成年小鼠神經元的機械分離方法

2023-06-01 01:31:46

專利名稱：成年小鼠神經元的機械分離方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及了一種成年小鼠神經元的機械分離方法。
背景技術：
機械分離神經元的膜片鉗實驗在神經遞質受體機制的研究中具有不可替代的作用，機械分離的神經元較原代培養的神經元保存有更好的生理通道機制，而通常用來進行機械分離實驗的小鼠多為2 - 3周齡(幼年)，老年小鼠大腦結構緻密，基本不可能進行機械 分離，從而給不同年齡小鼠神經遞質受體機制的比較帶來困難。

發明內容
本發明的目的是提供一種將原代培養的化學分離方法融入到機械細胞分離中，將腦切片預先用木瓜蛋白酶處理，可對中年及老年小鼠的健康神經元進行分離的方法。為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決
成年小鼠神經元的機械分離方法，包括以下步驟
步驟a :在冰浴組織培養液中採用電子振動切片機製作350-375m厚的成年小鼠腦組織切片，室溫條件下保存30-60分鐘，備用；
步驟b :於無菌條件下，將步驟a中的腦組織切片放入含有木瓜蛋白酶的組織培養液中，控制溫度為32. 2-35. 3°C，保存30分鐘，備用；
步驟c :將腦切片置於盛有HEPES緩衝液(pH=7. 4)的細胞培養皿內，選擇所需分離的神經區域，使用細胞分離器分離神經元，頻率為50-60HZ，擺動幅度2-4mm，分離針移動速度
0.8-1. 5mm/s ;
步驟d :篩選健康神經元；篩選標準為1)細胞輪廓光滑；2)在顯微鏡倒置光源下，透亮;3)有突觸。作為優選，所述的組織培養液中各成分的最終濃度125. OmM NaCl,5. OmM KC1、
1.24mM KH2PO4'26. 0 mM NaHCO3'2. 4 mM CaCl2U. 3 mM MgSO4UO. 0 mM葡萄糖；控制用量為150-200ml每隻小鼠。作為優選，所述的HEPES緩衝液中各成分的最終濃度150mM NaCl,5. OmM KC1、
2.OmM CaCl2U. OmM MgCl2UO. OmM HepesUO. OmM D-葡萄糖；控制用量為每片腦組織切片
2.5-3. 3ml。作為優選，所述的組織培養液中的木瓜蛋白酶的含量為18U/ml。本發明由於採用了以上技術方案，具有顯著的技術效果
本發明通過將原代培養的化學分離方法融入到機械細胞分離中，將腦切片預先用木瓜蛋白酶處理，使中年及老年小鼠的健康神經元可以通過機械分離得到，本方法簡單方便，分離效果顯著，具有很高的實用性。


圖I是顯微鏡下未經木瓜蛋白酶預處理的2周齡小鼠腦切片神經元圖譜。圖2是顯微鏡下未經木瓜蛋白酶預處理的10周齡小鼠腦切片神經元圖譜。圖3是顯微鏡下經木瓜蛋白酶預處理的10周齡小鼠腦切片神經元圖譜。圖4是經木瓜蛋白酶和未經木瓜蛋白酶處理的螢光定量分析統計結果對比圖。
具體實施例方式下面結合附圖I至附圖4與實施例對本發明作進一步詳細描述
實施例I
小鼠海馬切片的製備與預處理14 - 20天大的C57BL/6小鼠，用戊巴比妥鈉(80mg/kg)麻醉後斷頭。快速在冰浴(4°C)組織培養液(單位mM: 125.0 NaCl, 5.0 KCl, I. 24KH2P04, 26. 0 NaHC03, 2. 4 CaC12, I. 3 MgS04, 10.0 glucose)(控制用量 50 — 100ml)中製作350-375 iim厚的組織切片(電子振動切片機VT1000S，Leica)。機械分離前，切片先在室溫(24 - 32°C)組織培養液(IOOml)中保存30分鐘，再在含木瓜蛋白酶(Papain，18U/ml, 32. 2-35. 3°C )的組織保存液中保存30分鐘後(可通過計算，直接將木瓜蛋白酶加入組織保存液中，調整至目標濃度及目標溫度(32. 2-35. 3°C )，再進行機械分離。神經元的機械分離將腦切片置於乘有外液的2mm細胞培養皿內，外液為標準HEPES 緩衝液(單位 mM :150 NaCl, 5.0 KCl, 2.0 CaC12, I. 0 MgC12, 10. 0 Hepes, and10. 0 D-glucose. pH7. 4Trisbase.)(控制用量為2. 5-3. 3ml每片腦組織切片)。選擇所需分離的神經區域，使用細胞分離器(SI-10，KT Lab, Saitama)分離神經元，頻率為50-60HZ，擺動幅度2-4mm，分離針移動速度0. 8-1. 5mm/So在10X20倍倒置顯微鏡下選擇健康細胞進行膜片鉗或生化實驗。健康神經元選擇標準為1、細胞輪廓光滑，2、在顯微鏡倒置光源下，透亮，3、有突觸。使用同一小鼠腦切片，通過比較含木瓜蛋白酶和不含木瓜蛋白酶的組織保存液處理的成年小鼠海馬神經元，說明木瓜蛋白酶預處理對與成年小鼠神經元分離的作用。由圖I至圖3中可清晰看到,通過木瓜蛋白酶預處理的腦切片相對與未用木瓜蛋白酶預處理的腦切片可以分離得到更為健康的神經元。同時我們對於此作用進行了定量分析，抽取10隻C57BL/6小鼠，每隻小鼠製作含海馬的腦切片6片，隨即抽取3片保存於含木瓜蛋白酶的組織保存液，其餘3片則在不含木瓜蛋白酶的組織保存液中，細胞分離時則選用同一指標，頻率為50Hz，擺動幅度3mm，分離針移動速度lmm/s。神經元分離結束後，對培養皿內細胞進行固定和MAP-2染色，並進行螢光定量分析，結果發現木瓜蛋白酶預處理的螢光量大約為未用木瓜蛋白酶處理的4. 2倍(p〈0. 001)，統計結果見圖4，說明通過木瓜蛋白酶的預處理，明顯更容易通過機械分離得到的神經元。總之，以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所作的均等變化與修飾，皆應屬本發明專利的涵蓋範圍。
權利要求
1.一種成年小鼠神經元的機械分離方法，其特徵在於，包括以下步驟 步驟a :在冰浴組織培養液中採用電子振動切片機製作350-375m厚的成年小鼠腦組織切片，室溫條件下保存30-60分鐘，備用； 步驟b :於無菌條件下，將步驟a中的腦組織切片放入含有木瓜蛋白酶的組織培養液中，控制溫度為32. 2-35. 3°C，保存30分鐘，備用； 步驟c :將腦切片置於盛有HEPES緩衝液的細胞培養皿內，選擇所需分離的神經區域，使用細胞分離器分離神經元，頻率為50-60HZ，擺動幅度2-4mm，分離針移動速度O.8-1. 5mm/s ; 步驟d :篩選健康神經元；篩選標準為1)細胞輪廓光滑；2)在顯微鏡倒置光源下，透亮；3)有突觸。
2.根據權利要求I所述的成年小鼠神經元的機械分離方法，其特徵在於所述的組織培養液中各成分的最終濃度125. OmM NaCl,5. OmM KCl、L24mM KH2PO4'26. O mM NaHCO3'2.4 mM CaCl2U. 3 mM MgSO4UO. O mM 葡萄糖；控制用量為 150_200ml 每隻小鼠。
3.根據權利要求I所述的成年小鼠神經元的機械分離方法，其特徵在於所述的HEPES緩衝液中各成分的最終濃度150mM NaCl,5. OmM KCl,2. OmM CaCl2U. OmM MgCl2UO. OmMHepesUO. OmM D-葡萄糖；控制用量為每片腦組織切片2. 5-3. 3ml。
4.根據權利要求I所述的成年小鼠神經元的機械分離方法，其特徵在於所述的組織培養液中的木瓜蛋白酶的含量為18U/ml。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，公開了一種成年小鼠神經元的機械分離方法，方法如下在冰浴組織培養液中採用電子振動切片機製作350-375m厚的成年小鼠腦組織切片，室溫條件下保存30-60分鐘，於無菌條件下，將腦組織切片放入含有木瓜蛋白酶的組織培養液中，控制溫度為32.2-35.3℃，保存30分鐘，將腦切片置於盛有HEPES緩衝液的細胞培養皿內，選擇所需分離的神經區域，使用細胞分離器分離神經元；篩選健康神經元；本發明通過將原代培養的化學分離方法融入到機械細胞分離中，將腦切片預先用木瓜蛋白酶處理，使中年及老年小鼠的健康神經元可以通過機械分離得到，本方法簡單方便，分離效果顯著。
文檔編號C12N5/0793GK102660506SQ20121010285
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月10日 優先權日2012年4月10日
發明者張若煜, 陳懷紅 申請人:浙江大學