一種人巨細胞病毒ul49基因抗原肽、及其抗體與應用的製作方法

2023-05-31 23:32:11

專利名稱：一種人巨細胞病毒ul49基因抗原肽、及其抗體與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫生物學領域，具體涉及人巨細胞病毒UL49基因的免疫學 研究，尤其涉及一種人巨細胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗體與應用。
背景技術：
人類巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)是一種在全世界不同 種族人群中廣泛傳播且感染率很高的病原體。目前研究發現，HCMV感染造 成的主要危害是引發移植感染、宮內感染，導致胎兒流產、骨髓發育不良、畸 形、智力低下等，因此是醫學和優生學以及骨髓移植研究中的重大課題。
病毒體外培養實驗發現，缺失UL49基因對HCMV是致死的，說明該基 因可能表達一個功能蛋白，因此UL49基因有望成為研究治療HCMV的一個 突破點。但目前HCMV UL49生物學功能尚無法確定，也無直接證據表明UL49 基因是否表達蛋白，其中一個主要原因是難以得到效價高、特異性強的抗體。
傳統製備HCMV UL49基因的抗體是採用HCMV UL49編碼的胺基酸序 列，設計並製備全長及截取片段的原核表達蛋白，繼而以此為免疫原製備抗體， 這類方法的免疫原獲取過程複雜、所獲免疫原純度得不到保證，最終製備的抗 體效價與特異性均無法滿足研究的要求。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種可通過化學合成法合成 的，能夠獲得效價高、特異性強的抗體的人巨細胞病毒UL49基因抗原肽。 本發明的另一個目的在於提供由上述人巨細胞病毒UL49基因抗原肽製備所得抗體。
本發明的另一個目的在於提供由上述人巨細胞病毒UL49基因抗原肽製備 所得抗體在製備體外診斷或治療人巨細胞病毒的藥物中的應用。 本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的-
本發明人通過Genebank上已經公開的序列確定HCMV UL49編碼胺基酸 序列，然後應用生物學軟體對HCMV UL49編碼胺基酸序列進行B細胞表位 預測，主要是對以下幾個方面的分析預測二級結構、跨膜區、親水性、可及 性、極性、柔韌性和抗原性等，然後對B細胞表位重疊區域分析，最後確定 一段12肽的高抗原性的特殊片段，該片段即為本發明的人巨細胞病毒UL49 基因抗原肽，其胺基酸序列如SEQ ID No.l所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
接著本發明人根據上述抗原肽製備相應的抗體，並採用ELISA法檢測抗 體的效價，採用Western blot方法檢測抗體對UL49原核表達蛋白、真核表達 蛋白以及HCMV顆粒的特異性，結果根據本發明抗原製備得到的抗體效價可 達1:8000以上，對UL49原核表達蛋白、真核表達蛋白以及HCMV顆粒也具 有高特異性。
由本發明人巨細胞病毒UL49基因抗原肽製備所得抗體，可以為多克隆抗 體也可以為單克隆抗體，因為該抗體的效價可達1:8000以上，且又對UL49 原核表達蛋白、真核表達蛋白以及HCMV顆粒都具有高特異性，因此可用於 製備體外診斷或治療人巨細胞病毒的藥物。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果 l.本發明的抗原肽為12個短肽，易於化學合成，且產物純度高；2. 利用本發明的抗原肽製備的抗體，其效價高、特異性強；
3. 本發明的抗原肽製備的抗體是HCMV UL49生物學功能研究的基礎要
素；
4. 利用本發明的抗原肽製備的抗體，可以對HCMV感染進行定性或定量 檢領!j。


圖1為ELISA法檢測人巨細胞病毒UL49編碼蛋白的抗體效價曲線；
其中，l為稀釋後的血清的效價曲線，2為免疫前血清的效價曲線；
圖2為Western blot檢測實施例2製備所得抗體針對UL49原核表達蛋白 的特異性的電泳其中，1為DE3裂解菌液，2為融合表達UL49大片斷(aa3 246)蛋白 的DE3裂解菌液，3為感染HCMV的HFF細胞裂解液；
圖3為Western blot檢測實施例2製備所得抗體針對UL49真核表達蛋白 的特異性的電泳其中，1為Hela細胞裂解液，2為融合表達UL49全蛋白的Hela細胞裂 解液，3為感染HCMV的HFF細胞裂解液；
圖4為Western blot檢測實施例2製備所得抗體針對HCMV感染細胞的特 異性的電泳其中，1為HFF細胞裂解液，2為感染HCMV的HFF細胞裂解液。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步地解釋，但具體實施例並不對本發 明做任何限定。實施例l人巨細胞病毒UL49基因抗原肽
本實施例首先通過專業在線軟體Genebank輸入pUL49蛋白胺基酸序列， 選擇二級結構、跨膜區、親水性、可及性、極性、柔韌性及抗原性參數模式， 分別預測各模式下pUL49的抗原序列(如表l所示)，將上述數據匯總後與吳 玉章等(吳玉章,朱錫華.一種病毒蛋白B細胞表位預測方法的建立[J].科學通 報,1994,39(24):2275 22279.)建立的B細胞表位預測法得出高分值指數的序列 (如表2所示)進行重疊性的綜合判定，最終設計得出人巨細胞病毒UL49基 因抗原肽，其胺基酸序列如SEQ ID No.l所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
表1應用不同方法預測pUL49蛋白細胞表位
預測方法 預測結果的胺基酸序列
48 49、 89 91、 200、 223、 228、 261、 294 296、 341 342、 375 377、. 443 444、 447、 467-468、 524 525、 532、 543 544、 551 553
5~23、 30~36、 45~63、 73~77、 91~108、 111~119、 157-182、 222-227、 232-250、 259-267、 295~306、 317~327、 358-366、 382~391、 399~411、 428~437、 511~528、 560-566 5 18、 41 71、 87 103、 118 123、 162 170、 181~194、 209~234、 245~267、 270~277、 295~349、 382~389、 404~413、 424~430、 435~443、 452~464、 481~505、 513~528、 534-541、 551~566
5 20、 30 37、 87~121、 157 183、 193~201、 220 234、 237~247、 295 303、 323 328、 357 367、 382 390、 401 409、 429~437、 464 471、 513 528
5 26、 39 65、 88~108、 111 120、 160 183、 186 194、 203~217、 222 228、 239 308、 316 330、 338 350、 399~411、 423 450、 480 503、 511 530、 545-566
9 16、 45 64、 117 118、 211 213、 241 249、 263 267、 299 326、 406 407、 480 481、 513 529、 553 569
365 383、 58 91、 415 442、 344 363、 18 45、 131 155、 444 51、 165->222、 527 551、 250 298、 321 342、 108 115、 228 243、 553~567、 121 127、 386 393、 308 316、 408 413、 517 523、 5 11
165 222、 5 11、 18 45、 228 243、 58~91、 415 442、 108-115、 517~523、 321~324
二級結構 親水性
可極性
極性 柔韌性 抗原性 EMBOSS抗原性
吳氏指數
6表2預測pUL49蛋白B細胞表位的平均抗原性指數
B細胞表位_胺基酸序列_吳氏抗原指數
5 11 RLRHAPH 0.1004
223 243 KRFDARADLAVYHRNQWCHQR 0.0225
517 523 RDSCLES 0,0190
321 342 QARHVEPTKIVLFALSAALRGG 0.0052
實施例2抗體的製備
本實施例根據實施例1設計得到的人巨細胞病毒UL49基因抗原肽序列 (其胺基酸序列如SEQ ID No.l所示)設置合成參數，以Fmoc固相法合成 抗原肽樹脂，再用三氟乙酸(TFA)將抗原肽與樹脂切開，初步純化製品肽後， 再用高效液相色譜法(HPLC)純化，最後將純化多肽冷凍抽乾。
選擇無病原的一級紐西蘭大白兔，抗原採用上述純化冷凍抽乾後的人巨細 胞病毒UL49基因抗原肽，實施，取血、分離純化、製備得到人巨細胞病毒U L49基因抗原肽的抗體，將該抗體於-2(rC -7(TC保存。
本實施例抗體的製備，其過程中涉及的各個步驟，如以Fmoc固相法合成 抗原肽樹脂、HPLC純化、弗氏完全佐劑乳化的抗原基礎免疫、加強免疫、以 及純化等，均為本領域技術人員根據抗原製備相應抗體所採用的常規操作。
實施例3 ELISA法檢測抗體的效價
本實施例採用ELISA法檢測實施例2製備所得抗體的效價，所用ELISA 檢測法採用本領域技術人員的常規操作用包被緩衝液將抗原(2昭/ul)稀釋 2000倍包被、封閉，將抗血清IO倍連續稀釋後加入包被孔，設對照，溫育， 用工作濃度羊抗兔IgG-HRP溫育、顯色，終止反應後在酶聯檢測儀上測定每 孔的OD45o值，與相應陰性對照，領U定值的比值〉2.1者為陽性反 。效價曲線結果如圖l所示，從圖中可以看出，實施例2製備所得抗體其效
價可達1:8000以上。
實施例4 Western blot檢測
本實施例採用Western blot方法檢測實施例2製備所得抗體對UL49原核 表達蛋白、真核表達蛋白以及HCMV顆粒的特異性，檢測過程中所涉及到的 UL49原核表達蛋白的構建、UL49真核表達蛋白的構建、HCMV病毒感染細 胞、以及Western blot檢測等試驗均為本領域技術人員的常規操作，其實驗步 驟可參考教科書或者相關試劑盒說明。
1.Western blot方法檢測實施例2製備所得抗體對UL49原核表達蛋白的特
異性
選取UL49編碼胺基酸序列的3-246 aa區域(GeneBank: DQ462280),並 選擇表達載體pGEX-4T-3 (市售)，構建原核表達載體pGEX-4T-3-UL49a質粒， 將該質粒轉染DE3細胞，用IPTG誘導表達pUL49a-GST融合蛋白，得到UL49
原核表達蛋白。
將HCMV感染人包皮成纖維細胞(HFF，市售)，收集感染病變後的HFF 細胞裂解蛋白液。
以DE3細胞裂解液為陰性對照，以上述感染病變後的HFF細胞裂解蛋白 液為陽性對照，用Western blot方法檢測實施例2製備所得抗體對UL49原核 表達蛋白的特異性。
檢測結果如圖2所示，從圖中可以看出1泳道的陰性對照樣本無條帶，3 泳道的陽性對照樣本出現條帶(UL49表達蛋白具570個胺基酸序列，理論值 為570X 110 = 62kDa)， 2泳道的UL49原核表達蛋白樣品出現條帶(UL49"46"大片段表達蛋白具244個胺基酸序列，理論值為244X110二27kDa， GST蛋 白自身分子量26kDa，原核融合表達蛋白的分子量理論值為兩者之和53 kDa)， 證明實施例2製備所得抗體對UL49原核表達蛋白具有特異性。
2. Western blot方法檢測實施例2製備所得抗體對UL49真核表達蛋白的 特異性
採用UL49編碼胺基酸全序列(GeneBank: DQ462280)，以及真核表達載 體pCDNA3.1-myc (市售)，構建真核表達載體pCDNA3.1-UL49-myc質粒， 瞬時轉染Hda細胞後收集Hela細胞裂解蛋白液，製備得到UL49真核表達蛋 白。
將HCMV感染人包皮成纖維細胞(HFF，市售)，收集感染病變後的HFF 細胞裂解蛋白液。
以Hela細胞裂解液為陰性對照，以上述感染病變後的HFF細胞裂解蛋白 液為陽性對照，用Western blot方法檢測實施例2製備所得抗體對UL49真核 表達蛋白的特異性。
檢測結果如圖3所示，從圖中可以看出1泳道的陰性對照樣本無條帶，3 泳道的陽性對照樣本出現條帶，2泳道的UL49真核表達蛋白樣品出現條帶，2、 3泳道的蛋白分子量與理論值一致(UL49表達蛋白具570個胺基酸序列，理 論值為570X110=62kDa)，證明實施例2製備所得抗體對UL49真核表達蛋 白具有特異性。
3. Western blot檢測實施例2製備所得抗體針對HCMV感染細胞的特異性 將HCMV感染人包皮成纖維細胞(HFF，市售)，收集感染病變後的HFF
細胞裂解蛋白液，以HFF細胞裂解液為陰性對照，用Western blot方法檢測實施例2製備所得抗體對HCMV感染細胞表達蛋白的特異性。
檢測結果如圖4所示，從圖中可以看出l泳道的陰性對照樣本無條帶，2 泳道的HCMV感染細胞表達蛋白樣品出現條帶，2泳道的蛋白分子量與理論 值一致(UL49表達蛋白具570個氮基酸序列，理論值為570X110二62kDa)， 證明實施例2製備所得抗體對HCMV感染細胞表達蛋白具有特異性。
根據上述實驗結果可以看出，由本發明人巨細胞病毒UL49基因抗原肽制 備得到的抗體對UL49原核表達蛋白、真核表達蛋白以及HCMV顆粒都具有 高特異性。一種人巨細胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗體與應用序列表 SEQUENCE LISTING
<110〉 暨南大學
<120〉 一種人巨細胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗體與應用
<130〉
<160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 5
1
<211〉 12
<212〉 PRT
人(human)
1
Lys Arg Phe Asp Ala Arg Ala Asp Leu Ala Val Tyr 1 5 10
2
<211〉 36
DNA
人(human)
2
aagcgcttcg acgcccgcgc tgatttggcc gtatac 36
3
36
腿
人(human)
<220〉
CDS <222〉 (1).. (36)
〈210〉 4
<211〉 12
PRT
〈213〉 人(human)
<400〉 4
Lys Arg Phe Asp Ala Arg Ala Asp Leu Ala Val Tyr 1 5 10
3 aag cgc ttc Lys Arg Phe
gac gcc cgc get gat Asp Ala Arg Ala Asp 5
ttg gcc gta tac Leu Ala Val Tyr 10
1權利要求
1、一種人巨細胞病毒UL49基因抗原肽，其特徵在於該抗原肽具有如SEQID No.1所示的胺基酸序列。
2、 一種編碼權利要求1所述抗原肽的DNA序列。
3、 根據權利要求2所述DNA序列，其特徵在於該DNA序列具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
4、 一種含有權利要求2所述DNA序列的重組載體。
5、 一種含有權利要求2所述DNA序列的重組微生物。
6、 一種診斷人巨細胞病毒的試劑，其特徵在於該試劑至少含有如權利要 求1所述抗原肽。
7、 一種與權利要求1所述抗原肽特異性結合的抗體。
8、 根據權利要求7所述抗體，其特徵在於該抗體為單克隆抗體或多克隆 抗體。
9、 權利要求7所述抗體在製備體外診斷或治療人巨細胞病毒的藥物中的 應用。
全文摘要
本發明公開一種人巨細胞病毒UL49基因抗原肽、及其抗體與應用，該抗原肽具有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本發明的抗原肽為12短肽，易於化學合成，且產物純度高。利用本發明的抗原肽製備的抗體，其效價可達1∶8000以上，對UL49原核表達蛋白、真核表達蛋白以及HCMV顆粒都具有高特異性，可用於製備體外診斷或治療人巨細胞病毒的藥物。本發明的抗原肽製備的抗體是HCMV UL49生物學功能研究的基礎要素，利用該抗體，可以對HCMV感染進行定性或定量檢測。
文檔編號C07K16/08GK101580537SQ20091004012
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月10日 優先權日2009年6月10日
發明者周天鴻, 曾志峰, 峰 朱, 李弘劍, 李月琴 申請人:暨南大學