Boc和Fmoc固相肽合成的製作方法

2023-05-31 08:20:31

專利名稱：Boc和Fmoc固相肽合成的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種製備包含三個或更多個胺基酸殘基的肽的方法， 所述肽具有N-端胺基酸、鄰近該N-端胺基酸的倒數第二個胺基酸和 C-端胺基酸。
背景技術：
為了克服與溶液肽合成有關的許多中間體提純問題，於1963年引 入固相肽合成。Stewart等人，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)(百克化學公司(Pierce Chemical Co.),第2版，1984)。在固相
合成期間，胺基酸被組裝(即，偶聯)成任何想得到的序列的肽，而鏈的 一端(即，C-端)被錨定到不能溶解的載體上。 一旦在載體上將想得到的 序列連接到一起，那麼肽就被從載體中解封閉(deblock)(即，裂開 (cleave))。偶聯胺基酸的a-氨基官能團的這兩個標準保護基團為通過利 用強酸處理而除去的Boc，以及利用鹼除去的Fmoc。本發明涉及一種 利用這些a-氨基保護基團兩者的組合，以單一合成，在便宜的氯甲基 化的聚苯乙烯樹脂上製備肽的便利方法。
在通過利用任一種上面提及的a-氨基保護方案的固相方法合成肽 的設計中，重要的是在整個鏈組裝期間保護構成胺基酸的任何反應性 "側基"不發生不希望的化學反應。還希望選擇來保護各種側基的化 學基團可耐受被用來除去a-氨基保護基團的試劑除去。第三，重要的 是在鏈組裝期間生長中的肽鏈與樹脂顆粒的連接對於用來除去任一類 型a-氨基保護基團的試劑穩定。在Fmoca-氨基保護方案的情況下，側 基保護官能團應當可耐受用來除去Fmoc的鹼性試劑。實際上，在肽鏈 組裝之後，這些側鏈保護基團一般由溫和酸性試劑除去。當利用Boca-氨基保護方案時，側鏈保護基團必須在每一個循環中都可耐受被用來脫保護Boc基團的溫和酸試劑除去。實際上，在肽鏈組裝之後，Boca-氨基保護方案的這些側鏈保護基團一般由無水HF除去。因此，實際上， 就Fmoc a-氨基保護而言常用的側鏈保護基團在用於Boc a-氨基脫保護 的條件下不穩定，並且這兩個類型的a-氨基保護方案未在通過固相肽 合成的肽鏈的組裝中混合。另外，儘管就Boc保護的胺基酸而言廣泛 地使用了用於肽合成的最不昂貴的聚合樹脂，氯甲基化的苯乙烯或 "Merrifield樹脂"，但是文獻暗示就在a-氨基上的Fmoc保護而言由 於其在鹼性條件下的不穩定性而不適於使用。(參見Stewart等人，固相 肽合成(百克化學公司，第2版，1984)。本發明涉及在某些肽的固相合 成期間在"Merrifield樹脂"上混合使用Boc和Fmoc胺基酸兩者的方 法。
Lanreotide②(蘭瑞肽)為生長抑素的類似物並且已知抑制生長激素 釋放以及抑制胰島素、胰高血糖素和胰腺外分泌。
美國專利號4853371公開並要求保護Lanreotide⑧、其製備方法及 抑制生長激素、胰島素、胰高血糖素的分泌和胰腺外分泌的方法。
美國專利號5147856公開了 Lanreotide⑧治療再狹窄的用途。 美國專利號5411943公開了 Lanreotide⑧用於治療肝細胞瘤的用途。
美國專利號5073541公開了 Lanreotide⑧用於治療肺癌的用途。
於1993年7月9日提交的美國申請號08/089410公開了 Lanreotide 用於治療黑色素瘤的用途。
美國專利號5504069公開了 Lanreotide⑧用於抑制實體瘤加速生長
的用途。於1997年5月13日提交的美國申請號08/854941公開了 Lanreotide⑧用於降低體重的用途。
於1997年5月13日提交的美國申請號08/854943公開了 Lanreotide⑧用於治療胰島素抵抗和症候群X的用途。
美國專利號5688418公開了 Lanreotide⑧用於延長胰腺細胞生存的 用途。
PCT申請號PCT/US97/14154公開了 Lanreotide⑧用於治療纖維化 的用途。
於1997年5月13日提交的美國申請號08/855311公開了 Lanreotide 用於治療高脂血症的用途。
於1995年5月12日提交的美國申請號08/440061公開了 Lanreotide 用於治療血澱粉酶過多(hyperamylinemia)的用途。
於1997年5月7日提交的美國申請號08/852221公開了 Lanreotide⑧用於治療高催乳素血症和催乳素瘤的用途。
前面的專利和專利申請的內容併入本文中作為參考。

發明內容
本發明特徵在於一種用於製備包含三個或更多個胺基酸殘基的肽 的方法，該肽具有N-端胺基酸、鄰近該N-端胺基酸的倒數第二個氨基 酸和C-端胺基酸，其中所述方法包括如下步驟
(a)通過酯鍵把第一胺基酸連到固體載體樹脂上以形成第一級偶 聯產物，其包括(i)使碳酸銫的水溶液與第一胺基酸的醇溶液反應，以形成第一胺基酸的銫鹽，(ii)獲得第一胺基酸的無溶劑銫鹽，(iii)在幹 的極性非質子溶劑中使固體載體樹脂與第一胺基酸的銫鹽反應，以形 成第一級偶聯產物；
其中第一胺基酸與肽的C-端胺基酸對應，第一胺基酸的非側鏈氨 基被Boc封閉並且第一胺基酸沒有需要保護的側鏈官能團，以及固體 載體樹脂為氯甲基化的聚苯乙烯樹脂；
(b) 利用酸從第一級偶聯產物中解封閉Boc，以形成第一級解封閉 的偶聯產物；
(c) 任選地把下一個胺基酸偶聯到第一級解封閉的偶聯產物上，其 包括在包含肽偶聯試劑的有機溶劑中使下一個胺基酸與第一級解封閉 的偶聯產物反應，以形成下一級封閉的偶聯產物，其中下一個胺基酸 具有被Boc封閉的非側鏈氨基，並且如果下一個胺基酸具有一個或更 多個側鏈官能團，那麼側鏈官能團不需要保護，或者側鏈官能團具有 對於分別用來解封閉Boc和Fmoc的酸試劑和鹼試劑穩定的保護基團；
(d) 從下一級封閉的偶聯產物中解封閉Boc，其包括使下一級封閉 的偶聯產物與酸反應，以得到下一級解封閉的偶聯產物；
(e) 任選地重複步驟(c)和(d)，每個循環形成(X+1)級的下一級解封 閉的偶聯產物，其中X為所需的循環重複次數；
(f) 把下一個胺基酸偶聯到得自(b)的第一級解封閉的偶聯產物上， 或者任選地偶聯到得自(e)的(X+l)級的下一級解封閉的偶聯產物上，其 包括在包含肽偶聯試劑的有機溶劑中使下一個胺基酸與所述第一級解 封閉的偶聯產物或所述(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物反應，以形 成下一級封閉的偶聯產物，其中下一個胺基酸具有被Fmoc封閉的非側 鏈氨基，條件是如果下一個胺基酸具有一個或更多個側鏈官能團，那 麼側鏈官能團不需要保護，或者側鏈官能團具有對於用來解封閉Fmoc 的鹼試劑穩定的保護基團；
(g) 從下一級封閉的偶聯產物中解封閉Fmoc，其包括使下一級封 閉的偶聯產物與伯胺或仲胺反應，以得到下一級解封閉的偶聯產物；
(h) 任選地重複步驟(f)和(g)，每個循環形成(X+1)級的下一級解封 閉的偶聯產物，其中X為所需的循環重複次數，直到肽的倒數第二個胺基酸被偶聯和解封閉；
(i)把N-端胺基酸偶聯到(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物上， 其包括在包含肽偶聯試劑的有機溶劑中使N-端胺基酸與(X+1)級的下 一級解封閉的偶聯產物反應，以形成完成的封閉的偶聯產物，其中N-端胺基酸具有被Boc或Fmoc封閉的非側鏈氨基；
(j)從完成的封閉的偶聯產物中解封閉Boc或Fmoc基團，其包括 在Boc的情況下使完成的封閉的偶聯產物與酸反應，或者在Fmoc的情 況下與鹼反應，以形成完成的肽-樹脂產物；
(k)如果側鏈官能團存在於完成的肽-樹脂產物上，那麼任選地脫 保護(deprotecting)完成的肽-樹脂產物的側鏈官能團，其包括使完成的 肽-樹脂產物與適當的脫保護試劑反應，以形成脫保護的完成的肽-樹脂 產物；及
(1)使肽與完成的肽-樹脂產物或脫保護的完成的肽-樹脂產物的固 體載體樹脂斷裂，以得到肽，其包括使完成的肽-樹脂產物或脫保護的 完成的肽-樹脂產物與氨、伯胺或仲胺反應，直到肽與樹脂的斷裂基本 上完成；
條件是在肽的合成中，步驟(f)和(g)必須進行至少一次。
本發明的優選方法是其中步驟(l)的氨、伯胺或仲胺在包含醇並且 任選包含非質子極性溶劑的溶劑中。
本發明的優選方法是其中步驟(l)進一步包括下列步驟 從溶劑中沉澱出斷裂的肽； 過濾固體載體樹脂和沉澱出來的肽；及 在酸溶液中提取肽，以離析肽。
本發明的優選方法是其中第一胺基酸為Boc-L-Thr。
本發明的優選方法是其中第一胺基酸為得到Boc-L-Thr-樹脂作為 第一級偶聯產物的Boc-L-Thr-銫鹽，並且H-L-Thr-樹脂為第一級解封閉的偶聯產物。
本發明的優選方法是其中步驟(j)中用來解封閉Boc基團的酸為
TFA。
緊接著前述方法的優選方法是其中有機溶劑為二氯甲烷、氯仿或 二甲基甲醯胺，並且肽偶聯試劑為二異丙基碳二亞胺、二環己基碳二 亞胺或N-乙基-N'-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺。
緊接著前述方法的優選方法包括在式H-L-Thr-樹脂的第一級解封 閉的偶聯產物形成之後，進行步驟(f)和(g)六次，其中按照這樣的順序 偶聯下列胺基酸Fmoc-L-Cys(Acm)、 Fmoc-L-Val、 Fmoc-L-Lys(Boc)、 Fmoc-D-Trp 、 Fmoc-L-Tyr(O-t國Bu)和 Fmoc-L-Cys(Acm)， 以形成 H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-樹脂。
緊接著前述方法的優選方法包括根據步驟(c)把Boc-D-(3-Nal偶聯 至U H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Ti"p-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-樹月旨 上，以形成 Boc國D-p-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D陽Trp-Lys(Boe)隱 Val-Cys(Acm)-Thr-樹脂。
緊接著前述方法的優選方法包括根據步驟Ci)同時解封閉 Boc-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr(0-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr -樹脂的封閉D-P-Nal的Boc基團、保護Tyr的O-t-Bu基團和保護Lys 的Boc基團，以得到式H-D-卩-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cy s( Acm)-Thr-樹脂的完成的肽-樹脂產物。
緊接著前述方法的優選方法包括通過使 H-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr誦D隱Trp-Lys隱Val-Cys(Acm)-Thr-樹脂與氨在包
含醇並且任選包含非質子極性溶劑的溶劑中反應直到斷裂基本上完 成，使肽，H-D-卩-Nal-Cys(Acm)-Tyr陽D-Trp-Lys-Val國Cys(Acm)-Thr與固體樹脂斷裂，以得至lj H-D-卩-Nal-Cys(Acm)墨Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2。
緊接著前述方法的優選方法是其中醇為甲醇並且極性非質子溶劑 為二甲基甲醯胺。
緊接著前述方法的優選方法包括通過使 H-D-p-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2與碘在醇 中的溶液反應直到脫保護和環化基本上完成，同時脫保護保護Cys的 Acm基團和環化所得至U的式H-D-J3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2的完成的肽產物的脫保護的Cys殘基，以得 到H-D-p-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2。
本發明的優選方法是其中肽為H-D-P-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2。
緊接著前述方法的優選方法是其中肽為生長抑素類似物。
用於本發明的說明書中的術語的定義如下 "第一胺基酸"包括具有其被BOC保護的非側鏈氨基的任何氨 基酸，其可商購或能夠根據對於本領域的普通技術人員來說已知的方
法合成，例如，Boc-L-Thr;
"第一級偶聯產物"描述了由第一個胺基酸向固體載體樹脂上
偶聯得到的連到固體載體樹脂上的產物，例如Boc-L-Thr-樹脂；
"第一級解封閉的偶聯產物"描述了由BOC基團從第一級偶聯產
物中除去或解封閉得到的產物，例如H-L-Thr-樹脂，其中"H"代表得自 解封閉步驟的非側鏈氨基的可利用的氫 ，
"下一個胺基酸"描述了具有其被Boc或Fmoc保護的非側鏈氨 基的任何胺基酸，其可商購或能夠根據對於本領域的普通技術人員來 說已知的方法合成。因為步驟(c)和步驟(f)能夠處於其中步驟進行超過一次的重複循環中，所以每當進行步驟(C)或步驟(f)時，下一個胺基酸
能夠獨立地選自已知的和可合成的具有其分別被Boc或Fmoc保護的非 側鏈氨基的胺基酸；
"(X+1)級的下一級封閉的偶聯產物"描述了由下一個胺基酸與下 一級解封閉的偶聯產物偶聯得到的連到固體載體樹脂上的產物。因為 步驟(C)和(d)及步驟(f)和(g)能夠處於其中另外下一個胺基酸能夠被偶 聯的重複循環中，所以術語(X+1)級的下一級封閉的偶聯產物意味著代 表得自前一個偶聯循環的各產物；
"(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物"描述了由從(X+1)級的下一 級封閉的偶聯產物中解封閉Fmoc基團得到的產物；
"完成的肽-樹脂產物"描述了在把N-端胺基酸連到肽鏈上之後且 在除去或解封閉N-端胺基酸的非側鏈氨基之後連到固體載體樹脂上的 肽產物，但其仍然具有未通過用以解封閉N-端胺基酸的非側鏈封閉基 團的反應所除去的任何側鏈官能團保護基團；及
"脫保護的完成的肽-樹脂產物"描述了連到固體載體樹脂上的肽 產物，其中除去或脫保護胺基酸的側鏈官能團的任何保護基團。
能夠用來解封閉Boc的酸的實例為三氟乙酸(TFA)、甲磺酸和包含 HC1的有機溶液。
能夠用來解封閉Fmoc的伯胺和仲胺的實例為4-(氨基甲基)哌啶、 哌啶、二乙胺、DBU和三(2-氨基乙基)胺。
能夠用於中和游離的氨基的TFA鹽(RNH3+CF3COCT,在下一級氨 基酸的偶聯之前或期間必須將這些鹽轉化成"游離的"胺(NH2)，否則偶 聯將不會起作用)的非親質子性鹼的實例為二異丙基乙胺(DIEA)和三乙 胺(TEA)。
能夠用於胺基酸偶聯反應的有機溶劑的實例為二氯甲烷、氯仿、 二氯乙垸、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、四氫呋喃、乙酸乙烯酯、l-甲基-2-吡咯垸酮、乙腈或者上面溶劑的組合。
肽偶聯試劑的實例包括取代的碳二亞胺如二異丙基碳二亞胺、二
環己基碳二亞胺和N-乙基-N'-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺。
參與肽醯胺鍵形成的羧基和氨基分別稱為"非側鏈"羧基或氨基。 另一方面，未包括在肽醯胺鍵形成中的任何胺基酸官能團稱為"側鏈" 官能團。
術語"鹼穩定的基團"是指用來保護胺基酸的官能團的保護基團，
該保護基團(l)為鹼穩定的，例如不能夠被鹼如4-氨基乙基-哌啶、哌啶、 或者三-(2-氨基乙基)胺除去，這些鹼為典型地用來除去保護基團Fmoc 的鹼，並且(2)能夠被酸如三氟乙酸，或者通過其它手段如催化氫化來 除去。
此處和所附的權利要求書中分別使用符號"Fmoc"和"Boc"來表示 9-芴基甲氧羰基和叔丁氧羰基。
上述方法能夠用來製備肽、優選生長抑素類似物，如八肽 Lanreotide ， 其具有下式 H-D-(3-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 。 當要合成H-D國p國Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2時，用來封閉側鏈官能團Cys、 Lys和Tyr的鹼穩定的保護基 團能夠分別為乙醯氨甲基(Acm)、 Boc和叔丁基。對於Cys來說，Acm 是優選的。
"生長抑素"類似物所表示的為展示出與生長抑素相似(即，激動劑 (agonist))或相對(即，拮抗劑(antagonist))的生物活性的肽。
在式H-D-p-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2中，常規的
三字母胺基酸符號(例如，Lys)的各自代表胺基酸的結構殘基。例如，上式中的符號Lys代表-NH-CH((CH2)4NH2)-CO-。符號D-p-Nal代表氨 基酸殘基D-2-萘丙氨基。括號代表連接肽的兩個Cys殘基的游離硫醇 的二硫鍵，表示括號內的肽的胺基酸為環狀。
基於此處的描述，本領域的技術人員能夠將本發明用至最充分的 程度。
除非另外限定，本文中所採用的所有技術和科技術語均具有與本 發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。此外，本文中 提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻都併入作為參考。
根據本發明的方法，按照下列步驟，能夠製備肽。
將0.5摩爾當量的碳酸銫在水中的溶液緩慢添加到1摩爾當量的 Boc-AA^Bachem California, Torrance, CA)溶於醇、優選甲醇中的溶 液中，其中AA'與C-端胺基酸對應。在室溫下將所得到的混合物攪拌 約1小時，然後在降低的壓力下除去所有醇和水，得到Boc-AA'的銫 鹽乾粉末。用氯化的溶劑、優選二氯甲垸(DCM)，醇、優選甲醇，及極 性非質子溶劑、優選二甲基甲醯胺(DMF)漂洗Merrifidd樹脂，1.0當 量(氯甲基化的聚苯乙烯；200~400目，引入為1.3毫當量m叫/克， Advanced ChemTech， Louisville, Kentucky or Polymer Laboratories, Church Stretton， England)。將Boc-AA1銫鹽粉末溶於幹的極性非質子 溶劑、優選DMF中，並且將溶液與上面洗滌過的樹脂結合。在惰性氣 氛如氮氣中，在約45X: 65T:、優選5(TC 6(TC下，使漿料小心地混合 約48 106小時、優選85 90小時。將樹脂過濾，並用極性非質子溶劑 優選DMF、水及最後是醇如MeOH對其充分漂洗。在降低的壓力下， 乾燥Boc-AA、樹脂。
將Boc-AA、樹脂添加到具有粗糙燒結的玻璃過濾底板的玻璃反應 器中。樹脂用氯化的溶劑如DCM漂洗，用有機酸、優選25。/。TFA/DCM解封閉，用氯化的溶劑如DCM和醇如MeOH簡單漂洗，用有機鹼、 優選三乙胺在DCM中進行中和，以及再次用DCM和極性非質子溶劑 如DMF漂洗，以得到解封閉的AA^樹脂。
然後，將解封閉的AAL樹脂任選地與任何所需數量的胺基酸偶聯。 如果隨後的胺基酸在a-氨基上被Fmoc保護(Fmoc-AAX)，那麼側鏈基 團必須或者不需要保護(如Fmoc-Gly、 Fmoc-Ala、 Fmoc-Phe或Fmoc-蘇氨酸)，或者側鏈必須由耐鹼除去的基團保護。利用在DCM/DMF混 合物中的肽偶聯試劑(如二異丙基碳二亞胺(DIC))，將摩爾過量的 Fmoc-AAX(其中x為肽中胺基酸的序號，從C-端計數)與解封閉的AA1-樹脂偶聯約60分鐘。偶聯的樹脂用DMF、醇和DCM漂洗，以得到 Fmoc-AAX-AAL樹脂。能夠通過Kaiser茚三酮方法檢査偶聯。 Fmoc-AAX-AA^樹脂然後用DMF漂洗一次，接著用鹼在有機溶劑中(如 哌啶在DMF中)的溶液解封閉，以得到AAX-AA、樹脂。AAX-AA、樹脂 然後用DMF漂洗，接著用醇(如MeOH)和DCM兩者漂洗幾次。 AAX-AA!-樹脂用DMF漂洗一次約3分鐘，用異丙醇(IPA)漂洗三次優 選每次約2分鐘，以及用DCM漂洗三次優選每次約2分鐘。然後使樹 脂準備好與如上所述的Fmoc保護的胺基酸或如下所述的Boc胺基酸進 一步偶聯。
同樣地，如果，選定了在a-氨基(Boc-AAX)上有Boc保護的待偶聯 到脫保護的AA^樹脂上的任何隨後的胺基酸，那麼側鏈基團也必須或 者不需要保護(如Boc-Gly、 Boc-Ala、 Boc-Phe或Boc-蘇氨酸)，或者側 鏈必須由耐被酸和鹼兩者除去的基團如Boc-Cys(S-Acm)保護。如果選 擇，那麼Boc-AAX利用與上文所述的Fmoc胺基酸相同的試劑和溶劑 進行偶聯並且能夠通過Kaiser茚三酮方法檢查偶聯的完成。 Boc-AAX-AA^樹脂然後用酸在有機溶劑中如TFA在DCM中的溶液解 封閉，以得到CF3CCT H+AAX-AA^樹脂。該樹脂然後用氯化的溶劑如 DCM和醇如MeOH漂洗幾次，並用在DCM中的非親質子性鹼如三乙 胺中和，接著用氯化的溶劑如DCM再漂洗幾次，以得到AAX-AA^樹脂。然後使樹脂準備好與如上所述的Boc或Fmoc保護的胺基酸進一步 偶聯。
依據想得到的肽序列和所使用的a-氨基封閉的胺基酸類型，不管 Fmoc保護或Boc保護，執行前述偶聯步驟的適當組合直到在序列中需 要側鏈具有保護基團的胺基酸，該保護基團能夠或者被用來解封閉在 a-氨基上的Fmoc的鹼或者被用來解封閉在a-氨基上的Boc的酸除去。 這種受保護的胺基酸可以為N-a-Boc-N'-s-Fmoc-賴氨酸或 N-a-Fmoc-N'-s-Boc-賴氨酸。 一旦這種情況出現，選取的所有隨後的氨 基酸的a-氨基封閉基團必須與直到N-端胺基酸的那個位置所選取的側 基保護適合。即，側鏈保護基團必須對於用來解封閉隨後的a-氨基封 閉基團的解封閉試劑穩定。對於N-端胺基酸來說，或者Boc或者Fmoc 能夠用作a-氨基封閉基團，因為N-端胺基酸的解封閉能夠同時脫保護 某些受保護的側鏈，而對於肽的合成策略沒有不利影響，因為將不會 添加其它胺基酸。
然後，必須將仍然連在樹脂上的完成的肽鏈脫保護和解封閉。為 了除去N-端胺基酸的任何鹼穩定的保護基團和a-氨基封閉基團，如果 適用的話，用在有機溶劑中的酸如TFA在DCM中處理肽-樹脂。為了 除去N-端胺基酸的任何酸穩定的保護基團和a-氨基封閉基團，如果適 用的話，肽-樹脂用有機鹼如哌啶在DMF中處理。或者能夠將酸穩定 的基團留住，以在隨後肽的斷裂中被氨或胺鹼除去。脫保護的肽-樹脂 然後用氯化的溶劑如DCM和醇如MeOH漂洗，並且在降低的壓力下 乾燥至恆定重量。
使肽與樹脂斷裂，並且通過在3:1 MeOH/DMF中懸浮肽-樹脂而將 C-端轉化成醯胺。在氮氣中，把懸浮液冷卻至約^(TC，並將無水氨氣 添加到溶劑表面下方直到溶液飽和，同時把溫度保持在低於約10°C。 使漿料小心地混合約24小時，同時使溫度升至約2(TC。在取決於肽的 適當的條件下，通過用HPLC監視甲基酯中間體的消失，來檢查反應，並且根據需要添加更多無水氨，直到在HPLC上 甲基酯的面積低於所需產物峰的面積的10%。把漿料冷卻至約低於10 °C，並且繼續混合過夜，以使肽沉澱出來。將沉澱物和樹脂過濾並用
冷MeOH漂洗。在降低的壓力下乾燥沉澱物和樹脂，並且用乙酸水溶 液從樹脂中提取產物。
如果肽在其序列內包含受保護的Cys殘基，則Cys的硫醇基團能 夠根據下列步驟脫保護和環化。在氮氣氛中，將具有Acm-保護的Cys 基團的肽溶於乙酸水溶液中。快速攪拌溶液，並且以一個部分添加碘 在醇中的溶液。攪拌混合物並通過HPLC檢測脫保護的完成，接著通 過用2%硫代硫酸鈉溶液滴定至無色終點而結束。將粗混合物在C8填 料上用0.1乙酸銨/乙腈梯度緩衝液通過製備色譜提純，在C8填料上 用0.25N乙酸/乙腈梯度脫鹽，以及凍幹，而得到所需的肽。
具體實施例方式
提供下列實施例來舉例說明本發明的方法並且不應當將其解釋為 限制本發明的範圍。
實施例1
H2-D-(3-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2 A) Boc-L-Thr-樹脂
將2.58克碳酸銫在2.5 ml水中的溶液緩慢添加到溶於7 ml甲醇的 3.48克Boc-L-蘇氨酸(Bachem California, Torrance, CA)的、溶液中。在 室溫下攪拌所得到的混合物約1小時，然後在降低的壓力下除去所有 甲醇和水，得到Boc-L-蘇氨酸的銫鹽乾粉末。用二氯甲垸(DCM)、甲 醇(MeOH)和二甲基甲醯胺(DMF)(均為2X70 ml)漂洗10克Merrifield 樹脂(氯甲基化聚苯乙烯；200~400目，氯化物引入為1.3毫當量/克， Advanced ChemTech， Louisville, Kentucky)。將Boc-L-蘇氨酸銫鹽粉 末溶於60ml幹DMF中，並且將溶液與上面洗滌過的樹脂結合。在氮 氣氛中，在約5(TC 6(TC下，使漿料輕輕地混合約85 90小時。將樹脂過濾並用DMF、去離子水以及最後是MeOH充分漂洗。在降低的壓力 下，在約4(TC下，乾燥Boc-蘇氨酸樹月旨(蘇氨酸引入,.85士0.15毫當量
/克幹樹脂)。
B) H-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-樹脂 將得自步驟A的2.0克Boc-蘇氨酸樹脂添加到具有粗糙燒結的玻 璃過濾底板的50 ml玻璃反應器中(批次規模=1.74毫摩爾)。樹脂用 DCM(20 ml)漂洗兩次每次約5分鐘，用25% TFA/DCM(30 ml)解封閉 一次約2分鐘且一次約25分鐘，用DCM(20 ml)、異丙醇(IPA)(20 ml) 禾口DCM(20 ml)漂洗三次約2分鐘，用10Q/。三乙胺/DCM(20 ml)中和兩 次約5分鐘，用DCM漂洗三次約2分鐘，以及用DMF(20 ml)漂洗一 次約5分鐘。
將解封閉的樹脂與在14 ml 2:1 DCM/DMF中的1.8克(4.35毫摩 爾，2.5當量)Fmoc-L-半胱氨酸(Acm)(Bachem， CA)和683 ^1(4.35毫摩
爾，2.5當量)二異丙基碳二亞胺(DIC)偶聯約1小時。偶聯的樹脂用 DMF(20 ml)漂洗一次約3分鐘，用異丙醇(IPA)漂洗三次約2分鐘，以 及用DCM(20 ml)漂洗三次約2分鐘。通過Kaiser茚三酮方法檢査偶聯。
偶聯的樹脂然後用DMF漂洗一次，接著用哌啶在DMF中的溶液 解封閉。然後用DMF漂洗解封閉的偶聯的樹脂，以及用MeOH和DCM 兩者漂洗幾次。偶聯的樹脂用DMF(20ml)漂洗一次約3分鐘，用異丙 醇(IPA)(20 ml)漂洗三次約2分鐘，以及用DCM(20 ml)漂洗三次每次約 2分鐘。通過Kaiser茚三酮方法檢查偶聯。
如上所述按照下列順序，利用在DMF/DCM中的DIC，使下列受 保護的胺基酸的每一種與漂洗過的樹脂偶聯並解封閉Fmoc-L-纈氨 酸、Fmoc-L-賴氨酸(Boc)， Fmoc-D-色氨酸、Fmoc-L-酪氨酸(O-t-Bu)和 Fmoc-L-半胱氨酸(Acm)(所有均得自Bachem California)、 Boc-D-2-萘丙 氨酸(Synthetech， Albany, OR)。完成的肽鏈用75:20:5 DCM/TFA/苯甲醚(30 ml)解封閉和脫保護兩 次約2分鐘和約25分鐘，用DCM(20 ml)、 IPA(IO ml)和DCM(20 ml) 漂洗三次每次約2分鐘，用10Q/。三乙胺/DCM(20 ml)中和兩次約5分鐘， 以及用DCM(20 ml)和MeOH(20 ml)漂洗三次約2分鐘。在降低的壓力 下乾燥樹脂。乾重=3.91克(理論值的103%)。
C) H-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2 將得自步驟B的2.93克負載肽的樹脂(1.3毫摩爾當量)懸浮在50
ml3:l MeOH/DMF中。在氮氣中，把懸浮液冷卻至約〈10'C ，以及使無 水氨氣鼓泡直至飽和，同時把溫度保持在低於約IO'C。使漿料輕輕地 混合約24小時，同時使溫度升至約20°C。通過用HPLC(在VYDAC 上，對於甲基酯來說室溫(Rt.) 14分鐘對(vs.)對於醯胺產物來說室溫 ~9.3分鐘，5|Li 100 A，利用26% CH3CN/0.1% TFA無梯度(Isocratic)的 C18， lml/分鐘，220nm)監視甲基酯中間體的消失，來檢查反應完成。 將反應冷卻，並且添加更多無水氨，直到在HPLC上甲基酯的面積低 於產物峰的10%面積。把漿料冷卻至約低於10°C，並且繼續混合過夜， 以使肽沉澱出來。將沉澱物和樹脂過濾並用15 ml冷MeOH漂洗。在 降低的壓力下乾燥沉澱物和樹脂，並且用50。/。乙酸水溶液(3X30 ml， 分成多個部分)從樹脂中提取產物。HPLC分析顯示在混合物中存在870 mg(0.70毫摩爾)標題產物(96%純度，在無梯度HPLC系統上)。
D) H-D-p-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
在氮氣氛中，將得自步驟C的500 mg(0.40毫摩爾)肽溶於300 ml 4%乙酸中並加熱至約55'C。快速攪拌溶液，並且以一個部分添加碘在 7.7 ml MeOH(0.60毫摩爾)中的2% w/v溶液。攪拌混合物約15分鐘， 接著通過用2。/o硫代硫酸鈉溶液滴定至無色終點( 2ml)而結束。將混合 物冷卻至室溫並過濾。將粗混合物在C8填料(YMC， Inc.， Wilmington， NC)上用0.1乙酸銨/乙腈梯度緩衝液通過製備色譜提純，在YMC C8 填料上用0.25N乙酸/乙腈梯度脫鹽，以及凍幹，以得到350 mg99。/。純度的所需的肽。
從上面描述，本領域的技術人員能夠容易地確定本發明的必要特 徵，並且在不偏離其精神和範圍的條件下，能夠完成本發明的各種改 變和修改以使它適應各種用途和條件。因而，其它實施方案也落在權 利要求內。
權利要求
1.一種用於製備包含三個或更多個胺基酸殘基的肽的方法，該肽具有N-端胺基酸、鄰近該N-端胺基酸的倒數第二個胺基酸和C-端胺基酸，其中所述方法包括如下步驟(a)通過酯鍵把第一胺基酸連到固體載體樹脂上，以形成第一級偶聯產物，其包括(i)使碳酸銫的水溶液與第一胺基酸的醇溶液反應，以形成第一胺基酸的銫鹽，(ii)獲得第一胺基酸的無溶劑銫鹽，(iii)在幹的極性非質子溶劑中使固體載體樹脂與第一胺基酸的銫鹽反應，以形成第一級偶聯產物；其中第一胺基酸與肽的C-端胺基酸對應，第一胺基酸的非側鏈氨基被Boc封閉並且第一胺基酸沒有需要保護的側鏈官能團，以及固體載體樹脂為氯甲基化的聚苯乙烯樹脂；(b)利用酸從第一級偶聯產物中解封閉Boc，以形成第一級解封閉的偶聯產物；(c)任選地把下一個胺基酸偶聯到第一級解封閉的偶聯產物上，其包括在包含肽偶聯試劑的有機溶劑中使下一個胺基酸與第一級解封閉的偶聯產物反應，以形成下一級封閉的偶聯產物，其中下一個胺基酸具有被Boc封閉的非側鏈氨基，並且如果下一個胺基酸具有一個或更多個側鏈官能團，那麼側鏈官能團不需要保護，或者側鏈官能團具有對於分別用來解封閉Boc和Fmoc的酸試劑和鹼試劑穩定的保護基團；(d)從下一級封閉的偶聯產物中解封閉Boc，其包括使下一級封閉的偶聯產物與酸反應，以得到下一級解封閉的偶聯產物；(e)任選地重複步驟(c)和(d)，每個循環形成(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物，其中X為所需的循環重複次數；(f)把下一個胺基酸偶聯到得自(b)的第一級解封閉的偶聯產物上，或者任選地偶聯到得自(e)的(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物上，其包括在包含肽偶聯試劑的有機溶劑中使下一個胺基酸與所述第一級解封閉的偶聯產物或所述(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物反應，以形成下一級封閉的偶聯產物，其中下一個胺基酸具有被Fmoc封閉的非側鏈氨基，條件是如果下一個胺基酸具有一個或更多個側鏈官能團，那麼側鏈官能團不需要保護，或者側鏈官能團具有對於用來解封閉Fmoc的鹼試劑穩定的保護基團；(g)從下一級封閉的偶聯產物中解封閉Fmoc，其包括使下一級封閉的偶聯產物與伯胺或仲胺反應，以得到下一級解封閉的偶聯產物；(h)任選地重複步驟(f)和(g)，每個循環形成(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物，其中X為所需的循環重複次數，直到肽的倒數第二個胺基酸被偶聯和解封閉；(i)把N-端胺基酸偶聯到(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物上，其包括在包含肽偶聯試劑的有機溶劑中使N-端胺基酸與(X+1)級的下一級解封閉的偶聯產物反應，以形成完成的封閉的偶聯產物，其中N-端胺基酸具有被Boc或Fmoc封閉的非側鏈氨基；(j)從完成的封閉的偶聯產物中解封閉Boc或Fmoc基團，其包括在Boc的情況下使完成的封閉的偶聯產物與酸反應，或者在Fmoc的情況下與鹼反應，以形成完成的肽-樹脂產物；(k)如果側鏈官能團存在於完成的肽-樹脂產物上，那麼任選地脫保護完成的肽-樹脂產物的側鏈官能團，其包括使完成的肽-樹脂產物與適當的脫保護試劑反應，以形成脫保護的完成的肽-樹脂產物；及(l)使肽與完成的肽-樹脂產物或脫保護的完成的肽-樹脂產物的固體載體樹脂斷裂，以得到肽，其包括使完成的肽-樹脂產物或脫保護的完成的肽-樹脂產物與氨、伯胺或仲胺反應，直到肽與樹脂的斷裂基本上完成，條件是在肽的合成中，步驟(f)和(g)必須進行至少一次。
2. 根據權利要求1的方法，其中步驟(l)的氨、伯胺或仲胺在包含 醇並且任選包含非質子極性溶劑的溶劑中。
3. 根據權利要求l的方法，其中步驟(l)進一步包括下列步驟 (i)從溶劑中沉澱出斷裂的肽；Cii)過濾固體載體樹脂和沉澱出來的肽；及 (iii)在酸溶液中提取肽，以離析肽。
4. 根據權利要求1的方法，其中第一胺基酸為Boc-L-Thr。
5. 根據權利要求4的方法，其中第一胺基酸為得到Boc-L-Thr-樹 脂作為第一級偶聯產物的Boc-L-Thr-銫鹽，並且H-L-Thr-樹脂為第一級解封閉的偶聯產物。
6. 根據權利要求5的方法，其中步驟(j)中用來解封閉Boc基團的 酸為TFA。
7. 根據權利要求6的方法，其中有機溶劑為二氯甲垸、氯仿或二 甲基甲醯胺，並且肽偶聯試劑為二異丙基碳二亞胺、二環己基碳二亞 胺或N-乙基-N'-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺。
8. 根據權利要求7的方法，其包括在式H-L-Thr-樹脂的第一級解 封閉的偶聯產物形成之後，進行步驟(f)和(g)六次，其中按照這樣的順 序偶聯下列胺基酸Fmoc-L-Cys(Acm)、 Fmoc-L-Val、 Fmoc-L-Lys(Boc)、 Fmoc-D-Trp 、 Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu)禾卩Fmoc-L-Cys(Acm)， 以形成 H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-樹脂。
9. 根據權利要求8的方法，其包括根據步驟(i)把Boc-D-卩-Nal偶 聯到H-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-樹脂 上，以形成Boc-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr(0-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys (Acm)-Thr-樹脂。
10. 根據權利要求9的方法，其包括根據步驟(j)同時解封閉 Boc-D-卩隱Nal-Cys(Acm)-Tyr(O曙t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)國Val-Cys(Acm)-Thr -樹脂的封閉D-(3-Nal的Boc基團、保護Tyr的O-t-Bu基團和保護Lys的Boc基團，以得到式H-D-(3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm)-Thr-樹脂的完成的肽-樹脂產物。
11. 根據權利要求10的方法，其包括通過使 H-D-P-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-樹脂與氨在包 含醇並且任選包含非質子極性溶劑的溶劑中反應直到斷裂基本上完 成，使肽，H-D-p-Nal陽Cys(Acm)-Tyr-D-T卬-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr與固 體樹脂斷裂，以得至lj H-D-|3-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2。
12. 根據權利要求ll的方法，其中醇為甲醇並且極性非質子溶劑 為二甲基甲醯胺。
13. 根據權利要求12的方法，其包括通過使H-D-P-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2與碘在醇中的溶液反應直到脫保 護和環化基本上完成，同時脫保護保護Cys的Acm基團並環化所得到 的式H-D-p-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2的完 成的肽-樹脂產物的脫保護的Cys殘基，以得到 H-D-(3-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2。
14. 根據權利要求1的方法，其中肽為H-D-p-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2。
15. 根據權利要求l的方法，其中肽為生長抑素類似物。
16. 根據權利要求1的用於製備包含三個或更多個胺基酸殘基的 肽的方法，該肽具有N-端胺基酸、鄰近該N-端胺基酸的倒數第二個氨 基酸和C-端胺基酸，該方法基本上如以上所描述和例示。
全文摘要
本發明公開了一種利用Boc和Fmoc保護的胺基酸兩者及氯甲基化的聚苯乙烯樹脂合成包含三個或更多個胺基酸殘基的肽的固相方法。
文檔編號C07K1/00GK101541824SQ200780043049
公開日2009年9月23日 申請日期2007年8月31日 優先權日2006年11月21日
發明者凱薩琳·菲奧納·多爾頓, 加裡·亞歷山大·西夫呂克, 史蒂文·艾倫·傑克遜, 約翰·斯圖爾特·艾農 申請人:愛爾蘭伊普森製造有限公司