具有導向殺滅腫瘤細胞的重組融合蛋白的製作方法
2023-05-31 01:52:46 3
專利名稱：具有導向殺滅腫瘤細胞的重組融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物基因工程中的導向融合蛋白領域，目前癌症仍然是死亡率位居第二的疾病，目前人們還沒有特別有效的手段來進行治療，化療仍然是目前最常用的治療方法，雖然有一定的療效，但是其副作用大，治療效果只有部分理想，治療時容易產生耐藥株癌細胞等缺點影響了這種方法的療效和有效率。導向治療是一種有望代替化療的新的治療手段，本發明通過選用人促黃體激素釋放因子及其衍生物作為導向，選用PE40(假單胞桿菌外毒素A的去掉I結構域的部分)的衍生物作為毒素部分，得到了與GnRH-PE40分子相比，活性大大提高的一系列基因工程融合蛋白，在腫瘤治療方面有潛在的應用價值。
二.
背景技術：
導向治療是指藥品分子可以導向地到達癌細胞並發揮作用，而對正常的細胞毒性很低，所以達到導向治療的效果。目前免疫毒素或導向毒素是達到導向治療的一個重要的發展方向，是通過特異性抗體或細胞因子等與毒素連接，前者作為導向部分，即配體，可以引導分子到達腫瘤部位並與腫瘤細胞表面的過量表達的該種受體結合，後者作為毒素部分，即殺滅腫瘤細胞的部分。目前世界上已有該類藥品上市，即Ontak，1999年在美國上市，適應症是難治性皮膚T細胞淋巴瘤，其導向部分是白細胞介素2，而毒素部分是白喉毒素(www.fda.gov)。
對於導向部分和毒素部分的選擇是建立導向藥物的一個重要部分，首先，導向部分可以選擇激素類，比如人促黃體生成激素釋放因子(GnRH)，細胞生長因子，比如EGF，TGF等，細胞因子，如白細胞介素-2，白細胞介素-13，白細胞介素-6等，單克隆抗體類等其他。導向部分的選擇十分重要，因為如果導向部分與正常細胞有過多的結合，那麼毒素部分就會殺死正常的細胞，人促黃體生成激素釋放因子是一個較好的導向部分，因為其主要存在於人的垂體中，由於融合蛋白是一個分子量很大的蛋白，所以不會通過血腦屏障，就不會進入垂體產生毒副作用。毒素部分目前使用的有假單胞菌外毒素A(PE)，白喉毒素(DT)，蓖麻毒素等，假單胞菌外毒素A(PE)是一類比較常用的毒素，它是由假單胞桿菌分泌的613個胺基酸組成的，有3個結構域，I區結構域為細胞受體結合區，II區為跨膜區，介導毒素分子跨膜進入細胞，III區為活性區，通過核糖基化細胞中的延伸因子EF2，終止蛋白合成，殺死細胞(Allured.V etc.Proc Natl Acad Sci.1986，83，1320-1324)。PE40是PE的截短形式，刪除了PE分子的I區，即N術端1-252個胺基酸，消除了PE分子的非特異與細胞的結合特性。已經有人使用GnRH-PE66和GnRH-PE40作為導向毒素，來使裸鼠的接種腫瘤消減，但是作為將來的一種治療劑，這兩個分子具有生物活性低，使用劑量大的缺點，比如GnRH-PE66每隻裸鼠的每次劑量是12.5ug，相當於大約600ug/kg劑量，是臨床試驗所不能承受的(http//www.md.huji.ac.il/depts/humangenetics/lorberbaum/lorberbaum_research.html；Med Oncol.1999Apr；16(1)38-45.)。本發明通過對GnRH-PE40的多點突變和改造，使其生物活性有了顯著的升高，從而使之有可能成為治療癌症的導向藥物。
三.
發明內容
本發明通過對GnRH-PE40的改造，使之生物活性有了顯著的提高。首先，在PE分子的改造方面，通過去掉原PE分子的1-252，365-380兩段胺基酸序列，剩下的253-364和381-613兩段胺基酸序列按原順序相連，成為PE38；去掉PE分子的1-279位胺基酸，剩下280-613部分，並將287位Cys突變為Ser或Ala或Gly，為PE37；去掉1-279和365-380兩段胺基酸序列，剩下的280-364，381-613兩段胺基酸序列按原順序相連，並將287位的Cys突變為Ser或Ala或Gly，成為PE35；PE38，PE37，PE35的分子的活性在不同程度上比PE40都有了提高。並且通過將PE40，PE38，PE37，PE35 C末端的5個胺基酸Arg-Glu-Asp-Leu-Lys替換為Lys-Asp-Glu-Leu，為內質網的滯留序列，可以增強分子與內質網的結合，使活性提高。而在導向部分方面，我們使用的是第一位胺基酸是Glu的GnRH，當將GnRH的第6位突變為Ala，Trp，或者Leu時，增強了其與GnRH的受體的結合。
作為本發明中的GnRH-PE及其衍生物，是一類自然界沒有的人工蛋白，其特徵為人促黃體激素釋放激素GnRH或其突變體以及PE40或其突變體組成的融合蛋白，可以使用一種具有序列表中融合蛋白1，2，3，4，5的序列，也可以使用對序列表中融合蛋白1，2，3，4，5的胺基酸序列加以修飾，如插入，缺失，突變某個或某些胺基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。換句話說，也可以使用採用其胺基酸序列大體上與序列表中融合蛋白1，2，3，4，5胺基酸序列相同的蛋白。
獲得本發明中融合蛋白的方法本領域中的技術人員都可以通過常規的分子克隆的方法實現，通過多片段全基因合成並結合PCR的方法可以合成目的蛋白的基因序列，然後通過酶切連接等手段將基因連接入表達載體，然後轉化入相應的宿主，進行表達，發酵。發酵後通過離心收集菌體，機械法或滲透壓等方法破碎細胞，通過一系列常用的層析方法，如離子交換，凝膠過濾和疏水層析等，純化最終得到目的蛋白。目的蛋白生物活性的測定用MTT法，首先對細胞進行消化和收集，將細胞用RPMI 1640培養液稀釋成6-8×104個/毫升的細胞懸液，接種於96孔板，100ul/孔，37度培養4小時。對照加入100ul培養液。樣品先用RPMI 1640培養液稀釋成100ul/mL，作為起始孔，然後按每孔與上孔2.5倍的關係稀釋樣品，各加入稀釋的樣品每孔100ul，37度，培養24小時，取出，用MTT法染色，用酶標儀570nm進行測定並計算IC50值。
四.
具體實施例方式下面的實例目的在於進一步闡述本發明，而不會構成對本發明專利待批權利要求的限制。
一.
具體實施例方式
實例一.
根據融合蛋白1的蛋白序列，根據不同表達系統的宿主的偏愛密碼子的原則，設計出融合蛋白1的原核表達基因序列和真核表達基因序列，通過全基因合成的方法結合PCR的方法合成出基因序列，經過測序驗證後，將目的基因連接入表達載體，原核主要應用改進後的pET質粒，真核系統主要採用pIC9K質粒系列，將驗證後的重組質粒轉導入到宿主菌中，經過表達、發酵得到目的菌體，然後通過機械方法或滲透壓法破菌後，離心取上清，通過疏水層析和離子交換層析的方法純化得到融合蛋白1。通過電泳，HPLC，質譜，N末端胺基酸序列測定等方法確定得到的是目標蛋白。最後進行細胞活性試驗。
實例二.
根據融合蛋白3的蛋白序列，根據不同表達系統的宿主的偏愛密碼子的原則，設計出融合蛋白1的原核表達基因序列和真核表達基因序列，通過全基因合成的方法結合PCR的方法合成出基因序列。經過測序驗證後，將目的基因連接入表達載體，原核主要應用改進後的pET質粒，真核系統主要採用pIC9K質粒系列，將驗證後的重組質粒轉導入到宿主菌中，經過表達、發酵得到目的菌體，然後通過機械方法或滲透壓法破菌後，離心取上清，通過疏水層析和離子交換層析的方法純化得到融合蛋白3。通過電泳，HPLC，質譜，N末端胺基酸序列測定等方法確定得到的是目標蛋白。最後進行細胞活性試驗。
實例三.
在融合蛋白1的基因序列的基礎上，應用PCR突變的方法將其C末端的4個胺基酸Lys-Asp-Glu-Leu去掉，換上Arg-Glu-Asp-Leu-Lys，通過與實例1類似的方法得到了融合蛋白GnRH-PE40，此為對照品。通過電泳，HPLC，質譜，N末端胺基酸序列測定等方法確定得到的是目標蛋白。最後進行細胞活性試驗。
實例四.
在融合蛋白1的基因序列的基礎上，應用PCR突變的方法將其改造為融合蛋白2的基因序列，通過與實例1類似的方法得到了融合蛋白2。通過電泳，HPLC，質譜，N末端胺基酸序列測定等方法確定得到的是目標蛋白。最後進行細胞活性試驗。
實例五.
在融合蛋白3的基因序列的基礎上，應用PCR突變的方法將其改造為融合蛋白4的基因序列，通過與實例1類似的方法得到了融合蛋白4。通過電泳，HPLC，質譜，N末端胺基酸序列測定等方法確定得到的是目標蛋白。最後進行細胞活性試驗。
實例六.
在融合蛋白3的基因序列的基礎上，應用PCR突變的方法將其改造為融合蛋白5的基因序列，通過與實例1類似的方法得到了融合蛋白5。進行細胞活性試驗。
實例六.
在融合蛋白2的基因序列的基礎上，應用PCR突變的方法將其第7位Gly改成Ala，通過與實例1類似的方法得到了Ala7-融合蛋白2。通過電泳，HPLC，質譜，N末端胺基酸序列測定等方法確定得到的是目標蛋白。最後進行細胞活性試驗。
實例七.
在融合蛋白4的基因序列的基礎上，應用PCR突變的方法將其327位Gly改換為Ala，通過與實例1類似的方法得到了Ala327-融合蛋白4。通過電泳，HPLC，質譜，N末端胺基酸序列測定等方法確定得到的是目標蛋白。最後進行細胞活性試驗。
表1.活性測定的結果
從上表中可以看出，GnRH-PE40的各種衍生物與GnRH-PE40相比，對不同腫瘤細胞的殺傷生物活性有了不同程度的提高。
序列表110北京諾思蘭德生物技術有限公司120具有導向殺滅腫瘤細胞的重組融合蛋白140
141
16052101211376212PRT213融和蛋白14001Met Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly His Met Ala Glu1 5 10 15Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His20 25 30Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp35 40 45Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala50 55 60Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val65 70 75Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly80 85 90Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr95 100 105Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly110 115 120Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr125 130 135Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly140 145 150
Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu155 160 165Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn170 175 180Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu185 190 195Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala200 205 210Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp215 220 225Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala230 235 240Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly245 250 255Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser260 265 270Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro275 280 285Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro290 295 300Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg305 310 315Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val320 325 330Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp335 340 345Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala350 355 360Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu365 370 375Leu376
2l02211361212PRT213融合蛋白24002Met Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly His Met Ala Glu1 5 10 15Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His20 25 30Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp35 40 45Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala50 55 60Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val65 70 75Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly80 85 90Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr95 100 105Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly110 115 120Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp125 130 135Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly140 145 150Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp155 160 165Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg170 175 180Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala185 190 195
Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu200 205 210Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu215 220 225Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg230 235 240Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser245 250 255Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu260 265 270Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu275 280 285Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu290 295 300Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile305 310 315Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu320 325 330Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu335 340 345Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu350 355 360Lys3612103211376212PRT213融合蛋白34003Met Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His1 5 10 15
Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp20 25 30Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala35 40 45Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val50 55 60Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly65 70 75Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr80 85 90Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly95 100 105Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr110 115 120Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly125 130 135Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu140 145 150Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn155 160 165Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu170 175 180Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala185 190 195Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp200 205 210Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala215 220 225Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly230 235 240Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser245 250 255
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro260 265 270Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pr0275 280 285Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg290 295 300Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val305 310 315Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp320 325 330Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala335 340 345Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Glu His Trp Ser350 355 360Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu365 370 375Lys3762104211349212PRT213融合蛋白44004Met Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Pro Val Gln Arg1 5 10 15Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val20 25 30Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly35 40 45Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu50 55 60
Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln65 70 75Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val80 85 90Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala95 100 105Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala110 115 120Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly125 130 135Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln140 145 150Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe155 160 165Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg170 175 180Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly185 190 195Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp200 205 210Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val215 220 225Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu230 235 240Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His245 250 255Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu260 265 270Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg275 280 285Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val290 295 300
Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala305 310 315Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Glu320 325 330His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Pro Gly Lys Pro Pro Arg335 340 345Glu Asp Leu Lys3492105211333212PRT213融合蛋白54005Met Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Pro Val Gln Arg1 5 10 15Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val20 25 30Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly35 40 45Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu50 55 60Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln65 70 75Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Pro Ala Asp80 85 90Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu95 100 105Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr110 115 120Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu125 130 135
Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu140 145 150Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser155 160 165Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp170 175 180Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala185 190 195Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro200 205 210Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala215 220 225Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro230 235 240Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly245 250 255Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr260 265 270Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly275 280 285Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile290 295 300Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Glu His305 310 315Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu320 325 330Asp Leu Lys33權利要求
1.一組由人促黃體激素釋放因子(GnRH)或其突變體與假單胞桿菌外毒素A(PE)或其突變體組成的系列融合蛋白。
2.根據權利要求1，所說的融合蛋白1的胺基酸序列為Met-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu。
3.根據權利要求1，所說的融合蛋白2的胺基酸序列為Met-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys。
4根據權利要求1，所說的融合蛋白3序列為Met-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys。
5根據權利要求1，所說的融合蛋白4序列為Met-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Ser-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-ValArg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys。
6根據權利要求1，所說的融合蛋白5序列為Met-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Ser-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys。
7根據權利要求2，融合蛋白1的第7位Gly可以替換為Ala，Trp或Leu。
8根據權利要求3，融合蛋白2的第7位Gly可以替換為Ala，Trp或Leu；同時可以去掉C末端的Arg-Glu-Asp-Leu-Lys，替換為Lys-Asp-Glu-Leu。
9.根據權利要求4，融合蛋白3的第367位Gly可以替換為Ala，Trp或Leu；同時可以去掉C末端的Arg-Glu-Asp-Leu-Lys，替換為Lys-Asp-Glu-Leu。
10.根據權利要求5，融合蛋白4的第341位Gly可以替換為Ala，Trp或Leu；同時可以去掉C末端的Arg-Glu-Asp-Leu-Lys，替換為Lys-Asp-Glu-Leu。
11.根據權利要求5，融合蛋白5的第311位Gly可以替換為Ala，Trp或Leu；同時可以去掉C末端的Arg-Glu-Asp-Leu-Lys，替換為Lys-Asp-Glu-Leu。
全文摘要
一組由人促黃體激素釋放因子(GnRH)或其突變體以及假單胞桿菌外毒素A(PE)或其突變體組成的系列融合蛋白，作為藥用，可以導向地到達腫瘤細胞，高效地殺死腫瘤細胞。
文檔編號C07K19/00GK1840546SQ20051005990
公開日2006年10月4日 申請日期2005年4月1日 優先權日2005年4月1日
發明者金美玉, 馬素永, 聶李亞, 文美玉 申請人:北京諾思蘭德生物技術有限責任公司