一種治療m2型急性髓性白血病的藥物及其注射液的製備的製作方法
2023-06-24 03:23:36 2
專利名稱：一種治療m2型急性髓性白血病的藥物及其注射液的製備的製作方法
技術領域：
本發明是一種治療M2型急性髓性白血病的藥物及其注射液的製備方法。
背景技術：
急性白血病是一種基因組發生異常的造血幹/祖細胞疾病，常與染色體易位、倒位、缺失及原癌基因的突變等有關。最少一半以上的白血病病人伴有不同的染色體易位，易位所形成的融合蛋白可引起白血病細胞惡性增殖、分化受阻、凋亡受抑制，這與實體瘤等腫瘤不同。白血病臨床發病兇險，預後差，而其治療仍以化療為主。近年倡導的誘導分化與誘導凋亡療法為改善白血病患者的預後帶來了希望，例如上海血液學研究所開發的全反式維甲酸(ATRA)、哈爾濱醫科大學首先報導而由上海血液學研究所闡明其作用機制的三氧化二砷(ATO)治療M3型急性髓性白血病(AML M3)，為白血病的誘導分化與凋亡療法提供了範例。不過ATRA、ATO對實體瘤等其它腫瘤療效不佳，可能與白血病的發病機制和實體瘤的發病機制不同有關，同時提示對不同類型的腫瘤應根據其發病機制選取不同的治療方法，方能取得良好療效。
白血病有急慢性之分，急性者分急性淋巴細胞性白血病(ALL)與急性髓性白血病(AML)，後者又分M1～M7幾個亞型。不同亞型的白血病各有特點，對治療的反應也不一樣。M2型急性髓性白血病(AML M2)發病率較高，佔所有急性髓性白血病的25％，以具有t(8；21)染色體易位為特徵，臨床上有發熱、貧血、出血及粒細胞肉瘤等症狀體徵，而外周血中白細胞增高，紅細胞、血小板減少。AML M2的治療以阿糖胞苷、柔紅黴素等化療為主，而缺少如ATRA、ATO對於AML M3一樣有效的分化、凋亡誘導療法，因而國際上許多科研人員為開發此類療法正在進行深入的研究。我們的研究顯示，冬凌草甲素在體外可抑制各亞型的AML、ALL及慢性粒細胞性白血病(CML)白血病細胞的增殖並誘導這些細胞的凋亡，但對AML M2尤為敏感。冬凌草甲素可抑制AML M2細胞株Kasumi-1細胞及AML M2病人原代白血病細胞的增殖，並誘導這些細胞凋亡，且這種效應呈時間、劑量依賴性。在體內冬凌草甲素可延長AML M2腹水瘤小鼠的生存期，且病理檢查顯示冬凌草甲素可誘導白血病細胞的凋亡，從而顯示冬凌草甲素對AML M2有治療作用，有潛在的臨床應用價值。但冬凌草甲素的水溶性差，口服吸收少，嚴重限制了其臨床應用，因而我們製備了冬凌草甲素注射液，以通過靜脈給藥的方法來克服口服吸收少的缺點。
發明內容
本發明的目的在於開發一種治療M2型急性髓性白血病的藥物，尤其是通過誘導細胞凋亡而實現對M2型急性髓性白血病的治療。
本發明的特徵，一是採用冬凌草甲素處理AML M2細胞，發現冬凌草甲素雖然可誘導各亞型AML、ALL、CML白血病細胞凋亡，但其對AML M2白血病細胞的凋亡誘導效應尤為顯著；二是製備了冬凌草甲素注射液，方法是，先將冬凌草甲素溶解於丙二醇、吐溫80、乙醇等溶媒中，再用生理鹽水或磷酸緩衝液或注射用水稀釋，使溶媒濃度降低至5％至1％以下；或先溶於乙醇中，加入適量丙二醇/吐溫80再用生理鹽水或磷酸緩衝液或注射用水稀釋，使溶媒濃度降低至5％至1％以下。這些注射液可供臨床選用。
比較現有技術，本發明具有以下技術特點1，該藥物雖然具有廣譜的抗白血病作用，但其通過誘導細胞凋亡而實現治療M2型急性髓性白血病的效應尤為明顯。
2，化療仍是目前AML M2的主要治療方法，毒副作用較大；而骨髓移植一方面有較高的移植相關死亡率，另一方面合適的供體少且移植所需費用高，同樣有著明顯的局限性。冬凌草甲素毒副作用低且價格低廉，因而可克服這些缺點。
3，克服了冬凌草甲素水溶性差、口服吸收少的缺點，有利於開發冬凌草甲素的臨床用途。
4，為開發白血病尤其是AML M2的凋亡誘導療法奠定基礎。
具體實施例方式
I、我們用冬凌草甲素(0.5～5μM濃度)處理Kasumi-1細胞，發現其可誘導白血病細胞出現凋亡小體與DNA「梯形」條帶，磷脂醯絲氨酸表化與末端脫氧核苷醯轉移酶介導的原位凋亡檢測陽性，細胞周期出現亞G1峰，這種效應呈劑量-時間依賴性。冬凌草甲素還可引起Kasumi-1細胞線粒體跨膜電位的崩解、caspases的活化、bcl-2癌蛋白的降解等。對其它白血病細胞株如NB4、HL-60、K562、U937等細胞，冬凌草甲素也可誘導其凋亡，但所需濃度較高，在5～15μM間。
II、我們從復發、難治的AML M2病人分離原代白血病細胞，用冬凌草甲素處理後發現，冬凌草甲素在0.5～5μM可誘導這些白血病細胞凋亡；對AMLM1、AML M3、AML M4、AML M5、CML及ALL來源的白血病細胞，冬凌草甲素需較高濃度(2～15μM)方可誘導其凋亡。
III、我們將Kasumi-1細胞注射入NOD/SCID小鼠腹腔建成腹水瘤模型並用冬凌草甲素對其進行處理，發現冬凌草甲素在7.5mg/(kg·d)、15mg/(kg·d)的劑量條件下，可分別延長小鼠生存期32％與44％，提示冬凌草甲素對AMLM2的臨床治療可能有用。
IV、我們將一定量的100％丙二醇加入到純度為93％～99.9％的冬凌草甲素粉劑中，室溫條件下反覆攪拌或吹打使之充分混勻，並靜置2～24小時使冬凌草甲素充分溶解，然後用生理鹽水/磷酸緩衝液稀釋，使溶媒濃度降低至50％、25％、10％、5％及1％以下，形成無色、透明澄清的冬凌草甲素溶液，再加入適量的鹽酸或氫氧化鈉調節pH值至7.2到7.6間，即形成冬凌草甲素丙二醇注射劑。此注射液中冬凌草甲素不會沉澱析出。我們還按以上方法將冬凌草甲素溶於吐溫80中，再用生理鹽水/磷酸緩衝液稀釋，使溶媒濃度降低至50％、25％、10％、5％及1％以下，形成略帶黃色、透明澄清的冬凌草甲素溶液，再加入適量的鹽酸或氫氧化鈉調節pH值至7.2到7.6間，形成冬凌草甲素吐溫80注射劑。我們還將冬凌草甲素先溶解於丙二醇中，然後按1∶1至10∶1的比例加入吐溫80，再用生理鹽水/磷酸緩衝液稀釋，按上法製成冬凌草甲素丙二醇-吐溫80注射液。另外，我們將冬凌草甲素溶於乙醇中，按上法製成冬凌草甲素乙醇注射液及冬凌草甲素乙醇-丙二醇注射液。
V、我們分別將冬凌草甲素丙二醇注射劑、冬凌草甲素吐溫80注射劑、冬凌草甲素乙醇注射劑注射入正常昆明小鼠體內，發現冬凌草甲素在30～50mg/kg條件下不會引起小鼠的死亡。
權利要求
1，一種治療M2型急性髓性白血病的藥物，該藥物為一種注射液，其特徵在於其主要成份為冬凌草甲素。
2，如權利要求1所述的治療M2型急性髓性白血病的藥物，其作用機制在於活化caspases、下調bcl-2癌蛋白、引起線粒體跨膜電位崩解而誘導白血病細胞凋亡。
3，如權利要求1所述的治療M2型急性髓性白血病的藥物為具有環外亞甲基環戊酮結構的四環二萜類化合物，這類化合物結構相似，抗白血病作用相似。
4，如權利要求1所述的治療M2型急性髓性白血病的藥物的製備方法，其特徵在於，先將冬凌草甲素溶解於丙二醇中，再用生理鹽水或磷酸緩衝液或注射用水稀釋，使溶媒濃度降低至5％至1％以下。
5，如權利要求1所述的治療M2型急性髓性白血病的藥物的製備方法，其特徵在於，先將冬凌草甲素溶解於吐溫80中，再用生理鹽水或磷酸緩衝液或注射用水稀釋，使溶媒濃度降低至5％至1％以下。
6，如權利要求1所述的治療M2型急性髓性白血病的藥物的製備方法，其特徵在於，先將冬凌草甲素溶解於丙二醇-吐溫80中，再用生理鹽水或磷酸緩衝液或注射用水稀釋，使溶媒濃度降低至5％至1％以下。
7，如權利要求1所述的治療M2型急性髓性白血病的藥物的製備方法，其特徵在於，先將冬凌草甲素溶於乙醇中，再用生理鹽水或磷酸緩衝液或注射用水稀釋，使溶媒濃度降低至5％至1％以下。
8，如權利要求1所述的治療M2型急性髓性白血病的藥物的製備方法，其特徵在於，先將冬凌草甲素溶解於乙醇-丙二醇中，再用生理鹽水或磷酸緩衝液或注射用水稀釋，使溶媒濃度降低至5％至1％以下。
全文摘要
本發明是一種治療M2型急性髓性白血病的藥物，尤其是通過誘導細胞凋亡而實現治療M2型急性髓性白血病的中藥提取物及將其製備成為注射液。其特徵在於冬凌草甲素可誘導Kasumi－1細胞及AML M2病人原代白血病細胞凋亡，並延長荷AML M2腹水瘤小鼠的生存期。冬凌草甲素注射液的特徵是將冬凌草甲素溶解於丙二醇和/或吐溫80和/或乙醇等溶媒中，再用生理鹽水或磷酸緩衝液或注射用水稀釋，使溶媒濃度降低至5％至1％以下。這些注射液在30～50mg/kg劑量條件下對昆明小鼠無明顯毒性反應，可供臨床選用。
文檔編號A61K31/352GK1666738SQ200410016890
公開日2005年9月14日 申請日期2004年3月11日 優先權日2004年3月11日
發明者陳竺, 周光飈, 王振義, 陳賽娟 申請人:上海第二醫科大學附屬瑞金醫院