一株嗜熱地芽孢桿菌njrc-14及其微生物有機肥料的製作方法

2023-05-31 11:59:46 2

一株嗜熱地芽孢桿菌njrc-14及其微生物有機肥料的製作方法
【專利摘要】本發明屬於農業集約化生產技術，公開了一株嗜熱地芽孢桿菌NJRC-14及其微生物有機肥料。本發明提供了一株嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus?kaustophilus)菌株NJRC-14，在30～50℃下能快速增殖，與菜粕進行固體發酵產生大量抑制土傳青枯病病原菌生長的物質。本發明還提供了利用菌株NJRC-14製備微生物有機肥料的方法和應用，該微生物有機肥料生產方法簡單，質量穩定，無需二次發酵，具有較好的經濟和社會效益。試驗表明，該微生物有機肥料施入土壤後能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優勢群，拮抗菌利用菜粕產生拮抗物質，抑制病原菌的生長，在發病嚴重的番茄青枯病土壤中生防效率達75%以上。
【專利說明】—株嗜熱地芽孢桿菌NJRC-14及其微生物有機肥料
【技術領域】
[0001]本發明屬於農業集約化生產技術，涉及一株嗜熱地芽孢桿菌NJRC-14及其微生物有機肥料，專用於克服和消除連作土傳青枯病問題。
【背景技術】
[0002]番爺青枯病是由爺科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum(以下簡稱為青枯菌)引起的一種細菌性維管束病害。該病是一種毀滅性的土傳病害，病菌變異大，寄主範圍廣，包括番茄、馬鈴薯、茄子、菸草等，在世界各地均有發生。該病在我國主要分布於長江以南，以廣東、廣西、福建、浙江、湖南、江蘇等省區較為普遍，在高溫高溼的條件下，病害發展迅速，發病嚴重的田塊發病率達100%，造成絕收，給我國農業造成重大經濟損失。
[0003]常用防治番茄青枯病的策略包括化學農藥、土壤改良、抗病品種、嫁接與輪作等，但效果均不穩定。此外，過量施用化學農藥帶來的環境汙染和食品安全問題，引起人們廣泛關注和擔憂。因此，必須發展環境友好型的防病措施，如施用微生物有機肥等生物防治措施，實現減少農藥用量、抑制病害發展、恢復土壤健康和提高食品安全的多重目標。
[0004]目前市場上已有一些防控土傳青枯病的微生物有機肥料，但田間應用效果不穩定。從產品開發的角度來看，以往的產品開發存在一定的問題，其中最關鍵的一點是拮抗菌與其最佳有機載體的篩選方法不合理。菜柏是生產微生物有機肥料過程中常用的有機載體，它能為拮抗菌提供豐富的營養物質，供拮抗菌在土壤中存活。我們在前期開發過程中發現用普通營養培養基篩選到的拮抗菌雖然利用菜柏的能力強，能在菜柏載體中大量增殖，但其在增殖過程中沒有產生對青枯菌有抑制作用的物質。這種拮抗菌和菜柏生產的微生物有機肥料其田間防效不穩定。

【發明內容】

[0005]I技術問題
[0006]本發明目的在於以菜柏為營養載體，篩選到一株既能快速利用菜柏，又能大量產生拮抗物質的生防菌。本發明提供的菌株NJRC-14在30~50°C下能快速增殖，與菜柏進行固體發酵能產生大量抑制土傳青枯病病原菌生長的物質，用該菌株可直接生產微生物有機肥，無需二次發酵，獲得的產品能有效控制土傳青枯病，使大量的設施農業土壤和露地連作障礙土壤得到生物修復，確保集約化農業的順利發展。
[0007]2技術方案
[0008]防除連作土傳青枯病的拮抗菌NJRC-14，該菌株屬於嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus kaustophilus), 2013年11月I日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.8422。
[0009]用拮抗菌NJRC-14所生產的防除連作土傳青枯病微生物有機肥料，該肥料中含有5X IO8個/g以上的拮抗菌NJRC-14、全氮含量質量比為4~5%，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分為6~10%、有機質含量為30~35%。[0010]所述的防除連作土傳青枯病微生物有機肥料，其生產方法包括:
[0011](I)選用拮抗菌NJRC-14，接種到菜柏PDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵條件為:pH生長範圍自然，培養溫度範圍30~50°C，攪拌速度為180~300轉/分鐘，發酵中後期形成芽孢，發酵的拮抗菌液含菌或芽孢量> I X IO10個/mL ；
[0012](2)選擇菜柏為拮抗菌的有機載體物料，將拮抗菌和菜柏進行固體發酵，每噸固體有機物料中加入拮抗菌液10~20L，發酵溫度為30~50°C，使拮抗菌NJRC-14含量達到5 X IO8個/g以上，在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為防除連作土傳青枯病微生物有機肥料。
[0013]所用菜柏PDA培養液配製方法為，以配置IL培養液為例:用200g 土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20g普通蔗糖和40g菜柏，定容至1000mL, pH值調至7.2~7.4，121°C滅菌20min。
[0014]所述拮抗菌NJRC-14的培養溫度範圍優選為37~41°C。
[0015]所述微生物有機肥料可用於防除連作土傳青枯病。
[0016]3有益效果
[0017]本發明一株嗜熱芽孢桿菌NJRC-14及其微生物有機肥料和生產方法，利用嗜熱芽孢桿菌和菜柏混合發酵製成微生物有機肥料，其產品與目前市場上的產品相比具有如下優點.
[0018](I)肥料產品中含有抑制青枯病原細菌生長的專一性高效菌株(NJRC-14)，其抑制效果非常顯著，肥料中該高效菌株的含量達到5 X IO8個/g以上，施入土壤後能形成優勢群，並在土壤中存活下來。
[0019](2)肥料產品中含有豐富的可溶性有機碳和有機氮，能給功能菌提供十分優越的生長環境，極大地提高了外來功能菌在土壤中的定殖和發揮功能的能力。
[0020](3)本發明產品有機氮含量特別高，均達到4~5% (大部分為胺基酸和小分子多肽)，確保了氮素持續穩定的供應，使作物的生長和抗逆能力大大增強。
[0021](4)本產品中功能菌能利用菜柏產生拮抗物質，施入土壤能大大降低土壤中青枯病病原菌的數量，屬於高效生防產品。
[0022](5)本產品中的拮抗菌為嗜熱菌，能適應固體發酵中的高溫，無需使用腐熟有機載體，不需要二次發酵，因此生產工藝簡便，固定資產投入少，生產過程中耗電耗水極少，市場上缺乏這種高效生防產品，因此本產品具有強大的社會、環境和經濟生命力。
[0023](6)試驗結果表明，在連作番茄的土壤上施用本產品後，能顯著降低番茄青枯病的發病率，生防率達75%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為利用點接噴霧法篩選青枯菌拮抗菌。
[0025]圖2為NJRC-14和NJQL-18分別在NA培養基(B)和RC培養基(A)平板上對青枯菌的抑制能力對比圖。
[0026]圖3為NJRC-14在NA培養基上的菌落形態(A)，中間為在體視鏡下的形態⑶，右為在顯做鏡下的形態(C)。
[0027]圖4為微生物有機肥處理防治番茄青枯病效果。【具體實施方式】
[0028](一 )菌株的分離和鑑定
[0029]1、篩選能利用菜柏產生拮抗物質的拮抗菌
[0030]採集青枯病發病地塊健康植株根際土，把健康植株連根拔起，輕輕抖動,待大部分土抖落後，剩餘緊貼根的土壤連同部分鬚根為根際土壤，取Ig根際土置於裝有9mL無菌水50mL三角瓶中(含玻璃珠)，170rpm振蕩30min，土壤懸液10倍系列稀釋後，取100 μ L懸液塗布於菜柏PDA培養基平板，30°C培養2~4d。挑取單菌落，劃線於RC培養基(80g菜柏，20g瓊脂，IL蒸餾水，pH7.2，115°C滅菌30min)平板上進行純化。
[0031]採用點接噴霧法檢測根際細菌在RC培養基平板上對青枯病致病菌的抑制能力，具體方法如下:用無菌牙籤挑取單菌落點接到RC培養基平板上，培養24h後，用裝有病原菌菌懸液(109cfu/mL)噴瓶噴I次(約0.2mL)，30°C培養48h後測定抑菌圈直徑D和菌落直徑d。每株菌重複4次。抑菌效果(Inhibition zone, IZ)計算公式:IZ=D_d。
[0032]表1利用菜柏產生拮抗物質的根際細菌及其抑菌能力
[0033]
【權利要求】
1.一種防除連作土傳青枯病的拮抗菌，該菌株NJRC-14屬於嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus kaustophilus), 2013年11月I日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.8422。
2.用權利要求1所述拮抗菌NJRC-14所生產的防除連作土傳青枯病微生物有機肥料。
3.根據權利要求2所述的防除連作土傳青枯病微生物有機肥料，其特徵在於:該肥料中含有5 X IO8個/g以上的拮抗菌NJRC-14、全氮含量質量比為4~5%，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分為6~10%、有機質含量為30~35%。
4.權利要求2或3所述防除連作土傳青枯病微生物有機肥料的生產方法，其特徵在於:包括: (1)選用拮抗菌NJRC-14，接種到菜柏PDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵條件為:PH生長範圍自然，培養溫度範圍30~50°C，攪拌速度為180~300轉/分鐘，發酵中後期形成芽孢，發酵的拮抗菌液含菌或芽孢量> I X IO10個/mL ； (2)選擇菜柏為拮抗菌的有機載體物料，將拮抗菌和菜柏進行固體發酵，每噸固體有機物料中加入拮抗菌液10~20L，發酵溫度為30~50°C，使拮抗菌NJRC-14含量達到5 X IO8個/g以上，在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為防除連作土傳青枯病微生物有機肥料。
5.根據權利要求4所述微生物有機肥料的生產方法，其特徵在於:步驟(1)所用菜柏PDA培養液配製方法為，以配置IL培養液為例:用200g 土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20g普通蔗糖和40g菜柏，定容至1000mL, pH 值調至 7.2 ~7.4，121°C 滅菌 20min。
6.根據權利要求4所述微生物有機肥料的生產方法，其特徵在於:步驟(1)所述拮抗菌NJRC-14的培養溫度範圍為37~41°C。`
7.權利要求2或3所述微生物有機肥料在防除連作土傳青枯病的應用。
【文檔編號】C05F11/08GK103740608SQ201310662410
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】徐陽春, 韋中, 胡潔, 亞歷山大·如賽 申請人:南京農業大學