甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的製備及該抗體用於同源或異源酶聯免疫分析的方法

2023-05-30 14:24:46

專利名稱：甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的製備及該抗體用於同源或異源酶聯免疫分析的方法
技術領域：
甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的製備及該抗體用於同源或異源酶聯免疫分析的方法，本發明涉及一種特異性好、靈敏度高的甲羥孕酮醋酸酯的ELISA分析方法的建立，屬於酶聯免疫分析技術領域。
背景技術：
甲羥孕酮醋酸酯(Medroxyprogesterone acetate，MPA)是一種合成的甾體類孕激素。在人體的藥物應用中，被用作激素替代治療中的避孕藥和激素依賴性腫瘤的治療。在獸藥應用中，可用於動物治療和飼養促生長。由於不當使用和非法使用，使得動物食品中殘留過量的MPA，可對人體生殖產生抑制作用，尤其是對兒童的健康產生潛在威脅，可能會產生各種慢性和積蓄性毒性，如「三致作用」(致癌、致畸、致突變)。
由於甲羥孕酮醋酸酯具有顯著的同化作用，可顯著促進動物生長，在美國、澳大利亞、紐西蘭已批准用於動物飼料添加劑，但有嚴格的停藥期。我國和歐盟禁止其用作飼料添加劑，但仍有非法使用。為了保障我國動物食品消費者的健康和安全，加強對甲羥孕酮醋酸酯的分析監測非常必要的。
測定食品和環境中甲羥孕酮醋酸酯殘留的方法主要有高效液相色譜法、色譜-質譜聯用以及免疫分析法。其中酶聯免疫分析法(ELISA)特異性好、成本低、樣品通量高，在食品安全監測中具有非常重要的作用。但尋求操作簡便、靈敏度高、特異性高的酶聯免疫分析法(ELISA)一直是科研工作者的研究方向。
目前，國內外對甲羥孕酮醋酸酯殘留的ELISA方法研究較少，新型抗體和ELISA方法的建立為甲羥孕酮醋酸酯殘留分析提供了一個有力的手段。

發明內容
本發明的目的是提供一種甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的製備方法，同時提供其同源或異源酶聯免疫分析方法。
本發明地技術方案一種甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的製備方法，其步驟為1)人工半抗原的合成以甲羥孕酮醋酸酯、氯地孕酮醋酸酯或甲地孕酮醋酸酯為原料，其與羧甲基氧胺鹽酸鹽的投料摩爾比為1∶1.2～1∶1.5，在甲醇中溶解甲羥孕酮醋酸酯、氯地孕酮醋酸酯或甲地孕酮醋酸酯，將羧甲基氧胺鹽酸鹽和適量的乙酸鈉溶於其中，使pH為5～7，室溫下攪拌24小時。減壓蒸餾去除甲醇後，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取殘餘物，經Na2SO4乾燥，過濾，蒸餾去除乙酸乙酯，乾燥得到白色固體為3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-20-酮醋酸酯(3-CMO-MPA)、3-羧甲基肟基-6-氯-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-CMA)或3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-MEGA)；2)人工抗原的合成a免疫原的合成與純化免疫原採用碳二亞胺法合成，將50μmol半抗原3-CMO-MPA加入到1mL的N，N-二甲基甲醯胺中溶解，加入50μmol的二環己基碳二亞胺和50μmol的N-羥基琥珀醯亞胺，室溫反應過夜，離心，取上清溶液100～800μl緩慢加入到4mL10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)硼酸緩衝溶液中，攪拌反應1小時，然後透析袋中對0.01mol/L磷酸緩衝液透析，分裝保存於-20℃；b包被抗原的合成與純化包被抗原採用混合酸酐法合成，將50μmol半抗原3-CMO-MPA、3-CMO-CMA或3-CMO-MEGA加入到1mL的N，N-二甲基甲醯胺中溶解，加入50μmol的三丁胺和50μmol氯甲酸異丁酯，4℃下反應1小時，將反應液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸緩衝溶液中，攪拌反應2小時。轉入透析袋，然後透析袋中對0.01mol/L磷酸緩衝液和純水透析，分裝保存於-40℃；3)抗體的製備a免疫動物血清的製備選用三月齡、體重2kg雌性紐西蘭白兔，將3-CMO-MPA免疫原免疫三隻，免疫劑量為0.5～1.5mg免疫原/次·只，初次免疫，免疫原中加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中不分散，兔背部皮下多點注射免疫原，3～4周後，進行加強免疫，以後2～3周進行加強免疫，加強免疫時採用弗氏不完全佐劑，待血清質量合格後，採用心臟取血法採血，收集在試管中的血液凝固後，然後放置在37℃溫箱中半小時，再放到4℃冰箱中過夜，待血塊收縮後，5000rpm離心15min，分離出血清；b血清的純化採用DEAE陰離子交換樹脂純化法純化血清，在0.01M PBS緩衝液(pH7.2)中平衡樹脂，用0.01M PBS緩衝液將血清稀釋一倍，按1mL稀釋後血清比1mL樹脂的比例與樹脂混合，4℃吸附1小時，然後裝柱，0.01M PBS緩衝液(pH7.2)洗脫兩倍柱體積後，收集洗脫液，加入洗脫液等體積甘油，-40℃保存，即為抗體產品。
所述的製備方法人工合成的半抗原為3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-20-酮醋酸酯(3-CMO-MPA)，分子結構為
3-羧甲基肟基-6-氯-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-CMA)，分子結構為 或3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-MEGA)，分子結構為 所製備的抗體用於同源或異源酶聯免疫分析的方法採用抗原包被的間接競爭ELISA方法，包被抗原與免疫原的製備採用同樣的半抗原，稱為同源的ELISA方法；包被抗原與免疫原的製備採用不同的半抗原，則稱為異源的ELISA方法；用半抗原3-CMO-MPA與蛋白質偶聯，製備免疫抗原；用半抗原3-CMO-MPA、3-CMO-CMA或3-CMO-MEGA與蛋白質偶聯，製備三種包被抗原；3-CMO-MPA免疫原將包被抗原吸附於酶標板上，然後加入待測樣品，與抗體競爭反應，再加入酶標記的二抗，與結合的抗體反應，最後結合的酶催化底物溶液顯色來定量待測樣品中甲羥孕酮醋酸酯的含量。
本發明的有益效果本發明通過合成半抗原、人工抗原、經動物免疫產生特異性抗體，以抗原抗體特異性反應為基礎，建立對甲羥孕酮醋酸酯的同源或異源酶聯免疫分析方法。這種方法對甲羥孕酮醋酸酯靈敏度高、特異性強，適合食品中甲羥孕酮醋酸酯殘留的分析。


圖1 3-CMO-MPA核磁共振氫譜。
圖2 3-CMO-CMA核磁共振氫譜。
圖3 3-CMO-MEGA核磁共振氫譜。
具體實施例方式
實施例1人工半抗原3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-20-酮醋酸酯(3-CMO-MPA)的合成反應式 按投料比甲羥孕酮醋酸酯(MPA)∶羧甲基氧胺鹽酸鹽＝1∶1.2mol比，稱取1mmol MPA溶解於甲醇中，然後將1.2mmol羧甲基氧胺鹽酸鹽和適量的乙酸鈉溶於其中，使pH為6，室溫下攪拌24小時。減壓蒸餾去掉甲醇後，乙酸乙酯(3×20ml)萃取殘餘物，然後稱取10g Na2SO4乾燥，過濾，蒸餾去除乙酸乙酯，乾燥得到白色固體為3-CMO-MPA。
取上述產物分別經ESI和1H-NMR測定其結構。該物質的ESI分子離子峰為459(M--1)，1H-NMR(CDCl3)為δ0.66(s，3H，18-CH3)；1.06 and 1.10(2s，3H，E and Z 19-CH3)；2.03(s，3H，CH3CO)；2.10(s，3H，CH3COO)；4.60 and 4.63(2s，2H，CH2，Z 30％ and E 70％ CMO)；6.50 and 7.26(2s，1H，E and Z 4-H)。
實施例2人工半抗原3-羧甲基肟基-6-氯-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-CMA)的合成反應式 按投料比氯地孕酮醋酸酯∶羧甲基氧胺鹽酸鹽＝1∶1.5mol比，稱取1mmolCMA溶解於甲醇中，然後將1.5mmol羧甲基氧胺鹽酸鹽和適量的乙酸鈉溶於其中，使pH為6，室溫下攪拌24小時。減壓蒸餾去掉甲醇後，乙酸乙酯(3×20ml)萃取殘餘物，然後稱取用10g Na2SO4乾燥，過濾，蒸餾去除乙酸乙酯，乾燥得到白色固體為3-CMO-CMA。
取上述產物分別經ESI和1H-NMR測定其結構。該物質的ESI分子離子峰477(M--1)，1H-NMR(CDCl3)為δ0.70(s，3H，18-CH3)；1.00 and 1.05(2s，3H，E and Z 19-CH3)；2.05(s，3H，CH3CO)；2.09(s，3H，CH3COO)；4.66 and 4.70(2s，2H，CH2，Z 33％ and E 67％ CMO)；6.05，6.15，(2d，1H，E and Z 7-H)；6.50 and 7.11(2s，1H，E and Z 4-H)。
實施例3人工半抗原3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-MEGA)的合成反應式 按投料比甲地孕酮醋酸酯∶羧甲基氧胺鹽酸鹽＝1∶1.5mol比，稱取1mmolMEGA溶解於甲醇中，然後將1.5mmol羧甲基氧胺鹽酸鹽和適量的乙酸鈉溶於其中，使pH為6，室溫下攪拌24小時。減壓蒸餾去掉甲醇後，乙酸乙酯(3×20ml)萃取殘餘物，然後稱取用10g Na2SO4乾燥，過濾，蒸餾去除乙酸乙酯，乾燥得到白色固體為3-CMO-MEGA。
取上述產物分別經ESI和1H-NMR測定其結構。該物質的ESI分子離子峰477(M--1)，1H-NMR(CDCl3)為δ0.70(s，3H，18-CH3)；0.95 and 1.00(2s，3H，E and Z 19-CH3)；2.05(s，3H，CH3CO)；2.09(s，3H，CH3COO)；4.63 and 4.67(2s，2H，CH2，Z 30％ and E 70％ CMO)；5.71，6.00(2d，1H，E and Z 7-H)；6.61 and 7.26(2s，1H，E and Z 4-H)。
實施例43-CMO-MPA的免疫原和包被抗原合成免疫原的合成與純化免疫原採用碳二亞胺法合成。將50mmol半抗原3-CMO-MPA加入到1mLN，N-二甲基甲醯胺中溶解，加入50mmol的二環己基碳二亞胺和50mmol N-羥基琥珀醯亞胺，室溫反應過夜，離心，取上清溶液100～800μl緩慢加入到4mL10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)硼酸緩衝溶液中，磁力攪拌反應1小時，然後透析袋中對0.01mol/L磷酸緩衝5×5L透析，分裝保存於-20℃中。
包被抗原的合成與純化包被抗原採用混合酸酐法合成。將50mmol半抗原3-CMO-MPA加入到1mLN，N-二甲基甲醯胺中溶解，加入50mmol的三丁胺和50mmol氯甲酸異丁酯，4℃下反應1小時。反應液加入10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸緩衝溶液中，攪拌反應2小時。然後轉入透析袋，分別用0.01mol/mL的磷酸鹽緩衝液和純水透析，分裝-40℃冷凍乾燥保存。
人工抗原的鑑定分別紫外掃描3-CMO-MPA、載體蛋白及偶聯物(200～500nm)，確定各物質的摩爾吸光係數，計算半抗原和載體蛋白的結合比如下3-CMO-MPA-BSA 5～20∶1 3-CMO-MPA-OVA 2～15∶1實施例53-CMO-CMA的包被抗原合成採用混合酸酐法合成。將50mmol半抗原3-CMO-CMA加入到1mL N，N-二甲基甲醯胺中溶解，加入50mmol的三丁胺和50mmol氯甲酸異丁酯，4℃下反應1小時。反應液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸緩衝溶液中，攪拌反應2小時。然後轉入透析袋，分別用0.01mol/mL的磷酸鹽緩衝液和純水透析，分裝-40℃冷凍乾燥保存。
人工抗原的鑑定分別紫外掃描3-CMO-CMA、載體蛋白及偶聯物(200～500nm)，確定各物質的摩爾吸光係數，計算半抗原和載體蛋白的結合比如下3-CMO-CMA-OVA 2～12∶1實施例63-CMO-MEGA的包被抗原合成包被抗原採用混合酸酐法合成。將50mmol半抗原3-CMO-MEGA加入到1mL N，N-二甲基甲醯胺中溶解，加入50mmol的三丁胺和50mmol氯甲酸異丁酯，4℃下反應1小時。反應液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸緩衝溶液中，攪拌反應2小時。然後轉入透析袋，分別用0.01mol/mL的磷酸鹽緩衝液和純水透析，分裝-40℃冷凍乾燥保存。
人工抗原的鑑定分別紫外掃描3-CMO-MEGA、載體蛋白及偶聯物(200～500nm)，確定各物質的摩爾吸光係數，計算半抗原和載體蛋白的結合比如下3-CMO-MEGA-OVA 5～15∶1實施例7MPA抗體的製備免疫動物血清的製備選用三月齡、體重2kg左右雌性紐西蘭白兔，免疫三隻。免疫劑量為0.5～1.5mg免疫原/次·只。初次免疫，免疫原中加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中不分散，兔背部皮下多點注射的免疫原。3～4周後，進行加強免疫，以後2～3周進行加強免疫，加強免疫時採用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，在免疫後一周於白兔耳緣靜脈採血，血清經適當稀釋後採用間接ELISA測定其效價和特異性。免疫血清達到要求後，進行採血，分離血清。
本試驗採用心臟取血法。每隻兔子可得血80mL左右。採血後，待收集在試管中的血液凝固後，然後放置在37℃溫箱中半小時，再放到4℃冰箱中過夜，待血塊收縮後，將血清吸出，5000rpm離心15min，分離出血清。
抗體的純化採用DEAE陰離子交換樹脂純化法純化抗體。在0.01M PBS緩衝液(pH7.2)中平衡樹脂，將稀釋一倍的血清，按1mL血清/1mL樹脂的比例與樹脂混合，4℃吸附1小時，然後裝柱，0.01M PBS緩衝液(pH7.2)洗脫兩倍柱體積後，收集洗脫液，加入等量甘油，分裝-40℃保存。
實施例8甲羥孕酮醋酸酯的ELISA方法甲羥孕酮醋酸酯ELISA方法的原理採用抗原包被的間接競爭ELISA方法。免疫原採用3-CMO-MPA-BSA，包被抗原分別採用3-CMO-MPA-OVA、3-CMO-CMA-OVA或3-CMO-MEGA-OVA。包被抗原與免疫原的製備採用同樣的半抗原，稱為同源的ELISA方法，如果採用不同的半抗原，則稱為異源的ELISA方法。將包被抗原吸附於96孔酶標板上，然後加入待測藥物，與抗體競爭反應，待測藥物含量越高，與固相上的包被抗原結合的抗體就越少。然後再加入酶標記的二抗，與結合的抗體反應，最後結合的酶催化底物溶液顯色來定量待測藥物的量。
ELISA方法的建立1)採用不同的包被抗原建立ELISA方法。得到一種同源，兩種異源的ELISA方法。
2)方陣滴定法確定包被抗原、抗體和HRP酶標記羊抗兔IgG的最適工作濃度。
將抗原、抗體及酶標記物系列稀釋，採用非競爭ELISA法分析不同濃度下的吸光值，選擇吸光值在1.0左右的工作濃度。具體操作如下將包被抗原用包被緩衝液作系列稀釋，1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000稀釋後按列包被6列96孔酶標板，100μL/孔，於4℃冰箱過夜。次日取出酶標板回至室溫，每孔注入200μL PBST溶液，搖床上振蕩3min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍幹，繼續洗滌2次(以下洗滌方法相同)。用封閉液封閉酶標板，200μL/孔，於37℃溫育箱內溫育2h後，取出洗滌，烘乾。
將抗體系列稀釋成1∶600、1∶1800、1∶3600、1∶7200、1∶14400、1∶28800、1∶57600和1∶115200，安排對應加入到酶標板的1～6列，100μL/孔，35℃孵育30min後洗滌、拍幹。
每孔加入100μL，1∶3000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，25℃孵育30min後洗滌、拍幹。
每孔加入100μL顯色液(0.1g/L四甲基聯苯胺與0.05g/L過氧化氫的檸檬酸緩衝溶液)，暗處35℃反應30min，取出後每孔加入100μL終止液(2mol/L的硫酸)，用酶標儀測定光密度值A450nm。
3)競爭ELISA方法採用方陣法確定的各免疫反應物合適工作濃度。在抗原包被的板中加入系列抗原標準液50μL和抗體溶液50μL，35℃孵育30min，洗滌。再加入酶標溶液100μL35℃孵育30min，洗滌。經顯色反應和並終止後，測試450nm下吸光值。
4)競爭ELISA方法的靈敏度根據抑制率與MPA濃度的半對數作圖得到標準曲線。抑制率按下列公式計算 公式中Amax為不加標準液時的吸光值，Amin為空白對照孔的吸光值，Ax為加入獸藥標準液時的吸光值。
由上述公式計算得到各MPA濃度的抑制率。同源ELISA方法測定MPA時，抑制率為50％時的濃度(IC50)為10ng/mL，靈敏度(以抑制率為10％時的濃度表示，IC10)為0.2ng/mL。採用3-CMO-CMA-OVA為包被抗原，異源ELISA方法測定MPA時，IC50為2.0ng/mL，靈敏度為0.05ng/mL。採用3-CMO-MEGA-OVA為包被抗原，異源ELISA方法測定MPA時，IC50為3.9ng/mL，靈敏度為0.05ng/mL。抑制率與MPA濃度呈顯著線形關係，同源ELISA法的相關係數為r＝0.9912，採用3-CMO-CMA-OVA為包被抗原的異源ELISA方法的相關係數r＝0.9931，採用3-CMO-MEGA-OVA為包被抗原的異源ELISA方法的相關係數r＝0.9859。
5)ELISA方法特異性抗血清的特異性指它特異性抗原的結合能力同該抗原類似物結合能力的比較。常用交叉反應率作為評價指標。交叉反應越小，ELISA的特異性越好。交叉反應率按如下公式計算 式中標準物的IC50指採用特異性抗原的標液測試IC50，交叉反應物的IC50為採用類似物測試IC50。
同源ELISA方法對幾種合成孕激素有交叉反應，對氯地孕酮的交叉反應率為15.8％，對甲地孕酮的交叉反應率為28.5％，對其他孕激素類似物的交叉反應率小於0.5％。
採用3-CMO-CMA-OVA為包被抗原的異源ELISA方法的交叉反應對氯地孕酮的交叉反應率為35.2％，對甲地孕酮的交叉反應率為23.8％，對其他孕激素類似物的交叉反應率小於0.5％。
採用3-CMO-MEGA-OVA為包被抗原的異源ELISA方法的交叉反應對氯地孕酮的交叉反應率為29.7％，對甲地孕酮的交叉反應率為45.8％，對其他孕激素類似物的交叉反應率小於0.5％。
從而得知，所建立的三種ELISA方法的靈敏度較高，特異性均較強。
權利要求
1.一種甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的製備方法，其特徵在於1)人工半抗原的合成以甲羥孕酮醋酸酯、氯地孕酮醋酸酯或甲地孕酮醋酸酯為原料，其與羧甲基氧胺鹽酸鹽的投料摩爾比為1∶1.2～1∶1.5，在甲醇中溶解甲羥孕酮醋酸酯、氯地孕酮醋酸酯或甲地孕酮醋酸酯，然後將羧甲基氧胺鹽酸鹽和適量的乙酸鈉溶於其中，使pH為5～7，室溫下攪拌24小時，減壓蒸餾去除甲醇後，用乙酸乙酯萃取殘餘物，經Na2SO4乾燥，過濾，蒸餾去除乙酸乙酯，乾燥得到白色固體為3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-20-酮醋酸酯(3-CMO-MPA)、3-羧甲基肟基-6-氯-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-CMA)或3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-MEGA)；2)人工抗原的合成a免疫原的合成與純化免疫原採用碳二亞胺法合成，將50μmol半抗原3-CMO-MPA加入到1mL的N，N-二甲基甲醯胺中溶解，加入50μmol的二環己基碳二亞胺和50μmol的N-羥基琥珀醯亞胺，室溫反應過夜，離心，取上清溶液100～800μl緩慢加入到4mL10mg/mL的牛血清白蛋白硼酸緩衝溶液中，攪拌反應1小時，然後透析袋中對0.01mol/L磷酸緩衝液透析，分裝保存於-20℃；b包被抗原的合成與純化包被抗原採用混合酸酐法合成，將50μmol半抗原3-CMO-MPA、3-CMO-CMA或3-CMO-MEGA加入到1mL的N，N-二甲基甲醯胺中溶解，加入50μmol的三丁胺和50μmol氯甲酸異丁酯，4℃下反應1小時，將反應液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白碳酸緩衝溶液中，攪拌反應2小時，然後透析袋中對0.01mol/L磷酸緩衝液和純水透析，分裝保存於-40℃；3)抗體的製備a免疫動物血清的製備選用三月齡、體重2kg雌性紐西蘭白兔，將3-CMO-MPA免疫原免疫三隻，免疫劑量為0.5～1.5mg免疫原/次·只，初次免疫，免疫原中加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中不分散，兔背部皮下多點注射免疫原，3～4周後，進行加強免疫，以後2～3周進行加強免疫，加強免疫時採用弗氏不完全佐劑，待血清質量合格後，採用心臟取血法採血，收集在試管中的血液凝固後，然後放置在37℃溫箱中半小時，再放到4℃冰箱中過夜，待血塊收縮後，5000rpm離心15min，分離出血清；b血清的純化採用DEAE陰離子交換樹脂純化法純化血清，在pH7.2的0.01M PBS緩衝液中平衡樹脂，用0.01M PBS緩衝液將血清稀釋一倍，按1mL稀釋後血清比1mL樹脂的比例與樹脂混合，4℃吸附1小時，然後裝柱，pH7.2的0.01M PBS緩衝液洗脫兩倍柱體積後，收集洗脫液，加入洗脫液的等體積甘油，-40℃保存，即為抗體產品。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是人工合成的半抗原為3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-20-酮醋酸酯(3-CMO-MPA)，分子結構為
3-羧甲基肟基-6-氯-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-CMA)，分子結構為 或3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羥基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-MEGA)，分子結構為
3.用權利要求1方法製備的抗體用於同源或異源酶聯免疫分析的方法，其特徵是採用抗原包被的間接競爭ELISA方法，包被抗原與免疫原的製備採用同樣的半抗原，稱為同源的ELISA方法；包被抗原與免疫原的製備採用不同的半抗原，則稱為異源的ELISA方法；用半抗原3-CMO-MPA與蛋白質偶聯，製備免疫抗原；用半抗原3-CMO-MPA、3-CMO-CMA或3-CMO-MEGA與蛋白質偶聯，製備三種包被抗原；3-CMO-MPA免疫原將包被抗原吸附於酶標板上，然後加入待測樣品，與抗體競爭反應，再加入酶標記的二抗，與結合的抗體反應，最後結合的酶催化底物溶液顯色來定量待測樣品中甲羥孕酮醋酸酯的含量。
全文摘要
甲羥孕酮醋酸酯特異性抗體的製備及該抗體用於同源或異源酶聯免疫分析的方法，屬於酶聯免疫分析技術領域。本發明製備了半抗原3－羧甲基肟基－6－甲基－17α－羥基－孕甾－20－酮醋酸酯(3－CMO－MPA)、3－羧甲基肟基－6－氯－17α－羥基－孕甾－6－烯－20－酮醋酸酯(3－CMO－CMA)或3－羧甲基肟基－6－甲基－17α－羥基－孕甾－6－烯－20－酮醋酸酯(3－CMO－MEGA)。將半抗原3－CMO－MPA與蛋白質偶聯，製備免疫抗原；將半抗原3－CMO－MPA、3－CMO－CMA或3－CMO－MEGA與蛋白質偶聯，製備三種包被抗原。將免疫抗原免疫動物，產生的抗體能與甲羥孕酮醋酸酯發生特異性的反應，用該抗體建立的同源或異源酶聯免疫分析方法可快速、靈敏的檢測樣本中的甲羥孕酮醋酸酯含量。
文檔編號G01N33/535GK101066998SQ20071002204
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月27日 優先權日2007年4月27日
發明者金徵宇, 彭池方, 胥傳來, 謝正軍 申請人:江南大學