一種結合常壓室溫等離子體誘變方式高通量篩選重組酶高產枯草芽孢桿菌宿主的方法
2023-06-01 04:14:11
一種結合常壓室溫等離子體誘變方式高通量篩選重組酶高產枯草芽孢桿菌宿主的方法
【專利摘要】本發明闡述了一種新型結合誘變與高通量篩選高產重組酶菌株的方法，屬於基因工程、酶學及發酵【技術領域】。採用ARTP誘變技術對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600宿主進行誘變，利用篩選平板初篩、96孔板高通量復篩、搖瓶發酵篩選驗證的方式獲得一株高產重組酶的突變株。以鹼性澱粉酶為篩選模式酶，高通量篩選出產酶酶活力較高的突變株B.subtilis WB600-mutl2，發酵得酶活力為186.4U/mL，為出發株酶活的130.3％。過氧化氫酶在B.subtilis WB600-mut12中異源表達後，酶活力提高至出發宿主酶活的135.0％。該發明具有重要的實用與經濟價值。
【專利說明】一種結合常壓室溫等離子體誘變方式高通量篩選重組酶高產枯草芽孢桿菌宿主的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程、酶學以及發酵【技術領域】，特別是涉及結合ARTP誘變技術和高通量篩選一株高產重組酶B.subtilis菌株的方法。
【背景技術】
[0002]枯草芽孢桿菌是一種簡單的革蘭氏陽性菌，產芽孢，遺傳學特性研究較為清楚。此夕卜，由於具有非致病性、易於發酵和具有較強的蛋白分泌和生產能力等優點，是目前原核表達系統中分泌表達外源蛋白的理想宿主。
[0003]工業酶製劑作為生物催化的中心，在大宗生化品的生產中發揮著重要的作用。常用的工業酶製劑可以基本分為二類:一類是水解酶類，包括澱粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、乳糖酶等，佔市場銷售額的75%以上，目前約有60%以上的酶製劑已用基因改良菌株生產；第二類為水解酶，佔市場銷售額10%左右，並有逐年增加的趨勢，主要為分析試劑用酶和醫藥工業用酶。在食品供應站，澱粉加工所以的酶仍然佔最大比例，為15%;其次是乳製品工業，佔14%。工業酶廣泛應用於食品、紡織、製革等工業及環境保護，因此工業酶製劑產量的提高有助於實現更大的經濟效益。
[0004]近幾年，利用ARTP誘變篩選突變菌株的技術發展比較迅速，已成為相當活躍的一個交叉學科研究領域。與傳統的誘變技術及其他的等離子體技術相比，ARTP生物誘變具有多種優點:在常壓下可以產生多種分布均勻的高活性粒子，能瞬時作用於微生物使其產生致畸突變；採用低壓射頻，有較高的安全性；產生的等離子體溫度接近室溫，可以避免溫度過高對微生物造成的熱損傷；另外，ARTP設備簡單、操作簡易、運行成本較低。目前獲得重組酶高產菌株的方法主要有:從自然界中篩選、利用傳統的物理化學方法誘變、發酵過程優化及構建重組菌等。因此，可以嘗試結合ARTP誘變技術及96孔板高通量篩選獲得重組酶高產菌株，解決當前工業酶產量偏低的現狀。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種基於ARTP誘變技術和高通量篩選高產重組蛋白
B.subtilis宿主的方法，有效提高重組酶酶活(本專利以鹼性澱粉酶為篩選模式酶，以過氧化氫酶為宿主驗證酶)。
[0006]本發明的技術方案是:將出發株B.subtilis WB600經等離子體誘變後，將鹼性澱粉酶重組質粒轉化B.subtilis WB600突變庫，利用澱粉-臺盼藍營養平板進行篩選，基於透明圈大小比對進行初篩，然後採用96孔板進行高通量復篩，將篩選獲得高產重組鹼性澱粉酶的菌株採用搖瓶培養再進行復篩驗證，最終獲得重組鹼性澱粉酶高產菌株。
[0007]其具體步驟如下:
[0008]I)出發株活化:將B.subtilis WB600進行劃線培養，挑單菌落於新鮮的LB液體培養基中，37 °C培養8?12h後，再轉接新鮮LB培養基，進行同步培養；
[0009]2) ARTP誘變處理:用無菌生理鹽水洗滌菌體，加生理鹽水重懸菌體，稀釋菌體濃度至16?8個/mL，吸5?15 μ L均勻塗於載片上，置於處理源下，進行誘變處理；
[0010]3)後培養:將誘變處理過的菌液(連同載片一起)，立即放入新鮮的LB培養基中，經2?3h後培養，稀釋菌體濃度至15?7個/mL，塗布於新鮮LB平板上培養；
[0011]4)重組酶高產菌株篩選:將含有重組酶基因的重組質粒轉化步驟3)中誘變獲得的突變體文庫，得到含有重組酶質粒的B.subtilis WB600突變體文庫；將文庫中的突變體轉接於澱粉-臺盼藍營養平板上，培養後觀察透明圈的大小，篩選菌落小透明圈大的突變株；進一步進行96孔板高通量篩選，最終通過搖瓶發酵驗證。
[0012]以上所述的菌體用無菌生理鹽水洗滌2?6次，然後再重懸於生理鹽水中，製得菌懸液(OD6tltl約為1.5?4.5);適當稀釋OD6tltl在1.0?3.0之間，以免重疊效應影響誘變的均勻性。步驟2)中ARTP誘變處理的參數設置為:氣流量6?14slm、射頻功率60?140W、時間20?40s、距處理源距離2mm。等離子體誘變後進行2?3h後培養，使DNA損傷在SOS修復中得到突變，並使突變更加穩定。
[0013]在上述篩選方法中，通過後培養塗布平板得到突變體文庫。將含有鹼性澱粉酶基因的重組質粒轉化突變體文庫，獲得含有鹼性澱粉酶重組質粒的B.subtilis WB600突變體文庫。將突變體轉移至澱粉-臺盼藍營養平板進行篩選，通過透明圈的大小篩選高產重組酶突變株，然後進行96孔板高通量復篩，獲得少量(〈20個)高產突變體，最後採用搖瓶發酵驗證高產菌株。所用的澱粉-臺盼藍營養培養基成分為:可溶性澱粉0.5?1.5%、臺盼藍 0.02 ?0.08%、NaCl 0.5 ?1.5 %、Yeast Extract 0.2 ?0.8%、Tryptone 0.5 ?
2.0%、瓊脂 1.0 ?2.5%。
[0014]種子培養基為LB培養基，37°C培養8?12h後，按0.5?3.0%的接種量接種於發酵培養基中。高通量篩選採用96孔板，每孔裝液量500?1000 μ L，所用發酵培養基其成分及配製步驟為:先配磷酸緩衝液，稱取1.5?3.0g KH2PO4和10.0?15.0g K2HPO4，定容至 10OmT, ；Yeast Extract 18.0 ?30.0g、Tryptone 8.0 ?16.0g,甘油 2.0 ?6.0mT,,溶於900mL水中；滅菌，待磷酸緩衝液冷卻至60°C左右時，加入900mL培養基中，搖勻，待用。搖瓶發酵培養基成分為:可溶性澱粉0.2?0.8%、大豆蛋白腖0.5?2.5%,NaCl 0.5?1.5%、豆餅粉1.0?2.0%，裝液量為15?80mL/250mL，發酵溫度為37°C，發酵培養時間為48?72h。用DNS法測定鹼性澱粉酶酶活。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1澱粉-臺盼藍營養平板初篩透明圈
[0016]圖2 96孔板高通量篩選結果
[0017]圖3 12號和20號突變菌株搖瓶驗證結果
【具體實施方式】
[0018]為了對本發明有更深入的了解，現結合具體的應用實例對本發明做進一步的說明。
[0019]實施例1:利用常壓室溫等離子誘變方式對B.subtilis WB600進行誘變
[0020]將出發株B.subtilis WB600在LB平板進行活化培養，挑取單菌落於新鮮LB液體培養基中，培養溫度設定為37°C，裝液量為250mL三角瓶裝20mL培養基，卡那黴素的工作濃度為50 μ g/mL,轉速200rpm，培養時間1h ;按50%的接種量轉接新鮮LB培養基，2?3h後待菌體處於同步對數生長狀態時，吸取ImL菌液，離心後用無菌生理鹽水洗滌3?5次，適當稀釋至細胞濃度OD6tltl = 1.5?2.0 ;吸取10 μ L菌液均勻塗在滅菌冷卻後的載片上；以He為工作氣體，射頻功率為100W，氣體流量lOslm，處理時間30s。
[0021]對等離子體誘變後的菌體進行後培養操作，將處理過的菌(連同載片)，立即放入5mL裝有新鮮LB液體培養基的離心管中，裝液量為lmL，封口膜封口，充分震蕩後於37°C，200rpm,後培養2?3h，使DNA在SOS修復中產生種類豐富的突變位點，並使突變穩定遺傳。
[0022]實施例2:誘變後鹼性澱粉酶高產菌株的篩選
[0023](I)澱粉-臺盼藍營養平板初篩
[0024]將後培養的菌液梯度稀釋至10_4，每個梯度分別塗兩個LB平板，37°C培養12h得到的突變體文庫，將含有鹼性澱粉酶基因的重組質粒轉化突變體文庫，得到含有鹼性澱粉酶重組質粒的B.subtilis WB600文庫，用無菌牙籤逐個點種澱粉-臺盼藍營養平板，37°C培養8?10h，挑選出透明圈大於出發菌的菌落(圖1)。
[0025](2) 96孔板高通量篩選
[0026]將上一步驟挑選出來的菌落分別接於種子培養基中，進行96孔板高通量篩選，每株做3個平行實驗，在37°C下，發酵48h，測定酶活，酶活測定結果如圖2。其中，12號和20號酶活產量提高最為顯著，分別提高至出發菌株的130.0%和121.0%。
[0027](3)搖瓶發酵篩選驗證
[0028]將高通量篩選得到的12號和20號菌進行搖瓶發酵，200rpm，培養12h，按2%的接種量轉接於發酵培養基中，250mL三角瓶裝液量30mL，發酵溫度37°C，轉速200rpm，發酵60h後，取樣離心後，用DNS法測酶活。結果顯示，搖瓶結果與96孔板復篩結果相似，12號突變株(12#)酶活提高至出發株(ck)的130.3%，酶活達到186.4U/mL(圖3)。
[0029]實施例3:過氧化氫酶在誘變宿主B.subtilis WB600_mutl2中的過量表達
[0030]將含有鹼性澱粉酶重組質粒的B.subtilis WB600_mutl2宿主，採用培養基中添加SDS至其最終濃度為0.002?0.005%的方法消除質粒，獲得不含有重組質粒的B.subtilisWB600-mutl2宿主。將已構建好的過氧化氫酶重組質粒轉化已消除質粒的B.subtilisWB600-mutl2宿主，獲得可表達重組過氧化氫酶的重組菌。發酵後測定酶活，結果顯示，誘變後的B.subtilis WB600-mutl2較出發宿主產過氧化氫酶能力提高至135.0%。
【權利要求】
1.一種結合常壓室溫等離子(ARTP)誘變方式高通量篩選高產重組酶(如鹼性澱粉酶)B.subtilis突變株的方法，其特徵為: 1)出發菌活化:將B.subtilis WB600進行劃線培養，挑單菌落於新鮮的LB液體培養基中，37°C培養8?20h後，轉接新鮮LB培養基，進行同步培養； 2)ARTP誘變處理:用無菌生理鹽水洗滌菌體後再重懸菌體，適當稀釋菌體濃度至106?8個/mL，吸5?15 μ L均勻塗於載片上，置於處理源下，進行誘變處理； 3)後培養:誘變處理過的菌液，立即放入新鮮的LB培養基中，後培養2?3h後，適當稀釋菌體濃度為105?7個/mL，塗布於新鮮的LB平板上培養； 4)重組酶高產菌株篩選:將含有重組酶基因的重組質粒轉化步驟3)中誘變獲得突變體文庫，得到含有重組酶重組質粒的B.subtilis WB600突變體文庫；將文庫中的突變體逐個點種於篩選平板(對於該專利中突變宿主篩選採用的重組鹼性澱粉酶，其篩選平板為澱粉-臺盼藍營養平板)上，培養8?12h後觀察透明圈大小，菌落小透明圈大的可能為高產鹼性澱粉酶突變株；縮小篩選範圍後，進行96孔板高通量篩選，最終進行搖瓶發酵驗證高產菌株。
2.根據權利要求1所述的結合ARTP誘變和高通量篩選重組酶高產B.subtilis突變株的方法，其特徵在於所述的2)中用無菌生理鹽水洗滌2?6次，重懸製備菌懸液(0D_約為15?45);適當稀釋0D_在1.0?3.0之間，不致重疊效應影響誘變處理的均勻性；處理參數設置為:氣流量6?14slm、射頻功率60?140W、時間20?40s、距處理源距離2?3mm ο
3.根據權利要求1所述的結合ARTP誘變和高通量篩選重組酶高產B.subtilis突變株的方法，其特徵在於:所述3)中，進行2?3h後培養，使突變中伴隨產生的DNA損傷獲得修復，並使突變更加穩定。
4.根據權利要求1所述的結合ARTP誘變和高通量篩選重組酶高產B.subtilis突變株的方法，該專利中突變宿主篩選採用重組鹼性澱粉酶作為模式酶，其特徵在於:轉化得到含有鹼性澱粉酶重組質粒的B.subtilis WB600突變體文庫，根據澱粉-臺盼藍營養平板周圍透明圈大小得到高產突變株，所用的培養基成分為:可溶性澱粉0.5?1.5%、臺盼藍0.02 ?0.08%、NaCl 0.5 ?1.5%、Yeast Extract 0.2 ?0.8%、Tryptone0.5 ?2.0%、瓊脂1.ο?2.5%，酶活測定方法選用DNS法。
5.根據權利要求1所述的結合ARTP誘變和高通量篩選重組酶高產B.subtilis突變株的方法，其特徵在於:利用96孔板進行文庫中高產突變體的高通量篩選，所用發酵培養基成分及配製步驟為:先配磷酸緩衝液，分別稱取1.5?3.0g KH2P0jP 10.0?15.0g Κ2ΗΡ04，定容至 100mL ;Yeast Extract 18.0 ?30.0g、Tryptone 8.0 ?16.0g,甘油 2.0 ?6.0mL,溶於900mL水中；滅菌，待磷酸緩衝液冷卻至60°C左右時，加入900mL培養基中，搖勻，待用。
【文檔編號】C12R1/125GK104371994SQ201410550898
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】楊海泉, 馬櫻芳, 宋江寧, 陳堅, 堵國成, 沈微, 陳獻忠, 樊遊, 劉龍 申請人:江南大學