一種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法
2023-06-14 19:55:51 1
專利名稱：一種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法
技術領域：
本發明涉及ー種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，屬於低溫生物學技術領域。
背景技術：
暗色唇魚Semilabeo obscurus Lin,隸屬於鯉科(Cyprinidae)野駿亞科(Labeoninae)唇魚屬(SemiIabeo)。由於該魚體肥、肉嫩、味美,成了捕撈的首選目標。又因其具有群居巖洞的生活習性，便成為不法分子電、毒、炸的最大受害者，隨著魚類資源的利用強度加大和捕撈技術的更新，魚類生物多樣性呈下降趨勢，暗色唇魚已成為李仙江流域珍稀瀕危物種。且暗色唇魚1989年被列入雲南省II級保護動物，1998年被列入《中國瀕危動物紅皮書》。為了保護、開發利用這ー珍稀的土著魚類資源，2007年由雲南省環保局批准立項，雲南大唐國際李仙江流域水電開發有限公司委託中國科學院昆明動物研究所開展了暗色唇魚的人工増殖放流研究。而開展暗色唇魚的精子冷凍保存研究，建立精子庫，長 期保存精子，是種質資源保護與保存的有效途徑之一，也能為遺傳育種提供優良種質材料。自從1949年首次用甘油作為抗凍劑冷凍成功保存精子以來，精子低溫冷凍保存的研究取得了很大進展，並逐漸發展成為物種遷地保護和遺傳種質資源保存的ー個重要手段。在魚類塘養種群遺傳管理實踐中，精子低溫和超低溫冷凍保存能有效地「延長」繁殖個體的繁殖壽命，並在塘養種群的世代數最小化方面顯示出很廣泛的應用潛力，但該技術僅在一小部分動物物種中使用。經文獻檢索，未見與本發明的相同報導。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供ー種方法簡單、操作性強的暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法。本發明的暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，其具體步驟如下a.配子的採集採精方法為輕壓腹部法，選擇形態正常、生長良好、無疾病、達到性成熟的親魚原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，魚類腹部用毛巾擦乾，然後輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到5 mL離心管中；b.鮮精活力檢測先用移液器滴一滴水於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用於精子冷凍；c.冷凍方法將精液與抗凍液按常規三步稀釋法稀釋至精子終密度為2. 5 X IO8個/mL後分裝入I. 8 mL凍存管中，經4°C平衡30 min，然後在液氮面上方6 cm處平衡10min，液氮面上平衡5 min後投入液氮中保存；其中抗凍液為稀釋液D_15+5%甲醇。使用時將保存的精子在40°C水浴中解凍，然後按照常規方法進行人工授精。本發明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。本發明具有成本低，操作簡便，保存時間長，復甦後精子的活力較高，人工繁殖的暗色唇魚的受精率和孵化率較高，能投入規模生產的優點；對於開展魚類資源恢復與重建也具有重要意義。
具體實施例方式本發明的暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，其具體步驟如下I、配子的採集採精方法為輕壓腹部法，選擇性成熟的優良親魚，用100 ppm的MS-222 (Tricaine, C10H15NO3S)麻醉5 min，魚類腹部用毛巾擦乾，然後輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到5 mL離心管中；2、鮮精活力檢測先用移液器滴一滴水於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用於精子冷凍；3、冷凍方法將精液與抗凍液按三步稀釋法稀釋至精子終密度為2. 5 X IO8個/mL後分裝入I. 8 mL凍存管中，經4°C平衡30 min，然後在液氮面上方6 cm處平衡10 min，液氮面上平衡5 min後投入液氮中保存；抗凍液是以稀釋液D-15 (0. 8% NaCUO. 05% KC1、1. 5%Glucose)為基礎液，其中加入5%甲醇。 4、鮮精壽命檢測即精子從被激活至視野中90%以上的精子基本不動為止所持續的時間；5、細胞膜完整率檢測精液稀釋100倍後，用0. 4%臺盼藍染色3 min ;細胞膜破損的精子頭部被染成藍色，而細胞膜完整的精子頭部不被染色；顯微鏡下計算未染色的精子數佔總精子數的百分比；使用時將凍存管從液氮中取出後迅速置於40°C水浴鍋中快速晃動30 S，然後進行人工授精，即將暗色唇魚魚卵擠入容器中，按IO5 1的精卵數量比例加入解凍後的精液，拌勻，再滴加0. 2 ml激活液，攪拌，使卵受精。應用結果表明在鮮精活力為86. 17±4. 06%，壽命為47. 5±3. I S，細胞膜完整率為86. 22±5. 29% ;通過上述冷凍方法，暗色唇魚的精液在超低溫下能夠保存一年；通過上述凍精解凍方法，復甦後凍精的精子活力為76. 33±1. 70%，精子壽命為44. 3±3. 6 S，細胞膜完整率為85. 67± I. 11%，受精率達85%以上。
權利要求
1.ー種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，其特徵在於該保存方法的具體步驟如下 a.配子的採集採精方法為輕壓腹部法，選擇形態正常、生長良好、無疾病、達到性成熟的親魚原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，魚類腹部用毛巾擦乾，然後輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到5 mL離心管中； b.鮮精活力檢測先用移液器滴一滴水於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用於精子冷凍； c.冷凍方法將精液與抗凍液按常規三步稀釋法稀釋至精子終密度為2.5 X IO8個/mL後分裝入I. 8 mL凍存管中，經4°C平衡30 min，然後在液氮面上方6 cm處平衡10 min,液氮面上平衡5 min後投入液氮中保存；其中抗凍液為稀釋液D-15+5%甲醇。
全文摘要
一種暗色唇魚精子超低溫冷凍保存方法，屬於低溫生物學技術領域。本發明的方法為選擇達到性成熟的優質原種或良種，用100ppm的MS-222麻醉5min，輕輕擠壓擦乾的腹部，成熟的精液流入5mL離心管中，檢測鮮精活力，活力在85%以上的精液樣品用於精子冷凍。將採集的優質精液與抗凍液(D-15+5%甲醇)按三步稀釋法稀釋，使精子終密度為2.5×108個/mL，分裝入1.8ml凍存管中，4℃平衡30min，液氮面上6cm平衡10min，液氮面上平衡5min後投入液氮中保存。使用時將保存的精子在40℃水浴中解凍，進行人工授精。本發明具有成本低，操作簡便，保持時間長，復甦後精子的活力較高，人工繁殖的暗色唇魚的受精率和孵化率較高，能投入規模生產的優點；對於開展魚類資源恢復與重建也具有重要意義。
文檔編號A01N1/02GK102763640SQ20121027752
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年8月7日
發明者楊君興, 潘曉賦, 王曉愛, 陳小勇 申請人:中國科學院昆明動物研究所