一種菌落pcr方法及試劑盒的製作方法

2023-05-31 20:02:56 1

專利名稱：一種菌落pcr方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種菌落PCR方法及試劑盒。
背景技術：
在細菌的研究過程中，菌株的分離及鑑定是非常重要的一個環節。隨著分子生物學的迅速發展，細菌的分類鑑定已經從以形態和生理生化為主的傳統表型分類進入到各種基因型水平的分類。其中，由於16S rRNA基因由保守區和可變區組成，其大小在1.51Λ左右，所以16S rRNA基因序列分析已經成為細菌種屬鑑定和分類的標準方法。在這種方法中， PCR技術和測序技術發揮著重要的作用。PCR技術具有簡便、快速、實用等特點，已廣泛應用於生命科學研究的各個領域，在細菌的分類鑑定中更是發揮著極其重要的作用。目前在細菌的分離鑑定中，利用PCR技術擴增16S rRNA序列時，通常採用基因組 DNA的提取、菌體熱裂解及凍融等方法進行PCR擴增。提取基因組DNA首先需要將分離的菌株進行液體培養，再通過酸酚法、鹼酚法、SDS裂解法等提取其基因組DNA，最後採用PCR對 16S rRNA基因進行擴增，對序列進行分析來鑑定菌株。該方法需要提取基因組DNA，因此周期長、且所用化學試劑對操作人員有害，不能滿足菌株的快速鑑定的需要。菌落PCR是一種不必提取基因組DNA，不必酶切鑑定，直接以菌體熱解後暴露的 DNA為模板進行PCR擴增，通過16S rRNA基因序列的分析達到鑑定細菌的目的。其操作簡單，快捷，省時少力。目前普通菌落PCR方法雖然簡單、快速，但是其擴增效率經常比較低， 而且穩定性也差。

發明內容
本發明要解決的技術問題為針對普通菌落PCR的擴增效率低且穩定性差的缺陷， 提供了一種菌落PCR的方法，本發明所述方法擴增效率高，穩定性好。本發明提供的菌落PCR方法，包括以下步驟1)取菌落在含溶菌酶或蝸牛酶的緩衝液中37°C水浴處理30 60min ；2)在沸水中煮lOmin，離心後取上清進行PCR反應。溶菌酶(lysozyme)能夠通過催化肽聚糖中N-乙醯胞壁酸和N-乙醯氨基葡萄糖殘基間的β_1，4-糖苷鍵的水解，而破壞細菌的細胞壁。已廣泛應用於醫學、食品等領域。蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中製備的混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，澱粉酶，蛋白酶等20多種酶。蝸牛酶是很有價值的一種酶，它可以用於酵母以及細菌細胞壁的破碎，因此廣泛用於細胞生物學和基因工程學的研究。每克細胞經30 40mg酶在37°C保溫1小時即可溶解細胞壁，破壁率達90%以上。利用過量的蝸牛酶或溶菌酶對菌落進行處理，能夠有效地將細菌的細胞壁破碎，從而使其快速的釋放出基因組DNA，達到高效穩定地進行菌落PCR的目的。作為優選，所述溶菌酶濃度為0. 4 0. 5mg/mL。作為優選，所述蝸牛酶濃度為3 ％ig/mL。
發明人發現，用本發明所述方法單獨利用蝸牛酶對約氏乳桿菌菌落處理進行PCR 擴增，不能擴增出陽性條帶的菌落，再單獨使用溶菌酶處理後能夠得到陽性條帶，分析原因可能是蝸牛酶與溶菌酶的催化功能的差異造成的。提示本發明所述方法在應用過程中，用一種酶處理後進行PCR反應，如得不到陽性結果，可再用另一種酶處理後進行PCR反應，以達到互補且快速鑑定的目的。更優選地，本發明的一種實施方式為，取菌落在含溶菌酶(蝸牛酶)緩衝液中37°C 水浴處理30 60min ；在沸水中煮lOmin，離心後取上清進行PCR反應，如為陰性結果，取菌落在含另一種酶-蝸牛酶(溶菌酶)的緩衝液中37°C水浴處理30 60min;在沸水中煮 IOmin,離心後取上清再進行PCR反應。作為優選，所述PCR的反應體系為ddH20 37. 5 μ L，IOXPCR緩衝液5 μ L，dNTP混合物4 μ L，Taq 0. 5 μ L，細菌通用引物27F 1 μ L，細菌通用引物1492R 1「1^，上清1口1^。作為優選，所述PCR 反應條件為 95°C IOmin -MV 30s, 55 °C 30s, 72 °C Imin 30s，共30個循環；72°C延伸IOmin0本發明在傳統菌落PCR的基礎上，增加了對菌落的酶處理過程，使細菌的細胞壁得到更好的破碎，從而達到有效擴增的目的，本發明所述菌落PCR方法可適用於所有菌落， 優選為乳酸菌、芽孢桿菌或酵母菌的菌落。利用過量的酶對菌落進行處理，能夠有效地將細菌的細胞壁破碎，從而使其快速的釋放出基因組DNA，達到高效穩定地進行菌落PCR的目的。但是發明人發現，在常規PCR 體系中加入溶菌酶、蝸牛酶進行擴增，並不能得到陽性結果，分析原因是溶菌酶、蝸牛酶對於PCR體系具有抑制作用；而先對菌落加溶菌酶、蝸牛酶處理後，煮沸10分鐘，再進行PCR 反應，該抑制作用解除，分析可能是溶菌酶、蝸牛酶結合PCR反應體系的Taq酶，從而抑制 PCR擴增，煮沸後溶菌酶、蝸牛酶變性，不再對PCR體系產生影響。本發明所述菌落PCR方法適用於所有的細菌和酵母菌，優選為乳酸菌或芽孢桿菌。乳酸菌是指發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發酵過程中產生乳酸菌的細菌統稱為乳酸菌。這是一群相當龐雜的細菌，目前至少可分為18個屬，共有200多種。除極少數外，其中絕大部分都是人體內必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在於人體的腸道中。長期科學研究結果表明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，對人的健康與長壽非常重要。 本發明的一個實施例中，發明人使用了 8株不同的乳酸菌和芽孢桿菌接種到MRS 及牛肉膏蛋白腖培養基上，對所得不同菌落進行對比實驗，證明了本發明所述方法的普遍性。 本發明人通過對比的方法驗證了溶菌酶(蝸牛酶)處理的模板對菌落PCR的影響，對比組分別為處理1 普通菌落PCR的模板，用取菌針接菌落到30 μ L的無菌水裡，再取1 μ L作為模板。處理2 在處理1的基礎上，用沸水煮lOmin，取1 μ L作為模板。處理3 取少量菌落，在37°C用30yL的IX溶菌酶(蝸牛酶)緩衝液水浴60min，取1 μ L作為模板。處理4:在處理3的基礎上，將其用沸水煮IOmin取IyL作為模板。然後進行PCR反應。實驗結果表明，普通菌落PCR擴增乳酸菌效率低，不能滿足乳酸菌的篩選及鑑定要求。通過溶菌酶(蝸牛酶)的處理，並煮沸lOmin，能夠有效地解決擴增效率不高的問題。本發明人通過對比的方法驗證了不同量的溶菌酶(蝸牛酶)處理的模板對PCR擴增反應的影響，即用不同濃度的溶菌酶處理菌落PCR的模板，其濃度梯度為0. 1，0. 2,0. 4， 0.5mg/mL。用不同濃度的蝸牛酶處理菌落PCR的模板，其濃度梯度為1，2，3，％ig/mL。在其處理之後，用沸水煮lOmin。實驗結果表明，作為優選，溶菌酶濃度為0.4 0.5mg/mL。作為優選，蝸牛酶濃度為3 ％ig/mL。本發明人通過對比的方法驗證了溶菌酶(蝸牛酶)對菌落PCR模板的處理時間對擴增反應的影響，即取測試菌株的少許菌落，用30 μ L濃度為0. 4mg/mL的1 X溶菌酶緩衝液(濃度為3mg/mL的IX蝸牛酶緩衝液)水浴處理，分別取5min, 15min, 30min, 45min 和60min的處理樣品，進而用於PCR擴增反應。實驗結果表明，優選的溶菌酶處理的時間為 30min ；優選的蝸牛酶處理的時間為30min。本發明通過測序的方法對PCR產物進行驗證，同時與利用傳統方法，即對目的菌進行DNA提取，以基因組DNA為模板進行PCR擴增後測序的結果進行對比。測序結果表明， 本發明溶菌酶(蝸牛酶)處理後煮沸進行菌落PCR獲得的擴增產物和以基因組DNA為模板獲得的擴增產物測序結果相一致。本發明還提供一種菌落PCR試劑盒，包括溶菌酶或蝸牛酶。作為優選，本發明所述試劑盒還包括細菌的通用引物27F和1492R、Taq酶、PCR緩衝液、dNTP混合物。PCR 反應體系為 ddH20 37. 5 μ L，10 X PCR 緩衝液 5 μ L, dNTP 混合物 4 μ L，Taq 0. 5yL，細菌通用引物27F 1 μ L，細菌通用引物1492R1 μ L，菌落基因組模板1 μ L。本發明所述試劑盒的PCR反應條件為 95°C IOmin ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin 30s，共30個循環；72°C延伸IOmin0本發明所述菌落PCR方法解決了普通菌落PCR在鑑定中擴增效率低、且不穩定的問題，且較現有的提取基因組DNA鑑定的方法成本低且更加安全，具有廣泛的應用前景。


圖1為普通菌落PCR與用溶菌酶改進的菌落PCR的比較；圖2為不同溶菌酶量對菌落PCR擴增反應的影響；圖3為溶菌酶對菌落PCR模板的處理時間對PCR擴增反應的影響；圖4為溶菌酶對菌落PCR模板的處理時間對PCR擴增反應的影響；圖5為溶菌酶處理後預變性時間對PCR擴增的影響；圖6為普通菌落PCR與用蝸牛酶改進的菌落PCR的比較；圖7為不同蝸牛酶量對菌落PCR擴增反應的影響；圖8為蝸牛酶對菌落PCR模板的處理時間對PCR擴增反應的影響；圖9為蝸牛酶對菌落PCR模板的處理時間對PCR擴增反應的影響；圖10為蝸牛酶處理後預變性時間對PCR擴增的影響。
具體實施例方式本發明公開了一種菌落PCR方法及試劑盒，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的產品、方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合乳酸菌和芽孢桿菌的具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1 菌落培養在無菌操作臺中，將分離純化的乳酸菌和芽孢桿菌接種於MRS及牛肉膏蛋白腖培養基上，於37°C培養M 48h，其在培養基上長出肉眼可見的菌落，作為實驗所用菌落。所用菌株共8株，見表1。表1菌落PCR菌株
權利要求
1.一種菌落PCR方法，其特徵在於，包括以下步驟1)取菌落在含溶菌酶或蝸牛酶的緩衝液中37°C水浴處理30 60min；2)在沸水中煮lOmin，離心後取上清進行PCR反應。
2.根據權利要求1所述的菌落PCR方法，其特徵在於，所述菌落為乳酸菌、芽孢桿菌或酵母菌的菌落。
3.根據權利要求1所述的菌落PCR方法，其特徵在於，所述溶菌酶濃度為0.4 0. 5mg/mLo
4.根據權利要求1所述的菌落PCR方法，其特徵在於，所述蝸牛酶濃度為3 ％ig/mL。
5.根據權利要求1所述的菌落PCR方法，其特徵在於，所述PCR反應如為陰性結果，取菌落在含蝸牛酶或溶菌酶的緩衝液中37°C水浴處理30 60min ；在沸水中煮lOmin，離心後取上清再進行PCR反應。
6.根據權利要求1所述的菌落PCR方法，其特徵在於，步驟幻所述PCR反應條件為 950C IOmin ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，共 30 個循環；72°C延伸 lOmin。
7.一種菌落PCR試劑盒，其特徵在於，包括溶菌酶或蝸牛酶。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，還包括細菌的通用引物27F和1492R、 Taq酶、PCR緩衝液和dNTP混合物。
全文摘要
本發明公開了一種菌落PCR方法，主要步驟為取菌落在含溶菌酶或蝸牛酶的緩衝液中37℃水浴處理30～60min；在沸水中煮10min，離心後取上清進行PCR反應。該方法利用過量溶菌酶或蝸牛酶對菌落進行處理，有效地克服了普通菌落PCR存在的穩定性差、效率低的問題，達到快速、穩定鑑定的目的。本發明還提供一種菌落PCR試劑盒，可應用於細菌的篩選和鑑定，特別是乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌的篩選和鑑定中。
文檔編號C12Q1/68GK102230010SQ20111015958
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月14日 優先權日2011年6月14日
發明者王凡, 王安如, 王建設 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 北京科高大北農飼料有限責任公司