新型副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗及製備方法

2023-05-31 16:54:51 3

專利名稱：新型副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種副豬嗜血桿菌多價疫苗，特別是指一種副豬嗜血桿菌4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株的三價滅活疫苗及製備方法。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, Hps)引起豬的多發性眾膜炎和關節炎，該病又稱為豬革拉澤氏病(Glsser’s Disease)，曾一度被認為是由應激所引起的散發性疾病，後來被證實是由副豬嗜血桿菌所引起。副豬嗜血桿菌可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶後和保育階段發病，通常見於5 8周齡的豬，發病率一般在10% 15%，嚴重時死亡率可達50%。主要臨床症狀表現為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂；主要剖檢病變表現為纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關節炎和腦膜炎等。此外，副豬嗜血桿菌還可引起敗血症，並且在急性感染後可能留下後遺症，即母豬流產、公豬慢性跛行。 早在1910年，德國科學家Glsser就發現了副豬嗜血桿菌與豬的多發性漿膜炎和關節炎之間的聯繫。隨著世界養豬業的發展，該病已成為全球範圍內影響養豬業的典型細菌性疾病。西方發達國家在大量分離副豬嗜血桿菌的基礎上，發現該菌的血清型複雜多樣，按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)瓊脂擴散血清分型方法,至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型，另有20%以上的分離株血清型不可定；根據德國、美國、加拿大、日本和西班牙等國家的血清流行病學調查，以血清型4、5、13型最為流行；根據我國血清流行病學調查和分離菌株的鑑定，以4、5型最為流行，其次是12型、13型。近年來，各副豬嗜血桿菌血清群之間交互免疫力不強，接種的疫苗菌株血清群與當時當地流行的副豬嗜血桿菌病的病原血清群不相符，給該病的預防和治療帶來了一定的難度。目前國內用於副豬嗜血桿菌病免疫預防的疫苗有勃林格殷格翰動物保健(美國)有限公司生產的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(Z-1517株)；西班牙海博萊生物大藥廠生產的豬副豬嗜血桿菌病I型和6型滅活疫苗和華中農業大學、武漢科前動物生物製品有限責任公司、中牧實業股份有限公司生產的副豬嗜血桿菌病4型和5型滅活疫苗；這些疫苗的應用起到了一定的預防作用，而該病的病原流行株和多種血清型感染已經使現有疫苗很難達到預期的免疫效果，尤其是還沒有副豬嗜血桿菌病12型，由於沒有合適的毒株製備，加上各個抗原之間存在幹擾，一針能夠防治副豬嗜血桿菌新病原弓I起的副豬嗜血桿菌病為養殖業迫切需要解決的問題。

發明內容
有鑑於此，本發明的主要目的在於提供一種解決目前技術缺陷的副豬嗜血桿菌病，由三種抗原和獸醫學可接受的佐劑組成，其中，所述的三種抗原為已滅活的副豬嗜血桿菌血清4型JS株、已滅活的副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株、已滅活的副豬嗜血桿菌血清12型HeB株抗原。本發明使用的抗原來自副豬嗜血桿菌血清4型JS株，保藏號為CCTCC NO M2011172 ;副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株，保藏號為CCTCC NO M 2011173 ;副豬嗜血桿菌血清12 型 HeB 株，保藏號為 CCTCC NO M 2011174。優選地，本發明所述三種抗原的比例相等，副豬嗜血桿菌血清4型、5型、12型抗原含量各為 2. OX 109CFU/mL。優選地，本發明所述的獸醫學可接受的佐劑為白油佐劑、氫氧化鋁膠佐劑和Montanide IMS1313 VG,Montanide IMS 251C VG,Montanide ISA15A VG及Montanide GELPR聚合物佐劑的一種或幾種組成。優選的，本發明所述的獸醫學可接受的佐劑為水性佐劑Montanide GEL PR。更優地，本發明所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗中還含有疫苗總量O. 01% V的硫柳萊。本發明還提供了一種如上所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的製備方法，包括 以下步驟 a.分別將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株、副豬嗜血桿菌血清12型HeB株菌種繁殖培養，得到4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液；b.分別將步驟a培養得到的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液進行滅活，並濃縮菌液；c.將上述已滅活、濃縮的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等體積比例混合，並加入疫苗總量O. 01 % V的硫柳萊，然後和獸藥學上可接受的佐劑進行乳化，其中，副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗抗原含量為滅活前副豬嗜血桿菌血清4型、5型、12型活菌數各為 2. OX 109CFU/mL。d.對步驟c得到的副豬嗜血桿菌病三聯滅活疫苗進行分裝。優選地，本發明的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的製備方法中，所述獸醫學可接受的佐劑為白油佐劑、氫氧化鋁膠佐劑和Montanide IMS1313 VG、Montanide IMS 251C VG、Montanide ISA15A VG及Montanide GEL PR聚合物佐劑的一種或幾種組成。優選地，本發明所述的副豬嗜血桿菌病細菌為副豬嗜血桿菌血清4型JS株，保藏號為CCTCC NO M 2011172 ;副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株，保藏號為CCTCC NO M 2011173 ；副豬嗜血桿菌血清12型HeB株，保藏號為CCTCC NO M 2011174。本發明的另一目的在於提供如上述的副豬嗜血桿菌病三聯滅活疫苗在預防和治療副豬嗜血桿菌相關病的應用。技術效果發明人意外地分離獲得三株副豬嗜血桿菌血清4型、5型和12型的菌株，通過試驗發現這三株副豬嗜血桿菌4型JS株菌、5型ZJ株菌、12型HeB株菌製備獲得三聯滅活疫苗可以對我國目前流行的多種副豬嗜血桿菌血清型引起的副豬嗜血桿菌病有較好的預防和治療效果，特別是可以解決目前由於副豬嗜血桿菌新發病原而導致的現有疫苗治療效果不佳的問題。其次，多價疫苗常常由於抗原的相互影響而導致免疫失敗，特別是對於多血清型的副豬嗜血桿菌引起的疾病，由於血清型眾多，選擇抗原的種類和比例更加困難，而且對於大動物(豬)的免疫學實驗往往時間漫長、費用昂貴，這也是一直以來市場上未出現有效的副豬嗜血桿菌多價疫苗的原因。而本發明在獲得了三株新的副豬嗜血桿菌基礎上，通過對這三種毒株製備的抗原的濃度含量及其相互比例進行了大量工作和實踐，得到了一種抗原間配比及濃度適宜的三價疫苗，疫苗的免疫效果良好，可以有效治療和預防副豬嗜血桿菌相關疾病，解決了長期以來的多血清型副豬嗜血桿菌相關疾病的多價疫苗製備困難的問題。最後，本發明的三價滅活疫苗使用了氧化鋁膠或水型佐劑，特別發現了水性佐劑製備獲得三價滅活疫苗)安全性和免疫效果最佳，而且配苗工藝簡單，疫苗易注射，安全可靠，克服了以往常用的油性佐劑的缺點。菌株保藏說明本發明所用的菌株為副豬嗜血桿菌病血清4型JS株分類命名副豬嗜血桿菌病JS(Haemophilus parasuis JS),保藏號為CCTCCNO M 2011172 ；·副豬嗜血桿菌病血清5型ZJ株分類命名副豬嗜血桿菌病ZJ(Haemophilus parasuis ZJ),保藏號為CCTCCNO M 2011173 ；副豬嗜血桿菌病血清12型HeB株分類命名副豬嗜血桿菌病HeB(Haemophilus parasuis HeB),保藏號為:CCTCCNO Μ 2011174 ；以上三個菌株的保藏日期均為2011年5月18日，保藏地址均為中國武漢，武漢大學，中國典型培養物保藏中心，保藏單位均為中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)。


圖I為副豬嗜血桿菌三價滅活疫苗工藝流程圖。
具體實施例方式本發明提供的新型副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，所述副豬嗜血桿菌病滅活疫苗包含抗原和佐劑；其中抗原包含已滅活的副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株抗原；所述佐劑為獸醫學可接受的佐劑；作為本發明副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的優選實施方案，所述三種抗原的比例相等(即I : I : 1)，副豬嗜血桿菌血清4型、5型、12型抗原含量均為2. 0X109CFU/mL。其中，本發明的抗原含量是指在滅活前的活菌數的含量。作為本發明副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的優選實施方案，所述佐劑為白油佐齊U、氫氧化鋁膠佐劑和以卡波姆(Carbomer)為基礎的Montanide IMS1313 VG(包括同系列佐劑)、Montanide IMS 251C VG (包括同系列佐劑)、Montanide ISA15A VG (包括同系列佐齊[J)及Montanide GEL PR(包括同系列佐劑)聚合物佐劑。作為本發明副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的優選實施方案，所述疫苗中還含有疫苗總量O. 01% V的硫柳汞。新型副豬嗜血桿菌病滅活疫苗的製備方法，包含如下步驟a.分別將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株菌種繁殖培養，得到4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液；
b.分別將步驟a培養得到的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液中按總量加入O. 3%的甲醛溶液，放置37°C滅活，期間攪拌3 5次，根據計數結果濃縮菌液；c.將上述已滅活、濃縮的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等比例混合，並加入疫苗總量O. 01 %的硫柳汞，然後和不同佐劑進行乳化，成品副豬嗜血桿菌病滅活疫苗抗原含量為滅活前副豬嗜血桿菌血清4型、5型、12型活菌數各為2. OX 109CFU/mL ；d.以適量體積分裝副豬嗜血桿菌病滅活疫苗，蓋上瓶蓋，並壓鋁蓋。在上述新型副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的製備過程中，從步驟a培養好的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液取樣，進行純粹性檢驗和活菌計數；從步驟b已滅活好的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液取樣進行滅活檢驗和安檢；對步驟c得到的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗進行無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗，以確保疫苗的安全性、可靠性。本發明的新型副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，克服了現有商品化疫苗只能預防I·種或者2種副豬嗜血桿菌流行毒株引起的副豬嗜血桿菌感染的不足。本發明採用了不同的疫苗佐劑和適宜的配苗技術製備了副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，可以同時預防由副豬嗜血桿菌多種血清型引起的副豬嗜血桿菌病。可以滿足不同養殖戶和大型養殖場的需求，並達到了一針多防的效果。為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。如未特別聲明，本發明的一般實驗方法可使用本領域常用的試驗方法進行，或參考《中華人民共和國獸藥典(二〇〇五年版)》及附錄的試驗方法完成。實施例I副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的製備與效力實驗副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，由已經滅活、濃縮並且安全檢驗合格的副豬嗜血桿菌病血清4型、5型、12型菌株製備獲得，即用副豬嗜血桿菌血清4型、5型、12型菌株製備抗原，分別與Montanide IMS1313 VG (包括同系列佐劑)、Montanide IMS 251C VG (包括同系列佐劑)、Montanide ISA15A VG(包括同系列佐劑)、Montanide GEL PR(包括同系列佐劑)、白油佐劑、氫氧化鋁膠佐劑混合配製疫苗，其中，所述三種抗原濃度比例相等。I.菌種a.副豬嗜血桿菌血清4型JS株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑑定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期2011年5月18日，保藏號為CCTCC M 2011172。b.副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑑定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期2011年5月18日，保藏號為CCTCC M 2011173。c.副豬嗜血桿菌血清12型HeB株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑑定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期2011年5月18日，保藏號為CCTCC M2011174。2.菌種的繁殖a. 一級種子的繁殖上述凍幹菌種，劃線接種於TSA/NAD平板上，置37°C培養18 24小時，選取符合要求的菌落，接種於TSB/NAD液體培養基中，37°C培養12小時，作為一級種子。b. 二級種子的繁殖取一級種子的培養物，按I % V的量加入TSB/NAD液體培養基中，37°C培養12小時，經檢驗純粹後作為二級種子。3.菌液的培養在副豬嗜血桿菌培養基(商售TSB)中，加入O. 01% O. 05% (V/V)的NAD、5% 10% (V/V)的血清、O. I % 5% (V/V)的葡萄糖，將副豬嗜血桿菌血清4型、5型、12型菌種分別按1% (V/V)的量加進培養基中分別培養，混勻後置37°C培養18小時，得到三種菌液。4.純粹檢驗從上述培養好的三種菌液中取樣，用TSA/NAD培養基依《中華人民共和國獸藥典》附錄進行純粹檢驗，結果為純粹。5.活菌計數
從上述培養好的三種菌液取樣，用TSA/NAD平板培養進行活菌計數，以確定培養的菌數。6.滅活向上述三種培養好的菌液中，按總量的O. 3% (V/V)加入甲醛溶液，放置於37°C滅活24h，期間攪拌3 5次。7.滅活檢驗滅活後，取上述三種已經滅活的菌液5mL接種於IOOmL含O. 01% O. 05% (V/V)NAD、5% 10% (V/V)的血清、0.1% 5% (V/V)的葡萄糖的副豬嗜血桿菌TSB培養基中，37°C培養18小時，再移植於上述IOOmL培養基中37°C培養18小時。取滅活的菌液O. ImL劃線接種於TSA/NAD平板培養基，37°C培養24小時。以上兩種培養基培養後，均無菌生長。8.安全檢測取上述三種已滅活的菌液靜脈注射18 22g的Balb/C小鼠5隻，每隻O. 2mL,結果為三天內5/5健活,為滅活徹底。9.疫苗的配製a.油佐劑苗的配製具體成分配比如下表
主要材料組分含量(％)
獸用白油93
司本-806
硬脂酸紹I
吐溫-804
水相油相(體積比) I 1.5以白油為佐劑製成的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗。具體方法如下油相的製備白油93份，加入硬脂酸鋁I份，邊加邊攪拌，再加入6份司本-80，充分混均，121°C，30分鐘。水相製備參照菌落計數結果，將各個菌液以超濾器濃縮為5.0X1010CFU/mL·將三種血清型滅活並檢驗合格的菌液等比例混合，加入終濃度為4%滅菌吐溫-80，邊加邊攪拌，至完全溶解。乳化水相與油相的比例為I : 1.5，即I份水相配
I.5份油相在高速攪拌器中乳化2-5分鐘，在終止攪拌前加入疫苗總量的O. 01% V的硫柳汞，使得疫苗中三種抗原的含量均為2. OX 109CFU/ml。b.鋁膠佐劑苗的配製具體成分配比如下
權利要求
1.一種副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，其特徵在於，由三種副豬嗜血桿菌抗原和獸醫學可接受的佐劑組成。
2.根據權利要求I所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗其中所述抗原為已滅活的副豬嗜血桿菌血清4型JS株、已滅活的副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株、已滅活的副豬嗜血桿菌血清12型HeB株抗原。
3.根據權利要求I所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，其特徵在於，所述的副豬嗜血桿菌血清4型JS株，保藏號為CCTCC NO M 2011172 ;副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株，保藏號為CCTCC NO :M2011173 ;副豬嗜血桿菌血清12型HeB株，保藏號為CCTCC NO M 2011174。
4.根據權利要求I所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，其特徵在於，所述三種抗原的比例相等，副豬嗜血桿菌血清4型、5型、12型抗原的含量各為2. OX 109CFU/mL。
5.根據權利要求I所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，其特徵在於，所述獸醫學可接受的佐劑為白油佐劑、氫氧化鋁膠佐劑和Montanide IMS1313 VG、Montanide IMS 251CVG、Montanide ISA15A VG、Montanide GEL PR 佐劑的一種或幾種組成。
6.根據權利要求I所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，其特徵在於，所述的獸醫學可接受的佐劑為水性佐劑Montanide GEL PR。
7.根據權利要求I所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，其特徵在於，所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗中還含有疫苗總量O. 01% V/V的硫柳汞。
8.—種權利要求I所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 a.分別將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株、副豬嗜血桿菌血清12型HeB株菌種繁殖培養，得到4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液； b.分別將步驟a培養得到的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液進行滅活，並濃縮囷液； c.將上述已滅活、濃縮的4型JS株菌液、5型ZJ株菌液、12型HeB株菌液等體積比例混合，並加入疫苗總量O. 01 % (V/V)的硫柳汞，然後和獸藥學上可接受的不同佐劑進行乳化，其中，副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗抗原含量為滅活前副豬嗜血桿菌血清4型、5型、12型活菌數各為2. OX 109CFU/mL。
9.根據權利要求6所述的副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述獸醫學可接受的佐劑為白油佐劑、氫氧化鋁膠佐劑和Montanide IMS1313 VG,MontanideIMS 251C VG,Montanide ISA15A VG 及 Montanide GEL PR 聚合物佐劑的一種或幾種組成。
10.一種副豬嗜血桿菌，其特徵在於，所述的副豬嗜血桿菌為副豬嗜血桿菌血清4型JS株，保藏號為CCTCC NO M 2011172 ;副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株，保藏號為CCTCC NO M2011173 ;副豬嗜血桿菌血清12型HeB株，保藏號為CCTCC NO M 2011174。
11.根據權利要求1-7任意一項所述的三聯滅活疫苗在製備預防和治療副豬嗜血桿菌相關病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種副豬嗜血桿菌病三價滅活疫苗，含抗原的比例相等的已滅活的副豬嗜血桿菌血清4型JS株、已滅活的副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株、已滅活的副豬嗜血桿菌血清12型HeB株抗原與製備方法。本發明人分離獲得三株副豬嗜血桿菌血清4型、5型和12型的菌株，這三種毒株製備的抗原的濃度含量及其相互比例進行了大量工作和實踐，得到了一種抗原間配比及濃度適宜的三價疫苗，可以對我國目前流行的多種副豬嗜血桿菌血清型引起的副豬嗜血桿菌病有較好的預防和治療效果，特別是可以解決目前由於副豬嗜血桿菌新發病原而導致的現有疫苗治療效果不佳的問題。
文檔編號A61K39/39GK102908615SQ20111021883
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月1日 優先權日2011年8月1日
發明者張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司