；
(2)基於從NCBI下載的花生基因序列設計花生特異性PCR引物:
Ara hl-F:5』 -GCCATCAACGCTTCCTCCGAACTCC-3』，
Ara hl-R:5』 -TTCACCCGACCCAGGGAATGCT-3J ；
(3)查閱文獻，利用植物通用PCR引物:
CP 03-F:5，-CGGACGAGAATAAAGATAGAGT-3，，
CP 03-R:5』-TTTTGGGGATAGAGGGACTTGA-3』 ；
(4)提取核桃乳樣品中的DNA，按雙重PCR反應體系和擴增程序，利用大豆和花生特異性引物進行雙重PCR，根據條帶大小判斷核桃乳中是否摻入大豆、花生成分，擴增條帶大小為216bp時，證明有大豆成分；擴增條帶大小為150bp時，證明有花生成分；
(5)從各類核桃乳飲品中提取的DNA，用植物通用引物及相應PCR反應成分組成與程序進行擴增，產物條帶大小單一均為123bp時，說明DNA提取成功，符合PCR反應要求。
[0010]本方法與常見豆科植物以及常見堅果類如榛子、板慄、核桃、松子、開心果、碧根果、腰果、杏仁、非堅果類如蘋果等沒有交叉反應，具有特異性。與現有技術相比，由於產品中蛋白質遭到破壞，ELISA方法不能有效檢出的食品中大豆、花生成分，本發明利用雙重PCR可以同時檢測以蛋白成分為主要原料的核桃乳飲品摻入的大豆、花生成分。本發明用多重PCR的方法擴增靶基因，避免了 ELISA方法反應的複雜處理過程，同時檢測兩種成分，節約時間；PCR鑑定方法受到的其他蛋白的幹擾較小，比ELISA方法更為準確。
[0011]【專利附圖】
【附圖說明】
圖1是本發明大豆、花生雙重PCR引物對於常見豆科植物的特異性驗證電泳圖，M:2000bp ladder DNA maker ； 1-黃大豆；2_青大豆；3_黑大豆；4_扁豆；5_綠豆；6_蠶豆；7-白芸豆；8_紅芸豆；9-豌豆；10-麻豇豆；11_豇豆；12-紅小豆；13_赤豆；14-陰性對照；圖2是本發明大豆、花生雙重PCR引物對於其他常見非豆科植物的特異性驗證電泳圖，M:2000bp ladder DNA maker ;1_黃大豆；2-腰果;3-核桃;4-花生;5-燕麥;6-香蕉;7-白芝麻；8-榛子；9-碧根果；10-蘋果；11-開心果；12-瓜子；13-黑芝麻；14-杏仁；15-松子；16-陰性對照；
圖3是本發明植物通用引物擴增不同品牌核桃乳電泳圖；M:500bp ladder DNA maker ；1~22:不同品牌核桃乳；23-陰性對照；
圖4是大豆、花生雙重PCR引物擴增不同品牌核桃乳電泳圖；M:2000bp ladder DNAmaker ；1~22:不同品牌核桃乳；23-陰性對照。【具體實施方式】
[0012]下面通過附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護範圍不局限於所述內容。[0013]實施例1:
1、引物設計
通過文獻查閱及BLAST比對，參考NCBI序列號為EU493455、EU493457、EU493458、EU493459、EU493460、EU493461，利用 Primer Premier 5.0 和 Oligo 6.0 軟體進行引物設計，設計大豆特異性引物由華大基因生物有限公司合成，引物序列如下:
Bd 28K-F:5』 -GCAGCATTGACCCCTCTACAAGC-3』，
Bd 28K-R:5』 -TTCGAATCCAGAAAGCACCGAGT-3』 ；
通過文獻查閱及BLAST比對，參考NCBI序列號為AF43223，AB440237, AY581852,HM640249,利用Primer Premier 5.0和01igo6軟體進行引物設計；設計好的花生特異性引物由華大基因生物有限公司合成，引物序列如下:
Ara hl-F:5』 -GCCATCAACGCTTCCTCCGAACTCC-3』，
Ara hl-R:5』 -TTCACCCGACCCAGGGAATGCT-3J?
[0014]2、DNA 的提取
樣品:豆科類如黃大豆、青大豆、黑大豆、扁豆、綠豆、蠶豆、白芸豆、紅芸豆、豌豆、麻豇豆、豇豆、紅小豆、赤豆；堅果類如花生、松子、杏仁、腰果、碧根果、開心果、榛子、瓜子、核桃；非堅果類如燕麥、蘋果、香蕉、白芝麻、黑芝麻。
[0015]分別取上述適量樣品，在加入液氮的研缽中迅速研磨成粉末，分別稱量IOOmg樣品粉末轉移至1.5mlEP管中，使用天根公司離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒完成樣品中DNA的提取，具體操作步驟如下:
(1)將已加入0.70ul巰基乙醇的700 μ IGPl分別加入到各個含IOOmg樣品粉末的EP管中，顛倒混勻，65°C水浴20min ；
(2)向各個EP管中加入等體積氯仿混勻,沉澱數分鐘待分層後，12000rpm離心5min ；
(3)將上層水相轉入新離心管，加入700ul緩衝液GP2混勻；
(4)混勻液體加入CB3柱,12000rpm離心Imin,棄液；
(5)向CB3中加500ulGD液，12000rpm離心Imin,棄液，將CB3柱放入收集管；
(6)向CB3柱中加700ulPff液，12000rpm離心Imin,棄液，將CB3柱放入收集管；
(7)向CB3 柱加 500ul Pff 液，12000rpm 離心 Imin,棄液；
(8)將CB3柱放回收集管，12000rpm離心2min，棄液，CB3柱置於室溫放置晾乾；
(9)CB3柱轉入新離心管中，加 50ul TE洗脫液,室溫放置5min, 12000rpm離心2min ；
(10)將第9步得到的收集液再加入CB3柱中，12000rpm離心2min；
(11)將產物儲存於_80°C，待用。
[0016]3、PCR 擴增
Cl)使用大豆、花生引物對所提取的DNA樣本進行雙重PCR檢測，PCR反應體系中各組分構成比例如下:
本發明中雙重PCR反應體系中各組分構成比例如下:
成分加樣量2X Premix Taq (TaKaRa)12.5 μ I
引物 Bd 28K-F (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Bd 28K-R (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Ara hl-F (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Ara hl-R (10 μ Μ)0.5 μ I
DNA 樣品1.0μΙ
Rnase Free dH209.5 μ I
總體積25μ1;
雙重PCR方法中擴增程序為:
(1)94°C IOmin
(2)94°C 30s
(3)58°C 30s
(4)72。。30s
(5)回到第2步，重複40次。
[0017](6) 72°C 7min。
[0018]4、電泳檢測
取6 μ L擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，用TAE作為電泳緩衝液，120V下電泳20min, EB染色，紫外燈下觀測並用凝膠分析系統照相，如圖1、圖2。圖1中僅大豆DNA即泳道1、泳道2、泳道3出現特異性條帶為216bp，圖2中黃大豆DNA即泳道I出現特異性條帶為216bp，花生DNA泳道4出現特異性條帶為150bp，說明引物特異性強。
[0019]實施例2:
樣本:市售22種不同品牌標明含核桃蛋白成分的核桃乳飲品，產地分布在雲南省、河北省、山西省、內蒙古等地。
[0020]1、DNA 的提取
將不同待測核桃乳樣品冷凍乾燥，分別稱量IOOmg樣品粉末轉移至1.5mlEP管中，使用天根公司離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒完成樣品中DNA的提取，具體操作步驟同實施例I步驟2。
[0021]2、PCR 擴增
(I)用植物通用引物及相應PCR反應成分組成與程序對所提取DNA樣本進行擴增，產物條帶大小單一均為123bp時，說明DNA提取成功，符合PCR反應要求。
[0022]PCR反應體系中各組分構成比例如下:
成分加樣量
2X Premix Taq (TaKaRa)12.5 μ I
引物 CP03-F (10 μ Μ)0.5μ I
引物 CP03-F (10 μ Μ)0.5μ I
DNA 樣品Ι.ΟμΙ
Rnase Free dH2010.5 μ I
總體積25 μ I
植物通用引物PCR方法擴增程序為:(.丄)94°C IOmin
②94°C 30s
③56。。 30s ? 72°C 30s
⑤回到第2步，重複40次 ? 72 0C 7min
(2)使用大豆和花 生引物對所提取的DNA樣本進行雙重PCR檢測；
雙重PCR反應體系中各組分構成比例如下:
成分加樣量
2X Premix Taq (TaKaRa)12.5 μ I
引物 Bd 28K-F (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Bd 28K-R (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Ara hl-F (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Ara hl-R (10 μ Μ)0.5 μ I
DNA 樣品Ι.ΟμΙ
Rnase Free dH209.5 μ I
總體積25 μ I。
[0023]雙重PCR方法中擴增程序為:
①94°C IOmin
②94。。 30s
③58。。 30s Φ 72°C 30s
⑤回到第2步，重複40次 ? 72 V 7min。
[0024]3、電泳檢測
取6 μ L擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，用TAE作為電泳緩衝液，120V下電泳20min,EB染色，紫外燈下觀測並用凝膠分析系統照相，如圖3、圖4。圖3中除陰性對照(泳道23)其他均為陽性條帶123bp，說明核桃乳DNA提取成功。圖4中泳道23為陰性對照，泳道1、22出現大豆特異性條帶216bp，泳道1、5、8、12、14、18、21出現花生特異性條帶150bp，說明樣品I含有大豆和花生成分，符合產品標識；樣品22含有大豆成分，產品標識則為純核桃乳，結果與產品標識不符，說明有大豆成分摻假。樣品5、8、12、14、18、21出現花生成分條帶，其中只有樣品5、18、21標明含有花生成分，而樣品8、12、14未標明含花生成分，說明有花生成分摻假，樣品2、3、4、6、7、9、10、11、13、15、16、17、19、20符合產品標識。
【權利要求】
1.一種核桃乳飲品中大豆、花生成分的雙重PCR檢測方法，其特徵在於:以待測樣品的DNA為模板，以如下所示的大豆引物、花生引物進行雙重PCR擴增檢測；若發生特異性擴增條帶，則表明待測樣品中包含大豆或花生成分； 大豆引物:
Bd 28K-F:5』 -GCAGCATTGACCCCTCTACAAGC-3』，
Bd 28K-R:5』 -TTCGAATCCAGAAAGCACCGAGT-3』， 花生引物:
Ara hl-F:5』 -GCCATCAACGCTTCCTCCGAACTCC-3』，
Ara hl-R:5』 -TTCACCCGACCCAGGGAATGCT-3』。
2.根據權利要求1所述核桃乳飲品中大豆、花生成分的雙重PCR檢測方法，其特徵在於:PCR反應體系如下: 2X Premix Taq (TaKaRa)12.5 μ I 引物 Bd 28K-F (10 μ Μ)0.5 μ I
引物 Bd 28K-R (10 μ Μ)0.5 μ I 引物 Ara hl-F (10 μ Μ)0.5 μ I 引物 Ara hl-R (10 μ Μ)0.5 μ I DNA 樣品Ι.ΟμΙ Rnase Free dH209.5 μ I 總體積25 μ I 。
3.根據權利要求1所述核桃乳飲品中大豆、花生成分的雙重PCR檢測方法，其特徵在於:PCR 擴增程序為:94°C IOmin ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，40 個循環；72°C 7min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540673SQ201310521842
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】劉麗, 魏曉璐, 黃鑫, 夏雪山, 馮悅, 張阿梅 申請人:昆明理工大學