一種酶法製備¹³C、¹⁵N雙標記L-絲氨酸的方法

2023-05-30 16:30:26 1

專利名稱：：一種酶法製備13C、15N雙標記L-絲氨酸的方法
技術領域：
：本發明屬於生物、醫藥、化工領域，具體涉及一種酶法製備13C、"N雙標記L-絲氨酸的方法。
背景技術：
：L-絲氨酸(L-serine)，分子式C3H7N03，無色晶體，分子量105.09，熔點228°C(分解)。屬於非必需的胺基酸，是一種重要的生化試劑和藥劑，已被廣泛用於胺基酸輸液、食品和飼料添加劑以及化妝品行業等領域。13C、"N-L-絲氨酸是L-絲氨酸的同位素標記化合物，可作為示蹤劑，用於生物體以及藥物代謝等研究。"C和"N雙標記的L-絲氨酸市場上已有銷售，其合成的文獻卻鮮有報導。相關的"C或"N標記L-絲氨酸產品主要採用酶法和化學法合成。如酶法中，MaedaHidekatsu等以MethylobacteriumextorquensJCM2804為出發菌株，利用甘氨酸和["C]甲醛合成[3"C]絲氨酸，絲氨酸濃度9mg/mL(MaedaHidekatsu,TakataKohhei,ToyodaAtsushi，NiitsuTakashi,IwakuraMasanori,ShibataKunihiko.ProductionofL-[3-13C]serinefrom[13C]formaldehydeandglycineusinganenzymesystemcombinedwithtetrahydrofolateregeneration[J].JFermentBioeng,1997,83(1):113-115);JohnHanners等以假單胞細菌AMl(ATCC14718)為出發菌株，^C]甲醇為碳源，[2-13C]甘氨酸為前體物，利用甲基脫氫酶和羥甲基轉移酶，合成了0.84-1.05g/L的L-[2，3-13(22]絲氨酸(JohnHanners,RowenaGibson,KarenVelarde,JudyHammer,MarkAlvarez,JanetGriego,CliffordJUnkefer.Steroselectivesynthesisofstableisotope-labeledL-a-amino:Biosynthesisof2H-，13C-，and15N-LabledL-serines[J].JournalofLabeledCompoundsandRadiopharmaceuticals,1991，29(7):781-790)。化學法中，GaniDavid等利用標記的天門冬氨酸6步合成標記的絲氨酸(GaniDavid,YoungDouglasW.SynthesisofL-serinestereospecificallylabeledatC-3withdeuterium[J],JChemSocPerkinTrans,1983，1(10):2393-2398)，楊飛等以"N-乙醯氨基丙二酸二乙酯為原料，合成"NL-絲氨酸。但是上述方法製備的"C和"N雙標記的L-絲氨酸同位素原料轉化率都很低。
發明內容本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種高純度以及高豐度的酶法製備13C、"N雙標記L-絲氨酸的方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種酶法製備"C、"N雙標記L-絲氨酸的方法，其特徵在於，該方法是將1.0100mg/ml幹菌體、0.10.5M緩衝液以及5100mg/ml同位素原料、5100mg/ml甘氨酸混合，混合物在3040°C、120260r/min下反應1096h，得到的酶促反應液進行樹脂分離、濃縮、過濾、結晶，得到"C、"N雙標記L-絲氨酸產品。所述的幹菌體內含絲氨酸羥甲基轉移酶。所述的緩衝液選自磷酸鹽、碳酸鹽或Tris-HCl中的一種，其pH為7.09.0。所述的同位素原料選自"C-甲醛、甲醇、甲酸中的一種。所述的甘氨酸選自1-13C，"N-甘氨酸、2-13C，"N-甘氨酸、13C2，"N-甘氨酸、"N-甘氨酸中的一種。所述的酶促反應液的上柱液pH為24。所述的樹脂分離採用732樹脂柱吸附，0.1N0.5N氨水洗脫，分別收集絲氨酸、甘氨酸以及甘氨酸和絲氨酸混合物的洗脫液。與現有技術相比，本發明採用1-13C，"N-甘氨酸、2-13C，"N-甘氨酸、13C2，"N-甘氨酸、"N-甘氨酸的一種和"C-甲醛、甲醇或甲酸的一種作為同位素原料，經酶反應獲得13。"N-L-絲氨酸，再經樹脂分離，濃縮、結晶，得到豐度和純度大於98%的13C、"N-L-絲氨酸產品。此工藝簡單，原料來源容易，可獲得高豐度和純度的"C、"N-L-絲氨酸產品。具體實施方式'下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。一種酶法製備"C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將500mg幹菌體、0.1M的磷酸鹽緩衝液、198mg(6mmol)"C-甲醇、456mg(6mmo1)"N-甘氨酸加入到裝有20ml酶轉化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調pH為8.5，混合物在37°C、180r/min下培養48h。將酶促反應液用HC1調pH為3.0，過濾，732樹脂柱吸附，0.2N氨水洗脫，分別收集3-"C、"N-L-絲氨酸、"N-甘氨酸以及"N-甘氨酸和3-13C，"N-絲氮酸混合物的洗脫液，再經濃縮、無水乙醇結晶，得到218.88mg(2.88mmol)15N-甘氨酸和179.76mg(L68mmo1)3-13C、"N-L-絲氨酸。純度不少於98%，豐度大於98%。實施例2一種酶法製備"C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將400mg幹菌體、0.5M的Tris-HCl緩衝液、373mg(12mmo1)"C-甲醛、1.82g(24mmol)1-13C，"N-甘氨酸加入到裝有40ml酶轉化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調pH為8.0，混合物在30。C、120r/min下培養24h。將酶促反應液用HC1調pH為2.4，過濾，732樹脂柱吸附，0.5N氨水洗脫，分別收集1，3-13C、"N-L-絲氨酸、1-13C、"N-甘氨酸以及1-13C、"N-甘氨酸和1，3-13C、"N-絲氨酸混合物的洗脫液，再經濃縮、無水乙醇結晶，得到1.43g(18.6mmo1)"N-甘氨酸和272.16mg(2.52mmo1)1，3-13C、"N-L陽絲氨酸。純度不少於98%，豐度大於98%。實施例3一種酶法製備"C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將3600mg幹菌體、0.2M的碳酸鈉緩衝液、5.64g(120mmo1)130甲酸、4.56g(60mmol)2-13C、"N-甘氨酸加入到裝有60ml酶轉化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調pH為7.0，混合物在40"C、150r/min下培養96h。將酶促反應液用HC1調pH為3.8，過濾，732樹脂柱吸附，0.4N氨水洗脫，分別收集2，3-13C、"N-絲氨酸、2-13C、"N-甘氨酸以及2-"C、"N-甘氨酸和2，3-13C、"N-絲氨酸混合物的洗脫液，再經濃縮、無水乙醇結晶，得到2.95g(37.8mmol)2-13C、"N-甘氨酸和0.84g(8.1mmol)2，3-13C、"N-L-絲氨酸。純5度不少於98%，豐度大於98%。實施例4一種酶法製備"C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將3000mg幹菌體、0.5M的Tris-HCl緩衝液、495mg(15mmo1)"C-甲醇、3g(39.5mmol)13C2-151^-甘氨酸加入到裝有30ml酶轉化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調pH為9.0，混合物在33t:、260r/min下培養96h。將酶促反應液用HCl調pH為3.4，過濾，732樹脂柱吸附，0.15N氨水洗脫，分別收集絲氨酸、13C2、"N-甘氨酸以及13C2、"N-甘氨酸和絲氨酸混合物的洗脫液，再經濃縮、無水乙醇結晶，得到2.25g(28.8mmol)13C2、"N-甘氨酸和294.3mg(2.7mmol)13C3、"N-L-絲氨酸產品。純度不少於98%，豐度大於98%。實施例5一種酶法製備^C、"N-L-絲氨酸，具體方法如下將lg幹菌體、0.45M的磷酸鹽緩衝液、20g(0.43mol)130甲酸、1.52g(20mmo1)"N-甘氨酸加入到裝有200ml酶轉化液的500ml錐形瓶中，用稀氨水調pH為8.4，混合物在32°C、200r/min下培養60h。將酶促反應液用HC1調pH為4.0，過濾，732樹脂柱吸附，0.42N氨水洗脫，分別收集3"C、"N-L-絲氨酸、"N-甘氨酸以及"N-甘氨酸和3-13C、15N-L-絲氨酸混合物的洗脫液，再經濃縮、無水乙醇結晶，得到1.03g(13.5mmol)15N-甘氨酸和257.87mg(2.41mmol)3-13C、"N-L-絲氨酸。純度不少於98%，豐度大於98%。權利要求1.一種酶法製備13C、15N雙標記L-絲氨酸的方法，其特徵在於，該方法是將1.0～100mg/ml幹菌體、0.1～0.5M緩衝液以及5～100mg/ml同位素原料、5～100mg/ml甘氨酸混合，混合物在30～40℃、120～260r/min下反應10～96h，得到的酶促反應液進行樹脂分離、濃縮、過濾、結晶，得到13C、15N雙標記L-絲氨酸產品。2.根據權利要求1所述的一種酶法製備13C、"N雙標記L-絲氨酸的方法，其特徵在於，所述的幹菌體內含絲氨酸羥甲基轉移酶。3.根據權利要求1所述的一種酶法製備13C、"N雙標記L-絲氨酸的方法，其特徵在於，所述的緩衝液選自磷酸鹽、碳酸鹽或Tris-HCl中的一種，其pH為7.09.0。4.根據權利要求1所述的一種酶法製備13C、"N雙標記L-絲氨酸的方法，其特徵在於，所述的同位素原料選自"C-甲醛、甲醇、甲酸中的一種。5.根據權利要求1所述的一種酶法製備13C、"N雙標記L-絲氨酸的方法，其特徵在於，所述的甘氨酸選自1-13C，"N-甘氨酸、2-13C，"N-甘氨酸、13C2，"N-甘氨酸、"N-甘氨酸中的一種。6.根據權利要求1所述的一種酶法製備13C、"N雙標記L-絲氨酸的方法，其特徵在於，所述的酶促反應液的上柱液pH為24。7.根據權利要求1所述的一種酶法製備13C、"N雙標記L-絲氨酸的方法，其特徵在於，所述的樹脂分離採用732樹脂柱吸附，0.1N0.5N氨水洗脫，分別收集絲氨酸、甘氨酸以及甘氨酸和絲氨酸混合物的洗脫液。全文摘要本發明涉及一種酶法製備13C、15N雙標記L-絲氨酸的方法，該方法是將1.0～100mg/ml幹菌體、0.1～0.5M緩衝液以及5～100mg/ml同位素原料、5～100mg/ml甘氨酸混合，混合物在30～40℃、120～260r/min下反應10～96h，得到的酶促反應液進行樹脂分離、濃縮、過濾、結晶，得到13C、15N雙標記L-絲氨酸產品。與現有技術相比，本發明具有工藝簡單，原料來源容易，可獲得高豐度和純度的13C、15N-L-絲氨酸產品等優點。文檔編號C12P13/06GK101503717SQ200910047388公開日2009年8月12日申請日期2009年3月11日優先權日2009年3月11日發明者劉佔峰,孫建春,宋明鳴,徐建飛,李良君,杜曉寧,梅叢笑,剛王申請人:上海化工研究院