一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法
2023-06-14 20:03:26 2
一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法
【專利摘要】本發明提供一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法，所述方法包括：（1）精液採集，（2）抗凍液選擇，（3）精子的稀釋與平衡，（4）精子的冷凍，（5）精子的解凍與復甦。本發明具有操作時間短、誘導效果好、毒性作用少、損傷程度小、成活率高等優點，其在大口黑鱸的種質保存、遺傳育種、可持續養殖及病害防治等方面有著重要的理論意義和應用價值。本發明還提供一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法的用途。
【專利說明】一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及精子冷凍【技術領域】，具體涉及一種大口黑鱸精子的冷凍保存方法。
【背景技術】
[0002]我國是一個水產養殖大國，在常規養殖品種迅猛發展之後，特種水產品的養殖得到快速發展。大口黑鱸具有生長快、適應性強、病害少、容易捕撈等諸多優點，其肉味鮮美，營養豐富，頗受養殖者和消費者歡迎。自上世紀80年代引種以來，已經在廣東、浙江和江蘇形成了較大規模的產業。但是因引進時由野生種家養馴化而成，缺少定向選育，隨著時間推移，大口黑鱸出現了不同程度的種質退化，主要表現在性成熟年齡提前、生長速度下降、抵抗疾病能力下降，開展大口黑鱸選育工作，選育生長速度快、品質優良的品系已勢在必行。因此，對其進行精子冷凍保存技術的研究對於大口黑鱸種質資源的保護具有重要意義。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種能高效、長期保存大口黑鱸精子的超低溫冷凍及復甦方法。
[0004]為實現上述目的，本發明提供的技術方案是，一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法，所述方法包括:(1)精液採集，(2)抗凍液選擇，(3)精子的稀釋與平衡，(4)精子的冷凍，(5)精子的解凍與復甦；
(1)精液採集:選擇形態正常、生長良好、無疾病、達到性成熟的大口黑鱸個體，在大口黑鱸繁殖期按800UI/kg胸鰭注射進行誘導促熟，36h後收集精液於4°C冰箱中預冷的乾淨研缽中；
(2)抗凍液選擇:以任氏液為基礎，加10%甲醇抗凍保護劑；
(3)精子的稀釋與平衡:精液與任氏液按1:6稀釋後，經4°C平衡30min，加入10%甲醇，混勻，分裝；
(4)精子的冷凍:分裝好的精液在液氮面上方6cm處平衡IOmin,在液氮面上平衡5min後投入液氣中保存；
(5)精子的解凍與復甦:將凍存管在液氮蒸汽中平衡5分鐘，迅速置於37°C水浴鍋中快速晃動至融化。
[0005]本發明還提供一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法的用途，以所述大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法保存的精子用於進行人工授精:將大口黑鱸魚卵擠入容器中，按IO5:1的精卵數量比例滴加入解凍後的精液，拌勻，再滴加適量激活液(10 mMTrfs, 20 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH=8.5)，拌勻，使卵受精。
[0006]優選的，所述激活液由10 mM Trfs,20 mM NaCl和2 mM CaCl2配成，配好後的激活液 pH=8.5。
[0007]本發明具有操作時間短、誘導效果好、毒性作用少、損傷程度小、授精率高等優點，其在大口黑鱸的種質保存、遺傳育種、可持續養殖及病害防治等方面有著重要的理論意義和應用價值。
【具體實施方式】
[0008]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附後權利要求書限定的範圍。
[0009]實施例1，
親魚的選擇:形態正常、生長良好、無疾病、達到性成熟的原種或良種。
[0010]精子的採集:在大口黑鱸繁殖期按800UI/kg腹腔注射進行誘導增精，36h後，收集精液於4°C冰箱中預冷的乾淨研缽中。
[0011]鮮精活力檢測:先用細口吸管吸一滴水於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下邊攪勻邊觀察其活力。
[0012]冷凍方法:將精液與任氏液按1:6稀釋後，經4°C平衡30min，加入10%甲醇混勻，分裝，在液氮面上方6cm處平衡lOmin，在液氮面上平衡5min後投入液氮中保存。
[0013]解凍方法:將凍存管在液氮蒸汽中平衡5分鐘，迅速置於37°C水浴鍋中快速晃動至融化。
[0014]凍精活力檢測:先用細口吸管吸一滴激活液於載玻片上，對準視野，然後用針尖挑取上述精液立即於顯微鏡下邊攪勻邊觀察其活力。
[0015]本發明具有操作時間短、誘導效果好、毒性作用少、損傷程度小、成活率高等優點。其在大口黑鱸的種質保存、遺傳育種、可持續養殖及病害防治等方面有著重要的理論意義和應用價值。
[0016]以上為對本發明實施例的描述，通過對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或範圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制於本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的範圍。
【權利要求】
1.一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法，其特徵在於，所述方法包括:(1)精液採集，(2)抗凍液選擇，(3)精子的稀釋與平衡，(4)精子的冷凍，(5)精子的解凍與復甦； 精液採集:選擇形態正常、生長良好、無疾病、達到性成熟的大口黑鱸個體，在大口黑鱸繁殖期按800UI/kg胸鰭注射進行誘導促熟，36h後收集精液於4°C冰箱中預冷的乾淨研缽中； 抗凍液選擇:以任氏液為基礎，加10%甲醇抗凍保護劑； 精子的稀釋與平衡:精液與任氏液按1:6稀釋後，經4°C平衡30min，加入10%甲醇，混勻，分裝； 精子的冷凍:分裝好的精液在液氮面上方6cm處平衡IOmin,在液氮面上平衡5min後投入液氣中保存； 精子的解凍與復甦:將凍存管在液氮蒸汽中平衡5分鐘，迅速置於37°C水浴鍋中快速晃動至融化。
2.一種大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法的用途，其特徵在於，以所述大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法保存的精子用於進行人工授精:將大口黑鱸魚卵擠入容器中，按105:1的精卵數量比例滴加入解凍後的精液，拌勻，再滴加適量激活液，拌勻，使卵受精。
3.如權利要求2所述的大口黑鱸精子超低溫冷凍保存及復甦方法的用途，其特徵在於，所述激活液由10 mM Trfs,20 mM NaCl和2 mM CaCl2配成，配好後的激活液pH=8.5。
【文檔編號】C12N5/076GK103719071SQ201210382548
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月11日 優先權日:2012年10月11日
【發明者】徐海華, 王榮泉, 宣雲峰 申請人:吳江市長漾漁業生態科技發展有限公司