核苷酸分子sr2b及其在製備抗糖尿病藥物中的應用的製作方法

2023-06-15 09:35:11 3

專利名稱：核苷酸分子sr2b及其在製備抗糖尿病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種核苷酸分子及其在製備抗糖尿病藥物中的應用。
背景技術：
糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環境因素相互作用而引起的臨床 症候群。因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要標誌， 久病可引起多個系統損害。病情嚴懲或應澉時可發生急性代謝紊亂如酮症酸中毒等。糖尿病主要臨床類型胰島素依賴型糖尿病(IDDM， I型)可發生在任何年 齡，但多發生於青幼年。臨床特點是起病急，多食、多尿、多飲、體重減輕等症 狀較明顯，有發生酮症酸中毒的傾向，必須依賴胰島素治療維持生命。起病初期 血中胰島細胞自身抗體陽性率高。口服葡萄糖胰島釋放試驗可見基礎胰島素水平 低於正常，葡萄糖刺激後胰島素分泌曲線低平，顯示胰島素缺乏。非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM， H型)也可發生在任何年齡，但多見於 40歲以後中、老年。大多數病人起病緩慢，臨床症狀相對較輕或缺如。無酮症酸 中毒傾向，但在一定誘因作用下，也可發生酮症酸中毒或髙滲性昏迷。依賴胰島 素，但在飲食和口服降糖藥治療效果欠佳時，或因併發症和伴發病的存在，有時 亦需要用胰島素控制髙血糖。然而，到目前為止，尚未有人報導用於抗糖尿病的基因藥物。發明內容本發明的目的是提供一種用於製備抗糖尿病藥物的核苷酸分子。 本發明的另一個目的是提供上述核苷酸分子的應用。 本發明提供了一種分離出的核苷酸分子，它的序列包括 GCUGCACGACGUUUAUGAA。稱為SR2B。在本發明中，術語"核苷酸分子SR2B"指具有抑制BRSK2蛋白活性或者 增加胰島素分泌量，並且含有與GCUGCACGACGUUUAUGAA序列髙度同源的 核苷酸序列。該術語還包括與GCUGCACGACGUUUAUGAA的同源性至少 70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術語還包括GCUGCACGACGUUUAUGAA的核苷酸序列變異形式。這 些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地 1-5個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數個(通常為10 個以內，較佳地為5個以內)核苷酸。例如，在GCUGCACGACGUUUAUGAA 後(3 '端)加入若干dT (脫氧胸苷)後形成的序列。在本發明中，可在SR2B後(3 '端)連接dTdT,從而形成 GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT。在本發明還提供了核苷酸分子,其序列包括GCUGCACGACGUUUAUGAA 和AAAGCUGUUCUUGAUGGAG。在本發明還提供了核苷酸分子，其序列包括 GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT和dTdTUUCAUAAACGUCGUGCAGC。本發明還提供了一種載體，它含有上述的核苷酸分子SR2B。 在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用 市售的載體，然後將含有本發明SR2B核苷酸序列的 GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT可操作地連於表達調控序列，可以形成重組 載體。如本文所用，"可操作地連於"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些 部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作 為前體表達並參與多肽的分泌,那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連 於多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如 果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序
列。-般，"可操作地連於"意味著相鄰近，而對於本發明的核酸分子則JE味奢 相鄰且不影響功能。本發明還提供了上述核苷酸分子SR2B的宿主細胞。
在本發明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿 主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞， 昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、 COS、 NIT細胞等。
另一方面，本發明還提供了上述的核苷酸分子SR2B的製備方法，即按 GCUGCACGACGUUUAUGAA的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。
本發明的核苷酸分子SR2B可以採用各種常規的製備方法製備。本發明的 核苷酸分子SR2B序列通常可以用酶解法或人工合成的方法獲得。
本發明還提供了上述的核苷酸分子SR2B在製備抗糖尿病藥物中的應用。用siRNA的方法將含有本發明SR2B核苷酸序列的 GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT和dTdT UUCAUAAACGUCGUGCAGC轉 染入小鼠的胰島P細胞(NU)中，放射性免疫學方法檢測結果顯示，細胞培養 上清中胰島素的含量增加。進一步研究表明，上述siRNA幹擾實驗中，原理是幹擾了小鼠的胰島P細 胞(NIT)中內源BRSK2的表達，才導致細胞培養上清中胰島素的含量增加。
從Northern的結果可見，BRSK2主要在腦和胰腺中表達，尤其以胰腺中的 表達量為最高。Western的結果與前面Northern的結果一致，BRSK2在小鼠中也 主要在腦和胰腺表達。從免疫組化的結果可見，BRSK2主要在胰腺組織的胰島 中表達。
神經元分化相關基因BRSK2 (NCBI中核苷酸的序列號為AF533880,核苷 酸的序列號為AAP97727)在胰腺中有很高的表達量，甚至超過在腦中的表達量。 進--步的免疫組化結果顯示，BRSK2主要在胰腺的胰島中髙表達。將
胰島素的含量，結果顯示，胰島素分泌減少另一方面用siRNA的方法幹擾小 鼠的胰島卩細胞(NIT)中內源BRSK2的表達活性，同樣的放射性免疫學方法檢 測結果顯示，細胞培養上清中胰島素的含量增加。本發明的核苷酸分子SR2B及其類似物，當在治療上進行施用(給藥)時，可 提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的 水性載體介質中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨 被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過 常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局 部給藥。以本發明的核苷酸分子SR2B為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的核苷酸分子SR2B可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的1BRSK2還可與其他治療劑一起使用。當本發明的核苷酸分子SR2B被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用於哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10'傲克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的,.本發明中，所述的抗糖尿病藥物是由含有效治療l:的核苷酸分子SR2B和 藥學上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片 劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至5微克/千克體重。本發明中，所述藥物是針劑或者片劑。
糖尿病(diabetes memtus)是一組由遺傳和環境因素相互作用而引起的臨床 症候群。因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低，引 起糖、蛋白、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要標誌， 久病可引起多個系統損害。病情嚴懲或應激時可發生急性代謝紊亂如酮症酸中毒等。本發明的核苷酸分子SR2B加入小鼠的胰島p細胞(NIT)中，細胞培養上清 中胰島素的含量增加。因此認為，本發明的核苷酸分子SR2B有促進小鼠的胰島卩 細胞(NIT)中胰島素分泌的功能，可以作為新的抗糖尿病藥物或者進行開發，為 緩解和治療糖尿病提供了一種新的途徑和手段。
具體實施方式
實施例1 siRNA幹擾內源BRSK2表達以後對胰島素分泌的影響(1) 將NTT細胞以lM5個/孔的密度接種在24孔板上，將細胞放入C02培 養箱中37"C培養18-24小時，使細胞豐度達到70-80。/i。(2) 用Invitrogen lipofectamine 2000真核轉染試劑盒進行轉染。分別轉染 Nonsilence5fU( siRNA幹擾的陰性對照 )，siRNA(GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT和dTdT UUCAUAAACGUCGUGCAGC) -5 1fil、 3jil和5jil (每jil的濃度為20fiM)。每種轉染重複4個孔。(3) 轉染後16小時，換成完全培養基(DMEM高糖培養基+15。/。胎牛血清) 繼續培養24小時。(4) 重新更換完全培養基(糖濃度為25mM),培養20分鐘後收集培養上清液。(5) 採用放射免疫分析法測定培養上清中胰島素的濃度，檢測試劑盒由上海 市生物製品研究所提供，測定值批內CV<4.2%,批間0^<7.6%。(6) 培養板上的細胞胰酶消化後用細胞計數板計數。(7) 收集計數後的細胞做Western blot檢測內源BRSK2的表達。(8) 處理分析數據。結果表明，用siRNA的方法幹擾小鼠的胰島P細胞(NIT)中內源BRSK2， 同樣的放射性免疫學方法檢測結果顯示，細胞培養上清中胰島素的含量增加。實施例2 BRSK2過量表達對胰島素分泌的影響(1) 將NIT細胞以lxl5個/孔的密度接種在24孔板上，將細胞放入C02培 養箱中37'C培養18-24小時，使細胞豐度達到70-80%。(2) 用Invitrogen lipofectamine 2000真核轉染試劑盒進行轉染。分別轉染 Pcmv-Myc空載體和Pcmv-Myc-BRSK2兩種質粒，每種質粒按照200ng/孔的濃 度各轉染4個孔。(3) 轉染後16小時，換成完全培養基(DMEM髙糖培養基+15。/c胎牛血清) 繼續培養24小時。(4) 重新更換完全培養基(糖濃度為25mM)，培養20分鐘後收集培養上清液。(5) 採用放射免疫分析法測定培養上清中胰島素的濃度，檢測試劑盒由上海 市生物製品研究所提供，測定值批內CV<4.2%,批間CV<7.6%。(6) 培養板上的細胞胰酶消化後用細胞計數板計數。(7) 收集計數後的細胞做Western blot檢測BRSK2-Myc的表達。(8) 處理分析數據。過量表達的結果顯示，小鼠胰島Beta細胞NTT中過量表達BRSK2以後， 胰島素相對分泌量減少。
權利要求
1.一種分離出的核苷酸分子，其特徵在於，它的序列包括GCUGCACGACGUUUAUGAA。
2. —種如權利要求1所述的核苷酸分子，其特徵在於，它的序列包括 GCUGCACGACGUUUAUGAA dTdT。
3. —種如權利要求1所述的核苷酸分子，其特徵在於，它的序列包括GCUGCACGACGUUUAUGAA和UUCAUAAACGUCGUGCAGC。
4. 一種如權利要求1所述的核苷酸分子，其特徵在於，它的序列包括GCUGCACGACGUUUAUGAAdTdT和dTdT UUCAUAAACGUCGUGCAGC.
5. —種載體，其特徵在於，它含有權利要求1、 2、 3或者4所述的核苷酸分子。
6. —種含有權利要求1、 2、 3或者4所述的核苷酸分子的宿主細胞。
7. —種如權利要求1、 2、 3或者4所述的核苷酸分子的製備方法，其特徵 在於，按權利要求l、 2、 3或者4所述的核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團 依次脫水縮合。
8. 如權利要求l、 2、 3或者4所述的核苷酸分子在製備抗糖尿病藥物中的應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特徵是所述的抗糖尿病藥物是由含有效治 療量的權利要求1、 2、 3或者4所述的核苷酸分子和藥學上的載體或者賦形劑組 成的藥物組合物。
10. 如權利要求8所述的應用，其特徵是，所述藥物是針劑或者片劑。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種核苷酸分子及其在製備抗糖尿病藥物中的應用。糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環境因素相互作用而引起的臨床症候群。臨床以高血糖為主要標誌，久病可引起多個系統損害。本發明的本發明的核苷酸分子SR2B加入胰島β細胞中，細胞培養上清中胰島素的含量增加。因此認為，本發明的核苷酸分子SR2B有促進胰島素分泌的功能，可以作為新的抗糖尿病藥物進行開發，為緩解和治療糖尿病提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61P3/10GK101130770SQ20061003025
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月22日 優先權日2006年8月22日
發明者龍 餘, 唐麗莎, 湯文文, 健 袁, 郭澤坤 申請人:復旦大學