快速檢測瓠瓜品種種子純度方法及其試劑盒的製作方法
2023-06-26 11:41:51 2
專利名稱：快速檢測瓠瓜品種種子純度方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於作物生物技術領域，尤其屬於利用診斷性SSR分子標記組合快速檢測瓠瓜主要品種種子純度的方法及其試劑盒。
背景技術：
瓠瓜是我國重要的夏季瓜類蔬菜，深受人民群眾喜愛。我國從事瓠瓜育種、種子生產和經營的科研院所、企業眾多，每年均有新的瓠瓜新品種育成推出。當前生產上應用的瓠瓜品種種類眾多，商業品種間的遺傳相似性愈來愈高，同種異名、同名異種現象日益嚴重， 種子智慧財產權和質量糾紛時有發生，有必要研究開發一種能早期、全年、快速、準確鑑定瓠瓜品種真偽和純度的方法，以服務於瓠瓜育種、種子經營和生產的需要，並切實保護育種者的合法權利。目前我國蔬菜品種包括瓠瓜種子真偽與純度鑑定大多依靠田間表現型鑑定。但該鑑定所需時間較長(一般需50-60天時間)，並受季節的限制，而且作物的表現型易隨環境條件的變化而變化，特別是對於一些形態差異較小的品種間鑑定難度更大。DNA分子標記技術在國內外已被用於鑑別不同品種之間在分子水平上的差異。由於在同一物種的各個品種DNA間存在大量的多態性標記，每一品種均存在有區別於其它品種的獨特標記，即一些特異性DNA片段的組合就稱為該品種的DNA遺傳指紋，各品種獨特的指紋片段構成該物種的DNA指紋圖譜。與傳統的依據表型性狀鑑定相比，基於DNA水平差異的指紋圖譜技術，具有可以在植株生長的任何階段進行，鑑定快速且不受基因表達和環境條件的影響等優點。SSR分子標記是利用真核生物基因組中存在的大量微衛星重複序列設計引物，通過PCR擴增串聯的重複序列，依據微衛星的重複次數在同一物種不同基因型間的差異，揭示長度多態性。SSR由於分布廣、穩定性和多態率高，操作簡單、重複性好、對DNA質量要求較低等，被譽為第二代分子標記的明星。SSR分子標記技術克服了 RAPD穩定性和重複性差， AFLP技術費用昂貴、操作複雜、對DNA的純度和內切酶的質量要求很高等缺點。通過對物種基因組的完全或部分測序可獲得物種DNA序列信息進而設計開發SSR 引物。發明基於SSR分子標記技術的種子純度快速檢測方法，將對規範瓠瓜種子產業，保護瓠瓜育種者的合法權益和農民的切身利益，促進農業增產、農民增收具有重要意義。
發明內容
本發明目的是，針對目前瓠瓜品種種子純度鑑定大多依靠田間表現型觀察方法所存在的鑑定時間長、受季節性限制及作物的表現型易隨環境條件變化等缺陷，提供一種能早期、全年、快速、準確鑑定瓠瓜品種真偽和純度的檢測方法；本發明的另一目的是提供一種便捷實施上述方法的試劑盒。本發明目的通過以下技術方案得以實現。1、快速檢測瓠瓜品種種子純度的方法，該方法按以下步驟進行
(一 )瓠瓜基因組DNA的部分測序和SSR引物開發設計1)以主栽瓠瓜品種「杭州長瓜」為材料，應用測序儀對其基因組DNA進行1/4通量的一次測序，獲得150，253條測序序列；2)運行Newbler序列拼接程序，對所得序列進行序列拼接以去除重複，獲得無冗餘的DNA序列86，561條;3)運行Mr印s 2. 5SSR序列鑑定程序，鑑定DNA序列上含SSR的序列區段，同時設計出跨越SSR位點的PCR引物；交由上海桑尼生物技術公司合成100對SSR引物；(二)SSR引物多態性信息含量PIC計算和診斷性SSR引物組合篩選1)提取44個當前生產上主要的瓠瓜品種DNA，用合成的100對引物分別PCR擴增這些材料的DNA，PCR反應體積為12. 5微升，退火溫度為52°C ；幻統計每對引物的擴增情況，對擴增條帶進行0或1賦值，計算各引物的多態性信息含量即PIC ；3)從擴增條帶的穩定性、多態性條帶的易分辨程度和引物多態性PIC指數三個方面進行綜合評價，選取 LSROl 1，LSROl5，LSR040, LSR045, LSR047, LSR056, LSR063, LSR077 共
8對引物作為診斷性引物組合，具體是
權利要求
1.快速檢測瓠瓜品種種子純度的方法，其特徵在於按以下步驟進行(一)瓠瓜基因組DNA的部分測序和SSR引物開發設計1)以主栽瓠瓜品種「杭州長瓜」為材料，應用測序儀對其基因組DNA進行1/4通量的一次測序，獲得150，253條測序序列；2)運行Newbler序列拼接程序，對所得序列進行序列拼接以去除重複，獲得無冗餘的 DNA 序列 86，561 條；3)運行Mr印s2. 5SSR序列鑑定程序，鑑定DNA序列上含SSR的序列區段，同時設計出跨越SSR位點的PCR引物；交由上海桑尼生物技術公司合成100對SSR引物；(二)SSR引物多態性信息含量PIC計算和診斷性SSR引物組合篩選1)提取44個當前生產上主要的瓠瓜品種DNA，用合成的100對引物分別PCR擴增這些材料的DNA，PCR反應體積為12. 5微升，退火溫度為52°C ；2)統計每對引物的擴增情況，對擴增條帶進行0或1賦值，計算各引物的多態性信息含量即PIC;3)從擴增條帶的穩定性、多態性條帶的易分辨程度和引物多態性PIC指數三個方面進行綜合評價，選取 LSROl 1，LSROl5，LSR040，LSR045，LSR047，LSR056，LSR063，LSR077 共 8 對引物作為診斷性引物組合，具體是
2.快速檢測瓠瓜品種種子純度的試劑盒，該試劑盒包括盒體和12支印pondorf管，在其中4支中分別裝有25mM MgCl2, IOmM dNTP, IOX PCR緩衝液及5U/μ L Taq DNA聚合酶， 其特徵在於在其餘8支印pondorf管中，分別裝有含有正、反向的濃度為ImM的診斷性SSR 檢測引物 LSROl 1，LSRO15，LSR040, LSR045, LSR047, LSR056, LSR063, LSR077 ；此外，盒體中還裝有印有權利要求1步驟(三)所列瓠瓜『浙蒲2號』、『浙蒲6號』、『安吉長瓜』、『蕭山地蒲』及『杭州長瓜』 5個主栽品種標準DNA指紋圖譜的圖片。
全文摘要
本發明公開了快速檢測瓠瓜品種種子純度方法及其試劑盒，屬於作物生物技術領域。方法包括(一)瓠瓜基因組DNA的部分測序和SSR引物開發設計；(二)SSR引物多態性信息含量PIC計算和診斷性SSR引物組合篩選；(三)瓠瓜5個主栽品種標準DNA指紋圖譜的製備；(四)待測瓠瓜樣品的檢測等步驟工藝。該方法應用自主設計的8對診斷性SSR引物，增強了鑑別近似品種的能力，提高了檢測的效率，由傳統田間表現型鑑定的50-60天縮短為4-5小時，降低了檢測費用，約為傳統方法的六分之一，並提高了鑑定的準確性。本發明可在育種和種子企業中推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102251042SQ20111020745
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者劉永華, 吳曉花, 徐沛, 李國景, 汪寶根, 潘榆櫻, 王莎, 魯忠富 申請人:浙江省農業科學院