海地瓜消化道總rna快速提取方法

2023-06-15 11:19:16 3

專利名稱：海地瓜消化道總rna快速提取方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種海地瓜消化道總RNA的提取方法，尤其是一種步驟相對簡單，提取完整性好、主要用於實時定量PCR (real-time PCR)檢測的海地瓜消化道總RNA的方法。
背景技術：
從海洋生物組織細胞中提取完整性好的RNA是進行分子生物學研究的必要前提和保障，不同的海洋生物組織成分和結構差異較大。因此，對不同物種和組織來源的組織細胞，提取總RNA應該採用相應的方法。海地瓜消化道組織含有消化道內容物，消化道管壁化學成分主要為粘多糖、消化酶、肌肉蛋白等。因此，海底花消化道總RNA提取前樣品處理比較困難，處理不當，將使總 RNA提取得率下降、樣品降解、容易受汙染，嚴重影響後續實時定量PCR檢測工作。

發明內容
本發明的目的就是針對現有技術的不足，提供一種可避免海地瓜消化道總RNA提取中受內容物汙染，提取完整性好、簡便快速的海地瓜消化道總RNA的方法。本發明方法的具體步驟是
步驟(1).解剖取海地瓜消化道，使用針頭縱向剖開消化道管，採用經膜過濾及高溫滅菌的海水清洗後用液氮冷凍；
步驟(2).將冷凍後的海地瓜消化道研磨成粉末，取30 50mg粉末加入到液氮預冷的離心管中；
步驟(3).離心管中加入0. 8 1. 2ml的TRIZOL裂解液，振蕩混勻，常溫下靜置5 lOmin，離心 0. 5 2min ；
步驟取上清液，加入200 300μ1氯仿，振蕩混勻5 lOmin，靜置5 IOmin後離心10 20min，取上層水相200 300μ1 ；
步驟(5).取出的上層水相中加入與上層水相等體積的經過-30 -10°C預冷的異丙醇，混勻後-30 -10°C下靜置10 20min，離心5 15min，沉澱RNA ；
步驟(6).將離心管置於冰盒中，去除上清後加入1 2ml經-30 -10°C預冷的濃度為75%乙醇進行清洗；
步驟(7).吹洗沉澱後，重複步驟(6)；
步驟(8).去除上清後離心1 2min，移液槍吸除剩餘液體，加入20 40μ1的無RNA 酶去離子水，混勻後在3 5°C下放置10 20min，溶解RNA ；
步驟(9).獲得的RNA溶液中加入4 5μ1的無RNA酶的DNA酶緩衝液、8 ΙΟμΙ濃度為lU/μΙ的無RNA酶的DNA酶及1 2μ1的RNA酶抑制劑，混勻後30 40°C恆溫培育 30 60min，成培養液;
步驟(10).培養液中加入與培養液等體積的經過-30 -10°C預冷的異丙醇，混勻後-30 -10°C下靜置10 20min，離心5 15min，再次沉澱RNA ；
步驟(11).再次將離心管置於冰盒中，去除上清後加入1 2ml經-30 -10°C預冷的濃度為75%乙醇進行清洗；
步驟(1 .吹洗沉澱後，重複步驟(11)；
步驟(13).去除上清後離心1 2min，移液槍吸除剩餘液體，加入20 40μ1的無RNA 酶去離子水，混勻後在3 5°C下放置20 40min，再次溶解RNA ；
步驟(14).取1 3P1RNA溶液用於凝膠檢測和濃度檢測，其餘置於-90 -70°C保存。各步驟中所述離心的條件為3 5°C，離心速度為8000 15000 X g。本發明方法在取樣後，採用針頭剖開消化道管，清洗後迅速置入液氮凍存後研磨， 解剖及清洗方便，液氮低溫研磨避免樣品RNA降解；採用預冷異丙醇及低溫靜置沉澱RNA， 提高RNA沉澱效果，降低實驗過程的RNA降解；採用預冷的乙醇重複清洗，並且操作過程置於冰盒中保持低溫，有效降低RNA降解；使用DNAase消化粗體樣品，並加入RNA酶抑制劑， 有效去除基因組DNA汙染，抑制消化過程中的RNA降解。本發明方法提取時間短，RNA完整性好，完全可以滿足實時定量PCR檢測要求。
具體實施例方式實施例1
步驟(1).解剖取海地瓜消化道，使用針頭縱向剖開消化道管，採用經膜過濾及高溫滅菌的海水清洗後用液氮冷凍；
步驟O).將冷凍後的海地瓜消化道研磨成粉末，取30mg粉末加入到液氮預冷的離心
管中；
步驟(3).離心管中加入0. 8ml的TRIZOL裂解液，振蕩混勻，常溫下靜置5min，離心 0. 5min ；
步驟(4).取上清液，加入200μ1氯仿，振蕩混勻5min，靜置5min後離心IOmin，取上層水相200μ1 ；
步驟(5).上層水相中加入與200μ1經過_30°C預冷的異丙醇，混勻後_30°C下靜置 IOmin,離心 5min，沉澱 RNA ；
步驟(6).將離心管置於冰盒中，去除上清後加入Iml經-30°C預冷的濃度為75%乙醇進行清洗；
步驟(7).吹洗沉澱後，重複步驟(6)；
步驟(8).去除上清後離心lmin，移液槍吸除剩餘液體，加入20μ1的無RNA酶去離子水，混勻後在3°C下放置lOmin，溶解RNA ；
步驟(9).獲得的RNA溶液中加入4μ1的無RNA酶的DNA酶緩衝液、8μ1濃度為lU/μΙ 的無RNA酶的DNA酶及 μ 的RNA酶抑制劑，混勻後30°C恆溫培育60min，成培養液；
步驟(10).培養液中加入與培養液等體積的經過_30°C預冷的異丙醇，混勻後_30°C下靜置lOmin，離心5min，再次沉澱RNA ；
步驟(11).再次將離心管置於冰盒中，去除上清後加入Iml經_30°C預冷的濃度為75% 乙醇進行清洗；
步驟(1 .吹洗沉澱後，重複步驟(11)；步驟(13).去除上清後離心lmin，移液槍吸除剩餘液體，加入20μ1的無RNA酶去離子水，混勻後在3°C下放置20min，再次溶解RNA ；
步驟(14).取WlRNA溶液用於凝膠檢測和濃度檢測，其餘置於-90°C保存。各步驟中所述離心的條件為3°C，離心速度為15000 X g。實施例2:
步驟(1).解剖取海地瓜消化道，使用針頭縱向剖開消化道管，採用經膜過濾及高溫滅菌的海水清洗後用液氮冷凍；
步驟O).將冷凍後的海地瓜消化道研磨成粉末，取50mg粉末加入到液氮預冷的離心
管中；
步驟(3).離心管中加入1. 2ml的TRIZOL裂解液，振蕩混勻，常溫下靜置lOmin，離心 2min ；
步驟(4).取上清液，加入300μ1氯仿，振蕩混勻lOmin，靜置IOmin後離心20min，取上層水相300μ1 ；
步驟(5).上層水相中加入300μ1經過-10°C預冷的異丙醇，混勻後-10°C下靜置 20min，離心 15min，沉澱 RNA ；
步驟(6).將離心管置於冰盒中，去除上清後加入2ml經-10°C預冷的濃度為75%乙醇進行清洗；
步驟(7).吹洗沉澱後，重複步驟(6)；
步驟(8).去除上清後離心2min，移液槍吸除剩餘液體，加入40μ1的無RNA酶去離子水，混勻後在5°C下放置20min，溶解RNA ；
步驟(9).獲得的RNA溶液中加入5μ1的無RNA酶的DNA酶緩衝液、ΙΟμΙ濃度為lU/μΙ 的無RNA酶的DNA酶及2μ1的RNA酶抑制劑，混勻後40°C恆溫培育30min，成培養液；
步驟(10).培養液中加入與培養液等體積的經過-10°C預冷的異丙醇，混勻後-10°C下靜置20min，離心15min，再次沉澱RNA ；
步驟(11).再次將離心管置於冰盒中，去除上清後加入2ml經-10°C預冷的濃度為75% 乙醇進行清洗；
步驟(1 .吹洗沉澱後，重複步驟(U)；
步驟(13).去除上清後離心aiiin，移液槍吸除剩餘液體，加入40μ1的無RNA酶去離子水，混勻後在5°C下放置40min，再次溶解RNA ；
步驟(14).取3P1RNA溶液用於凝膠檢測和濃度檢測，其餘置於-70°C保存。各步驟中所述離心的條件為5°C，離心速度為8000 X g。實施例3:
步驟(1).解剖取海地瓜消化道，使用針頭縱向剖開消化道管，採用經膜過濾及高溫滅菌的海水清洗後用液氮冷凍；
步驟O).將冷凍後的海地瓜消化道研磨成粉末，取40mg粉末加入到液氮預冷的離心
管中；
步驟(3).離心管中加入1.0ml的TRIZOL裂解液，振蕩混勻，常溫下靜置8min，離心 Imin ；
步驟(4).取上清液，加入250μ1氯仿，振蕩混勻8min，靜置Smin後離心15min，取上層水相250μ1 ；
步驟(5).上層水相中加入250μ1經過-20°C預冷的異丙醇，混勻後-20°C下靜置 15min，離心 lOmin，沉澱 RNA ；
步驟(6).將離心管置於冰盒中，去除上清後加入1. 5ml經_20°C預冷的濃度為75%乙醇進行清洗；
步驟(7).吹洗沉澱後，重複步驟(6)；
步驟(8).去除上清後離心1. 5min，移液槍吸除剩餘液體，加入30μ1的無RNA酶去離子水，混勻後在4°C下放置15min，溶解RNA ；
步驟(9).獲得的RNA溶液中加入4. 5μ1的無RNA酶的DNA酶緩衝液、9μ1濃度為IU/ μ 的無RNA酶的DNA酶及1. 5μ1的RNA酶抑制劑，混勻後35°C恆溫培育45min，成培養液； 步驟(10).培養液中加入與培養液等體積的經過_20°C預冷的異丙醇，混勻後_20°C下靜置15min，離心lOmin，再次沉澱RNA ；
步驟(11).再次將離心管置於冰盒中，去除上清後加入1.5ml經-20°C預冷的濃度為 75%乙醇進行清洗；
步驟(1 .吹洗沉澱後，重複步驟(11)；
步驟(13).去除上清後離心1. 5min，移液槍吸除剩餘液體，加入30μ1的無RNA酶去離子水，混勻後在4°C下放置30min，再次溶解RNA ；
步驟(14).取2P1RNA溶液用於凝膠檢測和濃度檢測，其餘置於-80°C保存。
各步驟中所述離心的條件為4°C，離心速度為10000 X g。
權利要求
1.海地瓜消化道總RNA快速提取方法，其特徵在於該方法的具體步驟是步驟(1).解剖取海地瓜消化道，使用針頭縱向剖開消化道管，採用經膜過濾及高溫滅菌的海水清洗後用液氮冷凍；步驟( .將冷凍後的海地瓜消化道研磨成粉末，取30 50mg粉末加入到液氮預冷的離心管中；步驟(3).離心管中加入0. 8 1. 2ml的TRIZOL裂解液，振蕩混勻，常溫下靜置5 lOmin，離心 0. 5 2min ；步驟取上清液，加入200 300μ1氯仿，振蕩混勻5 lOmin，靜置5 IOmin後離心10 20min，取上層水相200 300μ1 ；步驟(5).取出的上層水相中加入與上層水相等體積的經過-30 -10°C預冷的異丙醇，混勻後-30 -10°C下靜置10 20min，離心5 15min，沉澱RNA ；步驟(6).將離心管置於冰盒中，去除上清後加入1 2ml經-30 _10°C預冷的濃度為75%乙醇進行清洗；步驟(7).吹洗沉澱後，重複步驟(6)；步驟(8).去除上清後離心1 2min，移液槍吸除剩餘液體，加入20 40μ1的無RNA 酶去離子水，混勻後在3 5°C下放置10 20min，溶解RNA ；步驟(9).獲得的RNA溶液中加入4 5μ1的無RNA酶的DNA酶緩衝液、8 ΙΟμΙ濃度為lU/μΙ的無RNA酶的DNA酶及1 2μ1的RNA酶抑制劑，混勻後30 40°C恆溫培育 30 60min，成培養液;步驟(10).培養液中加入與培養液等體積的經過-30 -10°C預冷的異丙醇，混勻後-30 -10°C下靜置10 20min，離心5 15min，再次沉澱RNA ；步驟(11).再次將離心管置於冰盒中，去除上清後加入1 2ml經-30 -10°C預冷的濃度為75%乙醇進行清洗；步驟(1 .吹洗沉澱後，重複步驟(11)；步驟(13).去除上清後離心1 2min，移液槍吸除剩餘液體，加入20 40μ1的無RNA 酶去離子水，混勻後在3 5°C下放置20 40min，再次溶解RNA ；步驟(14).取1 3P1RNA溶液用於凝膠檢測和濃度檢測，其餘置於-90 -70°C保存。
2.如權利要求1所述的海地瓜消化道總RNA快速提取方法，其特徵在於所述離心的條件為3 5°C，離心速度為8000 15000 X g。
全文摘要
本發明涉及海地瓜消化道總RNA快速提取方法。目前海底花消化道總RNA提取前樣品處理比較困難，總RNA提取得率不高且容易受汙染。本發明方法將採用液氮冷凍海地瓜消化道組織，採用研缽研磨後置入TRIZOL裂解液中裂解、勻漿；組織勻漿離心後取上清，加入氯仿並震蕩混勻，離心取上清；加入低溫異丙醇，混勻、離心沉澱；75%乙醇洗滌；無RNA酶的去離子水溶解沉澱物，-90～-70℃保存。本發明方法有效避免了樣品RNA降解，提高了RNA沉澱效果，該方法提取時間短，RNA完整性好，完全可以滿足實時定量PCR檢測要求。
文檔編號C12N15/10GK102344923SQ20111032883
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者劉永芹, 王天明, 肖金星, 邵慶均, 鄭剛, 馬文明 申請人:浙江大學舟山海洋研究中心