組合物、裝置和相關方法

2023-06-01 01:41:26 3

專利名稱：組合物、裝置和相關方法
組合物、裝置和相關方法
相關申請的交叉引用 在藥學研究、臨床診斷、食品和飲料質量監測、水淨化、 土壤、水及空氣汙染監測、或者在化學戰劑或生物戰劑檢測等各種應 用中，可能都需要對化學分析物及生物分析物進行檢測。
0004可使用能特異性識別分析物的分子(探針)，對一種或多 種化學分析物或生物分析物進行4企測。可通過兩種分子(例如酶與底 物、抗體與抗原等)間的高度特異性相互作用來識別。可利用合適的檢 測手段來檢測識別反應是否發生，作為分析物存在與否的指示。在某 些應用中，分析物可能以極低濃度存在，探針和分析物間的識別事件 可能不易檢出。可採用分析物擴增技術來提高原本難以精確定量的分 析物的濃度。在某些分析物檢測技術中，探針與分析物間的識別可以 是部分的或者可以不是完全特異性的，導致假陽性。
圖8是根據本發明的一個實施方案的組合物的示意圖。
-丙醯胺、2，2'-偶氮雙(N,N'-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽、2，2'-偶氮雙 (2-醯氨基丙烷)二鹽酸鹽、2,2'-偶氮雙(N，N'-二亞曱基異丁醯胺)、2,2'-偶氮雙(2-甲基-N-[l,l-雙(羥曱基)-2-羥乙基]丙醯胺)、2,2'-偶氮雙(2-曱 基-N-[ 1 ， 1 -雙(羥曱基)乙基]丙醯胺)、2，2'-[2-曱基-N-(2-羥乙基)丙醯胺]、 2，2'-偶氮雙(異丁醯胺)二水合物、2,2'-偶氮雙(2,2,4-三甲基戊烷)、2，2'-偶氮雙(2-曱基丙烷)、過氧乙酸叔丁酯、過氧苯曱酸叔丁酯、過氧辛 酸叔丁酯、過氧新癸酸叔丁酯、過氧異丁酸叔丁酯、過氧新戊酸叔戊 酯、過氧新戊酸叔丁酯、過氧二碳酸全異丙酯、過氧二碳酸二環己酯、 二異丙苯基-過氧化物、二苯曱醯基過氧化物、二月桂醯過氧化物、過 二^5危酸鉀、過二闢^酸銨、連二次硝酸二^又丁酯或連二次硝酸二異丙苯 酯。光化學引發劑的合適實例可包括安息香衍生物、二苯曱酮、醯基 膦氧化物和光氧還系統。氧化還原引發劑的合適實例可包括氧化劑(例 如過二硫酸鉀、過氧化氬、叔丁基氫過氧化物)或還原劑(例如鐵(II)、
鈦(in)、碌L代亞闢b酸鉀、亞碌b酸氫鉀)或其組合。0080] 在一個實施方案中，引發劑可包括ATRP引發劑。ATRP 引發劑可包括烷基卣和過渡金屬絡合物(金屬配體絡合物)的組合。過 渡金屬絡合物可與引發劑和休眠聚合物鏈(dormant polymer chain)— 起參與氧還循環，但不與聚合物鏈形成直接碳-金屬鍵。過渡金屬絡合 物可選自Cu(I)/Cu(n)、 Fe(II)/Fe(III); Ru(II)/Ru(111)、 Cr(II)/Cr(III); Mo(0)/Mo(I); Mo(II)/Mo(III); W(II)/W(III); Rh(III)/Rh(IV); Co(I)/Co(H)、 Re(II)/Re(III); Ni(0)/Ni(I); Mn(III)/Mn(IV); V(II)/V(III); Zn(I)/Zn(II); Au(I)/Au(II);和Ag(I)/Ag(11)。配體的合適實例可包括聯吡啶、烷基取 代的聯吡啶衍生物、烷基吡啶亞胺(例如N-(丙基)-2 25吡啶基甲亞胺 (methanimine))、三胺、四胺(例如N,N，N',N",N"-五曱基二乙撐三胺和 三(2-(二曱氨基)乙基(胺))。在一個實施方案中，引發劑可引發直接 ATRP反應類型。在一個實施方案中，引發劑可引發間接ATRP反應 類型。間接ATRP引發劑可包括自由基引發劑和金屬卣化物配體絡合 物。在一個實施方案中，引發劑可包括烷基溴和CuCl絡合物。CuCl 絡合物可包括聯吡啶配體或三(2-(二曱氨基)乙基(胺))配體。在一個實施方案中，引發劑可包括ROMP引發劑。 ROMP引發劑可包括金屬亞烷基催化劑。在一個實施方案中，ROMP 《1發劑可包括一種或多種具有下式(I)至(VI)的分子或其衍生物。
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(I)
萘-1-磺醯氯(DNS，丹醯氯)、伊紅、伊紅衍生物例如異硫氰酸伊紅、赤蘚紅、 赤蘚紅衍生物例如赤蘚紅B和異硫氰酸赤蘚紅；乙錠；螢光素和衍生 物例如5-羧基螢光素(FAM)、 5-(4,6-二氯三溱-2-基)氨基螢光素 (DTAF)、 2'7'-二曱氧基-4'5'-二氯-6-羧基螢光素(JOE)、螢光素、異硫 氰酸螢光素(FITC)、 QFITC (XRITC);螢光胺衍生物(與胺反應時發熒 光)；IR144; IR1446;異硫氰酸孔雀綠；4-曱基傘形酮；鄰曱酚酞； 硝基酪氨酸；鹼性副品紅；酚紅、B-藻紅蛋白；鄰苯二曱醛衍生物(與 胺反應時發螢光)；芘和衍生物例如芘、芘丁酸和1-芘丁酸琥珀醯亞胺 基酯；活性紅4 (Reactive Red 4) (Cibacron. Brilliant Red 3B-A)、羅丹 明和衍生物例如6-羧基-X-羅丹明(ROX)、 6-羧基羅丹明(R6G)、麗絲 胺羅丹明B磺醯氯、羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、異硫氰 酸羅丹明X、磺基羅丹明B、磺基羅丹明101和磺基羅丹明101磺醯 氯衍生物(德克薩斯紅)；N,N，N'，N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA); 四曱基羅丹明、四曱基異硫氰酸羅丹明(TRITC);核黃素；玫紅酸和 鑭系螯合衍生物、量子點、花青素和方酸菁。螢光團的一些其它實例 可包括一種或者一種或多種以下螢光團螢光素、羅丹明、德克薩斯 紅、VECTORRed、 ELF(酶標記的螢光)、Cy2、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、 Cy7、 FluorX、鉤黃綠素、鈣黃綠素-AM、 CRYPTOFLUOR、 Orange (42 kDa)、 Tangerine (35 kDa)、 Gold (31 kDa)、 Red(42kDa)、 Crimson (40 kDa)、 BHMP、 BHDMAP、 Br畫Oregon、 Lucifer Yellow、 Alexa染料家 族、N-[6-(7-硝基苯-2-氧雜-l,3-二唑-4-基)氨基]己醯基](NBD)、 BODIPY、硼二吡咯亞曱基二氟化物(boron dipyrromethene difluoride)、 Oregon Green、 MITOTRACKER. Red、 DiOC(3)、 DiIC.sub.18、藻紅 蛋白、藻膽蛋白BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa)、 Spectrum Blue、 Spectrum Aqua、 Spectrum Green 、 Spectrum Gold、 Spectrum Orange、 Spectrum Red、 NADH、 NADPH、 FAD、紅外(IR)染料、環狀GDP-核糖(cGDPR)、 CalcofluorWhite、麗絲胺、傘形酮、 酪氨酸或色氨酸。 在一個實施方案中，聚合物前體可包括一個或多個帶有 信號發生器標記的單體。信號發生器標記的單體的合適實例可包括-螢光團標記的單體。螢光團標記的單體的一些實例可包括花青素標記 的單體或螢光素標記的單體。根據本發明的一個實施方案的信號發生 器標記的聚合物前體的 一些實例可包括具有下式(XIII)至(XVI)的結 構。
(XIII)
= 0.5 mg/pl, CuCl :Me6TREN= 1:1.5)。在額外的冷凍-泵-融化循環後，在氮氣下加 入引發劑修飾的石英玻片，然後進行最後一次冷凍-泵-融化循環。在 室溫下聚合過夜。從反應混合物中取出石英玻片，依次用去離子水、 DMF和NaHC03/Na2C03緩衝液漂清並風乾。然後用Perkin-Elmer LS55發光分光計，在460 nm處用激發峰測定螢光譜。
(XXII)
Me6TREN
60(XXIII) MPEO， Mw = 300
實施例14.在引發劑修飾的磁顆粒上，非螢光單體(MPEO)和螢光單 體(FITC-MA)的表面引發的ATRP共聚。 = 0.5 mg/|aL, CuCl:Me6TREN =1:1.5),使混合物發生反應但無需攪拌過夜。用磁鐵收集氧化鐵顆粒， 再依次用去離子水洗滌3次，用NaHC(VNa2C03緩沖液(pH = 9.6)洗 滌2次。用Perkin-Elmer LS55發光分光計，在NaHC03/Na2C03緩衝 液中，在460 nm處激發而測定螢光語。
實施例IS.在引發劑修飾的石英玻片上，非螢光單體(MPEO)和螢光 單體(FITC-MA)的表面引發的ATRP共聚，以觀察猝滅效果。 = 0.5 mg/nL, CuCl:bpy= 1:1.5),將混合物移入放有引發劑(例如 引發劑修飾的石英)的反應室中。聚合過夜後，通過用過量水漂清石英 而猝滅反應物。該過程得到賴氨酸標記的聚合物，見圖21。乙烯基苯曱酸在支持性ATRP引發劑石英表面上的聚
合。將乙烯基苯曱酸即VBA (0.500 g, 3.38 mmol)溶於含有0.126 g碳 酸氫鈉和0.130 g氫氧化鈉的1.5 mL脫氣去離子水中，形成澄清溶液。 將CuBr (9.9 mg， 0.138 mmol)、 CuBr2(5.1 mg， 0.023 mmol)和2， 2'-聯p比 啶(32 mg， 0.207 mmol)加入到同時裝有來自實施例7的ATRP引發劑 修飾的石英玻片和未修飾的對照玻片的小管中。小管用橡膠隔片密封 並脫氣。再將單體溶液移入小管中，溫和振搖後形成均勻的褐色溶液。 在室溫下聚合過夜。從反應混合物中取出石英玻片，依次用去離子水、 DMF和去離子水漂清並風乾。記錄玻片的紫外-可見光譜(見圖23)。 對表面結合的聚(乙烯基苯曱酸)的觀察。為了使玻片表 面染色，將季銨化(quarternized)聚芴-嵌段-聚(曱基丙烯酸二曱氨基亞 乙酉旨)溶於1:1 DMSO/水中，形成4 mg/mL澄清溶液。將玻片在溶液 中浸泡15分鐘，再用去離子水充分漂清。然後在吸收峰處或其附近(在 該情況下為約375 nm)激發，測定螢光譜(圖23)。標記後，表面引發 的聚合(SIP)反應產物的吸光度大於對照。SIP聚合物在標記後的螢光 強度大於對照的螢光強度和SIP聚合物在標記前的螢光強度。 使用表面固定的ROMP催化劑引發單體混合物(1M)的 聚合反應1:10摩爾比的Cy5-降冰片烯(結構XVI)和葡糖酸降水片烯 (結構XVIII)。表面固定的ROMP催化劑也用於引發1M單體混合物 的聚合反應1:10摩爾比的Cy5-PEG-降冰片烯和葡糖酸降冰片烯(結 構XVIII)。用胺(濃度為1% (v/v)和10% (v/v))對具有單層Cy5-NHS的 石英玻片進行表面官能化，作為對照。 石英玻片用10% (v/v) 3-氨基丙基三乙氧基矽烷和90% 三曱氧基矽烷(TMS)修飾。在THF溶液，通過ROMP方法，將ATRP 引發劑(降水片烯-溴異丁酸曱酯)與降水片烯-NHS和乙酸降冰片烯酯 共聚合，通過NH2-NHS反應，將所得大引發劑移入到胺包被的石英 表面上。所得固定在石英表面上的溴官能化降水片烯聚合物再經歷 ATRP聚合反應(使用Cu(I)Cl、 Cu(II)Br2和2，2，-聯吡啶(1:0.3:2)催化劑， 濃度為25 mM)。所用單體是FITC-MA和MPEO (1:20,摩爾比)，濃 度為1 M。=CHPh 催化劑引發ROMP反應。
實施例23.在同 一反應混合物中，在THF中同時進行ATRP和ROMP=CHPh催化劑引發ROMP反應。
實施例24.通過來自互補DNA-反義DNA雜合體的螢光單體和非螢光 單體的表面引發的ATRP反應，進行分析物檢測。
0225用生物素化DNA序列作為分析物，用鏈黴抗生物素顆 粒作為基底，將DNA序列分析物固定在基底上。探針與分析物雜交 之前，使具有5，端NH2殘基的反義DNA探針序列與NHS-ATRP引發 劑反應。然後在DNA分析物和反義DNA探針間進行雜交反應。雜交 進行5小時。雜交反應後，使用Cu(I)Cl、 Cu(II)Br2和2，2，-聯吡啶 (l:0.3:2.9)催化劑(濃度為25 mM),分析物-探針雜交體經歷ATRP反 應。所用單體為FITC-MA和MPEO(l:20,摩爾比)，濃度為1 M。
飾的鏈黴抗生物素顆粒雜交並用作對照。圖27是對照樣品和試驗樣 品使用ATRP聚合的示意圖。圖28顯示用表面引發的聚合反應(SIPS) 製備的試驗樣品和具有單個染料的對照樣品的螢光強度。當與具有單 個染料分子的樣品相比，SIPS-樣品表現出幾乎1.5倍的信號強度。
實施例25.用能結合兩種不同分析物的兩種探針的多重檢測。 本發明的分析物;險測實施例類似於實施例24，除了本實 施例包括能識別同一分析物(互補DNA序列)上的不同結合位點的多 種化學上不同的探針(不同的反義DNA序列)之外。在本實施例中，化 學上不同的各類型的探針連接在化學上不同的引發劑上。例如，與分 析物DNA中的互補序列結合的第 一反義DNA序列可與ATRP S1發劑 結合，而與分析物DNA中的不同互補序列結合的第二反義DNA序列 可與ROMP引發劑結合。根據本實施例，使樣品暴露給第一和第二反 義DNA序列，因而允許任何互補DNA序列的存在，以結合反義DNA 序列。再將DNA/DNA雜合體連續暴露在ATRP和ROMP反應條件 下，因而通過ATRP形成第 一聚合物，並通過ROMP形成第二聚合物。 觀察來自第一聚合物和第二聚合物的重合信號。因此，可準確區分同 一樣品中分析物的存在並進行定量測定。 本發明說明書或其權利要求書中所涉及的用化學名稱 或化學式表示的反應物和組分，無論是單數還是複數，在與用化學名 稱或化學類型表示的另 一物質(例如另 一反應物或溶劑)接觸之前，都 可以鑑定出它們的存在。在所得混合物、溶液或反應介質中發生的初 步和/或過渡的化學變化、轉化或反應(如果有的話)，可以鑑定出中間 體、母體批次等，並且可具有與反應產物或終產物用途不同的用途。 將指定反應物和/或組分在本公開內容給出的條件下混合在一起，可導 致其它後續變化、轉化或反應。在這些其它後續變化、轉化或反應中， 被混合在一起的反應物、成分或組分可鑑定或指示反應產物或終產 物。
[0231上述實施例是為了說明本發明的某些特徵。所附權利要 求書是用來要求保護其範圍同所構思的那樣寬的發明，並且本文所給 出的實施例是用於說明從所有可能的許多實施方案中精選出的實施 方案。因此，申請人的目的是所附權利要求書並不限於由所選出的所 用實施例來說明的發明特徵。本發明權利要求書所用的術語"包括(包 含、含有)，，及其語法變體在邏輯上也包含和包括變化程度不同的短語， 例如但不限於"基本上由……組成"和"由……組成"。必要時，可 補充範圍予以說明，這些範圍包括所有介於兩者之間的小範圍。可以 預期在這些範圍中的變化會向具有公眾並不知道的所屬領域普通技 能的技術人員表明它們自身，所附權利要求書將涵蓋這些變化。科技 進步會帶來可能的等同實施方案和替換，而這些等同實施方案和替換 因語言描述不夠準確的原因並未涵蓋在其中；所附權利要求書也應當 涵蓋這些變化。
權利要求
1.一種組合物，所述組合物包含第一探針；與第一探針結合的第一引發劑組分；第二探針；和與第二探針結合的第二引發劑組分，其中第一探針和第二探針能與同一分析物結合，和當第一引發劑組分和第二引發劑組分彼此接近且當第一探針和第二探針與分析物結合時，第一引發劑組分和第二引發劑組分能形成引發劑。
2. 權利要求1的組合物，其中第一探針或第二探針中的至少一種 能夠通過形成物理鍵而與分析物結合，所述物理鍵來自靜電相互作 用、氫鍵結合、疏水相互作用或親和相互作用中的一種或多種。
3. 權利要求1的組合物，其中第一探針或第二探針中的至少一種 能夠通過形成共價4定而與分析物結合。
4. 權利要求1的組合物，其中第一探針或第二探針中的至少一種 能夠通過在生理條件下結合常數大於約105 M"的結合機制而與分析 物結合。
5. 權利要求l的組合物，其中所述引發劑能引發控制聚合反應。
6. 權利要求1的組合物，其中所述引發劑能引發選自以下的聚 合原子轉移自由基聚合類型、開環易位聚合類型、基團轉移聚合類 型、硝基氧介導聚合類型或可逆加成斷裂鏈轉移聚合類型。
7. 權利要求1的組合物，所述組合物還包含分析物，其中第一探 針和第二探針都與所述分析物結合。
8. 權利要求7的組合物，所述組合物包含聚合物前體，其中所述 引發劑能引發所述聚合物前體的聚合反應。
9. 一種組合物，所述組合物包含權利要求8的組合物的反應產物。
10. 權利要求9的組合物，所述組合物還包含直鏈或支鏈聚合物。
11. 權利要求IO的組合物，其中所述聚合物的數均聚合度範圍為 約100克/摩爾至約1000000克/摩爾。
12. 權利要求10的組合物，其中所述聚合物具有單峰分子量分布。
13. 權利要求IO的組合物，其中所述聚合物的多分散性為小於約1.5。
14. 權利要求8的組合物，其中所述聚合物前體包含一種或多種 信號發生器。
15. 權利要求14的組合物，其中所述信號發生器包括生色團、熒 光團、拉曼活性標籤、電活性標記、磁性標記或放射性標記中的一種 或多種。
16. 權利要求14的組合物，其中所述信號發生器包括一種或多種 酶或酶的底物。
17. 權利要求1的組合物，其中所述分析物包括一種或多種選自 以下的汙染物空氣汙染物、水汙染物、土壤汙染物及其兩種或更多 組合。
18. 權利要求1的組合物，其中所述分析物包括一種或多種與肉 類副產品相關的腐敗指示劑。
19. 權利要求1的組合物，其中所述分析物包括一種或多種選自 以下的化學戰劑失能性毒劑、催淚劑、糜爛性毒劑、起皰劑、神經 性毒劑、肺毒劑、血毒劑、惡臭物及其兩種或更多的組合。
20. 權利要求1的組合物，其中所述分析物包括一種或多種選自 以下的生物戰劑病原體、毒素及其組合。
21. 權利要求1的組合物，其中所述分析物包括一種或多種選自 以下的生物分子肽、蛋白質、核酸、多糖、脂質、酶、酶的底物、 抗原、半抗原、適體、維生素及其兩種或更多的組合。
22. 權利要求1的組合物，其中第一探針和第二探針都獨立地包 括核酸、蛋白質、糖、脂質、碳水化合物、維生素、酶或酶的底物中 的一種或多種。
23. 權利要求1的組合物，所述組合物包含能與同一分析物結合 的多種探針對，其中各探針對包含與第 一引發劑組分結合的第 一探針 和與第二引發劑組分結合的第二探針，並且當所述引發劑組分彼此接近而形成引發劑且當所述探針對與所述分析物結合時，各探針對能與 所述引發劑結合。
24. 權利要求l的組合物，其中所述組合物在室溫下溶於水。
25. 權利要求1的組合物，其中所述組合物在室溫下溶於有機溶 劑，所述有機溶劑包含曱醇、乙醇、二曱亞碸、二甲基曱醯胺或N-曱基吡咯烷酮中 一種或多種。
26. —種流體組合物，所述流體組合物包含 權利要求1的組合物；聚合物前體；和 溶劑。
27. —種試劑盒，所述試劑盒包含 能夠檢測分析物的組合物，所述組合物包含 與第 一 引發劑組分結合的第 一探針；與第二引發劑組分結合的第二探針；和 聚合物前體；其中第一探針和笫二探針能與同一分析物結合，當第一引發劑組 分和第二引發劑組分彼此接近且當第 一探針和第二探針與所述分析 物結合時，第一引發劑組分和第二引發劑組分能形成引發劑，所述引 發劑能51發所述聚合物前體的聚合反應。
28. —種物品，所述物品包含基底，包含在所述基底表面上分布的分析物， 並且所述基底能夠通過所述分析物、與第一引發劑組分結合的第一探針、與第二引發劑組分結合的第二探針和引發劑而與聚合物締 合，所述引發劑是當第 一 引發劑組分和第二引發劑組分彼此接近時形 成的。
29. 權利要求28的物品，其中所述基底包括顆粒、玻片、凝膠、 細胞、組織樣品或微陣列中的一種或多種。
30. —種裝置，所述裝置包括權利要求28的物品，其中所述裝置 能夠檢測所述分析物的類型、所述分析物的含量或者同時檢測所述分 析物的類型和含量。
31. —種方法，所述方法包括使權利要求1的組合物與分析物接觸而形成複合物；其中所述復 合物具有彼此接近的第 一 引發劑組分和第二引發劑組分； 自第一引發劑組分和第二引發劑組分形成引發劑；和 使所述複合物與至少 一種聚合物前體接觸。
32. 權利要求31的方法，所述方法還包括自所述聚合物前體形成 聚合物。
33. 權利要求32的方法，所述方法還包括觀察來自所述聚合物的 信號。
34. 權利要求33的方法，所述方法還包括使所述聚合物與一種或 多種信號發生器接觸，然後觀察所述信號。
35. 權利 求33的方法，所述方法還包括找到所述信號與分析物 類型、分析物含量或者分析物類型與含量的相關性。
全文摘要
本發明組合物包含第一探針、與第一探針結合的第一引發劑組分、第二探針、以及與第二探針結合的第二引發劑組分。第一探針和第二探針能與同一分析物結合，而且當第一引發劑組分和第二引發劑組分彼此接近且當第一探針和第二探針與所述分析物結合時，第一引發劑組分和第二引發劑組分能形成引發劑。提供了相關試劑盒、裝置和方法。
文檔編號G01N33/532GK101627307SQ200780050706
公開日2010年1月13日 申請日期2007年12月4日 優先權日2006年12月4日
發明者A·蘇德, B·莫亞澤, G·A·格羅斯曼, J·R·奈爾遜, J·Y·鬼, L·羌, Z·潘, 蘇 呂, 巍 蔡, 鄭志新 申請人:通用電氣公司