一種分離及培養人胚嗅鞘細胞的方法
2023-05-31 06:58:26 1
專利名稱：一種分離及培養人胚嗅鞘細胞的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種分離及培養人胚嗅鞘細胞的方法。
背景技術：
嗅黏膜嗅鞘細胞(olfactory ensheathing cells,OECs)能促進中樞軸突的再生。近年來嗅鞘細胞移植的研究，為中樞神經系統損傷後的再生帶來希望。OECs主要分布在嗅球和嗅黏膜中，目前進行OECs移植的實驗材料大多取自嗅球，獲取足夠數量的OECs是臨床應用的前提。另外，由於OECs具有特殊的細胞形態，突起十分細長。成纖維胞不能被p75抗體標記，據此可以區分出OECs和成纖維細胞。OECs培養的最終目的是應用於臨床修復脊髓損傷，這要求具有足夠的細胞數，鑑於OECs的取材及培養都有難度，而且其他細胞汙染難以避免，如何在保證細胞活性的前提下純化OECs具有重要的臨床意義。
發明內容
本發明提出一種分離及培養人胚OECs的方法，其可應用於人胚OECs的培養和純化過程；所述培養和純化過程包括OECs的分離培養；培養皿的包被；OECs的純化；以及OECs的染色鑑定。所述的OECs的分離及培養方法包括如下步驟Sl 取2-3月齡流產胎兒，解剖顯微鏡下分離出兩側嗅球，移入含D-Hank』 s液的
培養皿；S2:在解剖顯微鏡下去除毛細血管網，將嗅球最外層的嗅神經層、小球層連同包被的軟膜一起剝下；S3 用D-Hank，s液洗2次，用虹膜剪剪碎，然後用0. 25%胰酶37°C消化30min，加入含血清培養液終止消化；S4 使用200目濾網過濾去除大塊組織，過濾液600g離心5min ；以及S5 棄上清，用含i^rskolin和BPE的全培養液重懸，調整細胞濃度為lX105/ml，接種於p75包被的培養皿。每2天換液1次。所述PECs培養和純化過程中的培養皿的包被；OECs的純化；以及S4 =OECs的染色鑑定的步驟具體如下培養皿的包被將P75單抗用D-Hanks液配製成1 1000的濃度，浸沒包被培養皿皿底後吸出，置超淨臺自然乾燥後備用，用前培養液溼潤。OECs的純化培養7天後更換條件培養液(其為全培養液加入終濃度為2X10-7mol/L的Ara-C)，培養48小時後替換為全培養液。OECs的染色鑑定將純化後生長良好的細胞，用常規方法進行免疫細胞化學染色。貼壁細胞去培養基，用PBS洗3次，經4%的多聚甲醛固定30min。PBS洗滌3次，0. 3%TritonX-IOO處理20min。PBS漂洗3次，10%羊血清室溫封閉20min，吸出血清，加入鼠抗人p75IgG單抗，37°C孵育2小時後PBS洗3次，加入FITC結合的羊抗鼠IgG(l 500)孵育30min。顯色後在顯微鏡下觀察。
本發明的分離及培養人胚嗅鞘細胞的方法，OECs經培養2 14天後仍保持雪旺細胞的雙極和三極形態，細胞排布由雜亂無章，走向排列一致；採用適量的DMSO有保護軸突及髓鞘、減少水腫、促進神經周圍血液流速、穩定細胞溶酶體膜和清除自由基之功效。
通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特徵和優點將變得顯而易見。其中圖1至圖4所示為純化後生長良好的細胞在培養生長及處理的不同階段的顯微放大圖；圖5所示為本發明的分離、培養及純化人胚嗅鞘細胞的方法流程示意圖。圖6所示為本發明的分離及培養人胚嗅鞘細胞的方法流程示意圖。
具體實施例方式本發明的一實施例的分離及培養人胚嗅鞘細胞的方法，其應用於人胚嗅鞘細胞的純化過程。本實施例採用的材料和設備包括DMEM/F12、FBS(G ibco)，Forskolin, ΒΡΕ, DMS0,Ara-C(Sigma)，胰酶(華美生物)，鼠抗人p75IgG單抗(S anta Curz), FITC結合的羊抗鼠IgG(BI0S0U RCE) 0解剖顯微鏡SXP-IB(上海醫用光學儀器廠)，CO2培養箱(SPXCorporation)，超淨工作檯(蘇州蘇淨安泰公司)，倒置顯微鏡CK-40、螢光顯微鏡BX-51、數碼成像系統DP-50 (Olympus)。如圖5所示，所述的人胚嗅鞘細胞的純化過程步驟包括OECs的分離培養(如圖6所示的步驟)取2-3月齡流產胎兒，解剖顯微鏡下分離出兩側嗅球，移入含D-Hank』 s液的培養皿，在解剖顯微鏡下去除毛細血管網，將嗅球最外層的嗅神經層、小球層連同包被的軟膜一起剝下。用D-Hank』 s液洗2次，用虹膜剪剪碎，然後用0. 25%胰酶37°C消化30min，加入含血清培養液終止消化。200目濾網過濾去除大塊組織，過濾液600g離心5min。棄上清，用含Forskolin和BPE的全培養液重懸，調整細胞濃度為lX105/ml，接種於p75包被的培養皿。每2天換液1次。培養皿的包被將p75單抗用D-Hanks液配製成1 1000的濃度，浸沒包被培養皿皿底後吸出，置超淨臺自然乾燥後備用，用前培養液溼潤。OECs的純化培養7天後更換條件培養液(其為全培養液加入終濃度為2X10-7mol/L的Ara-C)，培養48小時後替換為全培養液。OECs的染色鑑定將純化後生長良好的細胞，用常規方法進行免疫細胞化學染色。貼壁細胞去培養基，用PBS洗3次，經4%的多聚甲醛固定30min。PBS洗滌3次，0. 3%TritonX-100處理20min。PBS漂洗3次，10%羊血清室溫封閉20min，吸出血清，加入鼠抗人p75IgG單抗，37°C孵育2小時後PBS洗3次，加入FITC結合的羊抗鼠IgG(l 500)孵育30mi η。顯色後在顯微鏡下觀察。實驗結果分析倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養Mh內大部分細胞已經貼壁，呈球形。培養2天後，開始出現少量雙極細胞及三角形細胞，突起短小。5天後，大部分細胞胞體折光性較強，呈三角形、梭形，細胞發出纖細的突起，偶見成纖維細胞(如圖1所示)；培養第7天，雙極細胞與三極細胞連成網絡狀，有些細胞由圓形變成梭形，突起更細更長。培養第10天，細胞形態呈現雙極、三極，走向較一致，大致與雪旺細胞形態接近，雙極細胞折光性很強，成纖維細胞明顯增多(如圖2所示)。經Ara-C處理後，成纖維細胞明顯減少(如圖3所示)。OECs的染色結果，染色可見P75呈陽性，經Ara-C處理後培養的細胞，由於成纖維細胞大部分被去除，P75陽性率即細胞純度可達90%以上(如圖4所示)。OECs位於嗅球表面兩層即嗅神經層和小球層，每層結構間的差別有限，即便在解剖顯微鏡下也很難將這兩層結構完整剝下，所以本發明採用胰酶消化的方法收集OECsJfi同時也增加其他細胞汙染的可能。成纖維細胞是OECs培養體系中最棘手的汙染細胞，其分裂增殖和貼壁速度極快，遠遠超出OECs。本發明根據成纖維細胞與OECs有絲分裂的時象差，利用Ara-C處理48h，能有效祛除大部分成纖維細胞，以減少其下一步的非特異貼壁。p75是神經營養因子低親和力受體，也是OECs特異性的標記物，在OECs膜表面由跨膜、細胞外和胞質等三部分組成，其抗體能和細胞外部分發生特異性結合。因此，包被在培養皿上的p75抗體可將OECs吸附在培養皿表面。實驗過程中，由於採用了胰酶消化以及反覆的洗滌，對細胞的損傷很大，用P75抗體包被培養皿可使儘可能多的OECs貼壁，然後通過培養液的作用使其快速生長增殖。i^orsko Iin是一種腺苷酸環化酶的激活劑，活化的腺苷酸環化酶使ATP轉變成cAMP。cAMP激活蛋白激酶A，後者使磷脂酶C上的絲氨酸殘基磷酸化，從而引起靶細胞的生物學反應、如細胞分泌、細胞通透性變化、細胞分裂、線粒體氧化磷酸化以及各種酶促反應。BP E可促進OECs的存活、增殖與生長，與i^orskolin的共同作用，可阻止經過酶剝蝕、不利條件刺激(如細胞清洗，吹打作用)後的細胞活性下降。其次，本實驗以DMSO溶解i^orskolin，使培養液中含有一定量的DMS0。適量的DMSO有保護軸突及髓鞘、減少水腫、促進神經周圍血液流速、穩定細胞溶酶體膜和清除自由基之功效。在細胞消化、反覆吹洗過程中，細胞難免遭受機械和化學損傷。在這種對氧敏感的細胞培養體系中，可能產生自由基和溶酶體崩解，DMSO的介入進一步減小了細胞的損傷。本發明的實驗中，OECs經培養2 14天後仍保持雪旺細胞的雙極和三極形態，細胞排布由雜亂無章，走向排列一致。這種現象可保持很長時間，與Forskolin激活OECs影響細胞形態的信號轉導系統有關。OECs在培養3 4天時呈巨噬細胞、條梭或形態不規則狀，5天以後大致與雪旺細胞形態接近，呈條梭狀，這可能是OECs再現外周雪旺細胞形態特性。本發明並不局限於所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開範圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護範圍以權利要求書限定的範圍為準。
權利要求
1. 一種分離及培養人胚嗅鞘細胞的方法，其包括下述步驟51取2-3月齡流產胎兒，解剖顯微鏡下分離出兩側嗅球，移入含D-Hank』 s液的培養皿；52在解剖顯微鏡下去除毛細血管網，將嗅球最外層的嗅神經層、小球層連同包被的軟膜一起剝下；53用D-Hank』 s液洗2次，用虹膜剪剪碎後用0. 25%胰酶37°C消化30min，加入含血清培養液終止消化；54使用200目濾網過濾去除大塊組織，過濾液600g離心5min ；以及55棄上清，用含i^orskolin和BPE的全培養液重懸，調整細胞濃度為lX105/ml，接種於P75包被的培養皿；每2天換液1次。
全文摘要
本發明提出一種分離和培養人胚嗅鞘細胞的方法，所述方法包括如下步驟OECs的分離培養；培養皿的包被；OECs的純化；以及OECs的染色鑑定。本發明的分離及培養人胚嗅鞘細胞的方法，OECs經培養2～14天後仍保持雪旺細胞的雙極和三極形態，細胞排布由雜亂無章，走向排列一致；採用適量的DMSO有保護軸突及髓鞘、減少水腫、促進神經周圍血液流速、穩定細胞溶酶體膜和清除自由基之功效。
文檔編號C12N5/073GK102559595SQ20111044774
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者吳衛江 申請人:吳衛江