一種格爾德黴素脂質體的製備及應用的製作方法

2023-06-10 00:27:16

專利名稱：一種格爾德黴素脂質體的製備及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥學領域，涉及一種藥物格爾德黴素的新劑型，具體涉及一種格爾德黴素脂質體及製備方法。本發明還涉及格爾德黴素脂質體作為抗腫瘤劑的應用。
背景技術：
Hsp90抑制劑格爾德黴素(geldanamycin，GA)為我國開發的一種新型強效的苯醌安莎類抗生素，它是由土壤中的吸水鏈黴菌格爾德變種產生的，通過競爭性結合Hsp90N末端ATP/ADP結構域，特異性的抑制Hsp90所必需的ATP酶活性，從而抑制了 Hsp90分子伴侶功能，從而改變Hsp90構象，使其不能與其靶蛋白(即客戶蛋白)結合，抑制其行使正常的分子伴侶功能，最終導致靶蛋白降解，繼而阻斷腫瘤賴以生存的信號通路網絡。對細胞增殖、凋亡和癌症發生都具有重要影響。研究表明，格爾德黴素對乳腺癌，結腸癌，胃癌，惡性膠質瘤，前列腺癌，肺癌，肝癌等都有作用。但由于格爾德黴素有以下幾方面限制1 在動物模型推薦的劑量下，表現嚴重的肝毒性，存在有效劑量限制。2 它在體內的代謝很不穩定並且水溶性極差，因此在臨床研究中受到限制。如果對藥物進行設計，在提高藥效的同時並且降低毒副作用，具有靶向性的給藥系統就是一個很好的選擇。脂質體是一種最常見的比較成熟的靶向給藥系統。脂質體藥物靜脈注射動物或人體後，可以成功的到達原發性腫瘤抑制其生長和轉移，顯示出較強的治療效果，輕微的副作用。脂質體藥物載體大多是由磷脂，膽固醇等物質作為膜材而構成雙分子層的封閉囊泡結構，膜材對所包裹的藥物作用體現在不僅可以有效的防治藥物被體內酶的分解破壞和體液稀釋，延長藥物的作用時間，還可以提高藥物的生物相容性，使其生物利用度增加，增強治療效果。腫瘤的發生是細胞的惡性增殖與細胞凋亡之間平衡失調的結果，目前已經證實多種抗癌藥物的作用機制是通過誘導細胞凋亡而發揮抗癌效果。因此特異性地誘導腫瘤細胞凋亡的藥物和治療方法已成為當今腫瘤學研究的熱點之一。格爾德黴素抗癌的作用機制不僅在於抑制細胞增殖，還在於誘發腫瘤細胞凋亡，但是由於細胞凋亡是一個多階段，多系統參與極其複雜的過程，格爾德黴素誘導凋亡的機制有待進一步研究，格爾德黴素新的劑型格爾德黴素脂質體在抑制細胞增殖方面是否會顯示出更好的效果，未見研究報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種抗腫瘤藥物脂質體，其包含抗腫瘤活性劑，磷脂，根據需要還可以加入除磷脂以外的其他輔料。本發明所述的抗腫瘤活性劑為Hsp90抑制劑，所述的Hsp90抑制劑為格爾德黴素或其衍生物，優選格爾德黴素。本發明所述的磷脂選自卵磷脂，大豆磷脂，腦磷脂或人工合成磷脂中的一種或多種。本發明所述的脂質體，其中的抗腫瘤活性劑與磷脂的比例，按摩爾比計算，為抗腫瘤活性劑2-10 磷脂90-98。本發明的脂質體中的抗腫瘤活性劑濃度為0. 5-4mg/L0本發明的另一目的在於提供製備格爾德黴素脂質體的方法。本發明的目的還在於將格爾德黴素脂質體應用於製備抗腫瘤藥物。本發明的格爾德黴素脂質體的製備方法是，將格爾德黴素與磷脂用氯仿溶解後， 旋轉真空蒸發成膜，加入PBS，超聲水化，得到格爾德黴素脂質體。優選的，本發明的製備格爾德黴素脂質體的具體方法，如下按摩爾百分比取各組分抗腫瘤活性劑格爾德黴素2-10份；磷脂90-98份，將上述各組分置於茄形瓶中並用氯仿溶解，旋轉真空蒸發成脂膜(37°C)。置於乾燥器中避光放置池左右，充分揮去有機溶劑。將在37°C溫浴好的PBS (PH = 7. 4)的緩衝溶液加入到脂膜中，先水浴超聲(30°C超聲分散15min)，並不時振搖。然後探頭超聲(冰浴，超聲:3min)。 即得格爾德黴素脂質體。上述涉及到的磷脂可以選用卵磷脂，大豆磷脂，腦磷脂或人工合成磷脂中的一種或多種。上述所製備的格爾德黴素脂質體中的抗腫瘤活性劑濃度為0. 2-10mg/L，優選為 0. 5-4mg/L。所製備的脂質體溶液經檢測，粒徑為150-200nm，Zeta電位為-20 _50mV，包封率達80%以上。本發明還包括所製備的格爾德黴素脂質體具有緩釋功能，優選的各組分的配比為格爾德黴素0. 01-10% (W/V)，磷脂1-30% (W/V)，其餘為ρΗ7· 4的等滲PBS，最優選的本發明的脂質體，製備如下格爾德黴素10摩爾；磷脂90摩爾，將上述各組分置於茄形瓶中並用氯仿溶解，旋轉真空蒸發成脂膜(37°C)。置於乾燥器中避光放置池左右，充分揮去有機溶劑。將在37°c溫浴好的PBS (PH = 7. 4)的緩衝溶液加入到脂膜中， 先水浴超聲(30°C超聲分散15min)，並不時振搖。然後探頭超聲(冰浴，超聲:3min)。即得格爾德黴素脂質體。其粒徑為150_200nm，Zeta 電位在-20—50mV 之間。本發明以荷肉瘤S180小鼠為模型，採用尾靜脈給藥的治療方案體內評價了本發明實施例1所製備的格爾德黴素脂質體的抗腫瘤活性，並與原料藥格爾德黴素作比較，結果顯示格爾德黴素脂質體在更低的劑量情況下比原料藥物格爾德黴素具有更優異的抗腫瘤效果。同時也顯示了格爾德黴素在低劑量時就達到了原料藥物格爾德黴素在高劑量時的抗腫瘤效果。本發明選用肝癌HepG2細胞為模型，考察了格爾德黴素脂質體對肝腫瘤細胞增殖的影響，通過與格爾德黴素的比較來顯示所製備的格爾德黴素脂質體具有更好的抗腫瘤效^ ο本發明提供了所製備的格爾德黴素脂質體，特別是優選方法製備的，經檢測其質量外觀均一，性質穩定，製備方法簡單，具有緩釋，靶向效果，改善了原料藥物在體內的代謝不穩定且水溶性極差的限制。在動物模型中，所製備的格爾德黴素脂質體在較低劑量表現出優異的抗腫瘤效果，在肝腫瘤細胞模型中，格爾德黴素脂質體抑制腫瘤細胞的生長，顯示出比格爾德黴素更強的抑制腫瘤細胞增殖的效果。本發明首次將格爾德黴素製成脂質體，目前，在國內外均未見格爾德黴素脂質體的報導，更沒有相關製劑的上市，因此本發明具有實際應用前景與潛在經濟價值。以下通過實驗數據來說明本發明的有益結果，它們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。1、格爾德黴素脂質體的形態及穩定性觀察通過透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡呈像觀察其微觀結構，其呈圓形球狀，見附

圖1，圖2。具體操作方法1.透射電子顯微鏡呈像將製備好的脂質體，用三蒸水稀釋一定倍數，取IOyL置於銅網表面，下襯濾紙，自然揮幹後，準備透射電鏡觀察。調整電鏡電子束電壓為80KV，移動坐標，放大倍數，尋找觀察粒子並拍照(見附圖1)2.掃描電子顯微呈像將製備好的脂質體，用三蒸水稀釋一定倍數，取20 μ L於蓋玻片上，自然揮幹後，噴金， 準備掃描電鏡下觀察。調整電鏡電子束電壓為20KV，移動坐標，放大倍數，尋找觀察粒子並拍照(見附圖2)。通過隨機選取三個劑型觀察其穩定性。在4°C放置半個月，觀察樣品隨時間延長粒徑，電位，包封率的變化。通過對脂質體穩定性的考察發現，格爾德黴素脂質體在4°C條件下保存半個月，其粒徑，電位，包封率都沒有發生明顯的變化，見附圖3，圖4。2、格爾德黴素脂質體的體外釋放度考察格爾德黴素的體外釋放通過以下方式實現製備載藥量為100mg/L格爾德黴脂質體，精密吸取2mL於處理好的透析袋中，兩端用透析夾加緊，置於含有50mL透析介質的廣口瓶中。將廣口瓶放入37°C空氣恆溫震蕩器中，100次/分振蕩，於lh，2h，4h，6h，8h，12h， Mh，36h，4 i取樣並更換50mL新鮮透析介質。取出的介質用0. 45 μ m微孔濾膜過濾後，取濾液進樣，HPLC分析格爾德黴素藥物的濃度。見附圖5。3、格爾德黴素脂質體的抗腫瘤活性觀察取腹腔接種S18tl腹水瘤第八天的昆明種小鼠一隻，脫頸椎處死，用75%酒精消毒後置於超淨臺內，用鑷子夾起腹部中線偏右的皮膚並用小剪刀剪一小口至可見乳白色腹水流出。將吸管由開口處輕輕插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水加到裝有約3mL滅菌生理鹽水的15mL的離心管中，使體積增至約10mL。用吸管輕輕吹氣，使腹水與生理鹽水混勻。試管加蓋，1000轉/分離心5分鐘。棄去上清液後，加9mL滅菌生理鹽水，用吸管輕輕吹氣，使瘤細胞均勻浮起，試管加蓋，1000轉/分離心5分鐘，棄去上清液。試管底部有的乳白色的膠狀物。往試管底部的乳白色膠狀物中加9mL滅菌生理鹽水，用吸管輕輕吹氣，使瘤細胞均勻浮起。取100 μ L該懸浮液加至9. 9mL滅菌生理鹽水中，混勻，得100倍稀釋液，混勻，加蓋， 放入冰中待用。取100 μ L上述瘤細胞稀釋液置入Eppendoff小管中，加100 μ L臺盼蘭染液，混勻。取少許該混勻液加至計數板的計數池內，於顯微鏡下計算4個大格中被染上藍色的存活瘤細胞的個數。將原液中的存活瘤細胞稀釋成1. OX IO7個/mL，用於接種。用2% 碘酒棉球和75%酒精棉球在小鼠右側腋下消毒，並注入0. 2mL瘤細胞液，緩緩抽出針頭。按此方法給每批ICR種小鼠接種，隨機分組，放入動物室飼養。藥物分組及製備本實驗共設9組1. N. S組2.空白脂質體組3. 0. 5 % CMC-Na組4. GA低劑量組 (0. 5mg/kg) 5. GA中劑量組(lmg/kg) 6. GA高劑量組(％ig/kg) 7. GA脂質體低劑量組(0. 5mg/ kg) 8. GA脂質體中劑量組(lmg/kg) 9. GA脂質體高劑量組(％ig/kg)藥物混懸液液製備精密稱取藥物並研碎，加入兩滴吐溫80潤溼，然後用0. 5 %CMC-Na製成混懸液。陽性對照為格爾德黴素的CMC-Na溶液，陰性對照為CMC-Na溶液；脂質體的分散體系為高溫高壓滅菌後的PBS緩衝溶液的，陽性對照為格爾德黴素脂質體，陰性對照為空白脂質體。設給藥劑量分別為低(0. 5mg/kg)，中(lmg/kg)，高(％ig/kg)三個劑量，相對應的藥物濃度0. 05mg/mL, 0. lmg/mL, 0. %ig/mL。脂質體製備方法採用薄膜分散法。將右側腋下接種有腹水瘤的小鼠隨機分組，每組10隻，共9組。各組小鼠在動物部正常飼養，從接種後，於1，3，5，7天尾靜脈給藥。每次尾靜脈注射各組藥物O.aiil。第8 天將各組荷瘤小鼠處死，解剖，取瘤。並稱體重和瘤重，按抑瘤率=[(陰性對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/陰性對照組平均瘤重]X 100%計算抑瘤率。將格爾德黴素脂質體的抑瘤率與原料藥格爾德黴素的抑瘤率作比較見附圖6。獲得的數據以(X±SD)表示，並做t檢驗。結果見表2。由表2可以看出GA脂質體在小劑量時抑瘤率已達到70%以上，表現出優越的抗腫瘤活性，高於原料藥GA小劑量組，有顯著性差異(P < 0. 05)。GA脂質體中，高劑量組與低劑量組雖有差異，但無統計學意義，說明GA脂質體給藥劑量在0. 5mg/kg時已經有很好的抗腫瘤效果。原料藥GA組中，抗腫瘤率隨著給藥劑量的增加而增大，中，高劑量與低劑量比有顯著性差異，但高劑量與中劑量比雖有差異，但無統計學意義。給藥劑量在細g/kg時抑瘤率才達到70%以上。同樣的抗腫瘤效果，脂質體的給藥劑量比原料藥降低了 8倍。充分說明了脂質體的優勢。藥物被包封於脂質體中，能降低藥物毒性，增強藥理作用。表2原料藥格爾德黴素(GA)及格爾德黴素脂質體對荷肉瘤S180小鼠的作用(η =10)
權利要求
1.一種抗腫瘤藥物脂質體，其特徵在於其包含抗腫瘤活性劑，磷脂和除磷脂外的其他輔料。
2.權利要求1所述的脂質體，其特徵在於，所述的抗腫瘤活性劑為Hsp90抑制劑。
3.權利要求2所述的脂質體，其特徵在於，所述的Hsp90抑制劑為格爾德黴素或其衍生物。
4.權利要求1所述的脂質體，其特徵在於，所述的磷脂選自卵磷脂，大豆磷脂，腦磷脂或人工合成磷脂中的一種或多種。
5.權利要求1-4任一項所述的脂質體，其特徵在於，所述的抗腫瘤活性劑與磷脂的比例，摩爾比為抗腫瘤活性劑2-10 磷脂90-98。
6.權利要求5所述的脂質體，其特徵在於，所述脂質體中的抗腫瘤活性劑濃度為0. 5-4mg/L。
7.一種製備權利要求1-6任一項所述格爾德黴素脂質體的製備方法，其特徵在於，採用的方法為薄膜分散法，逆向蒸發法，冷凍乾燥法，注入法或者超聲分散法中的其中一種。
8.權利要求7中所述的製備方法，其特徵在於，所述的薄膜分散法為精密稱取抗腫瘤活性劑和磷脂，將上述各組分置於茄形瓶中並用氯仿溶解，旋轉真空蒸發成膜。置於乾燥器中避光放置池左右，將在37°C溫浴好pH = 7. 4的PBS緩衝溶液加入到脂膜中，先水浴超聲，並不時振搖，然後探頭超聲，即得脂質體。
9.權利要求1-6任一項的所述脂質體在製備抗腫瘤藥物中的應用。
10.權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述脂質體在製備抗肝腫瘤以及抗腹水腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種格爾德黴素脂質體的製備及應用，本發明中格爾德黴素脂質體由格爾德黴素與磷脂按一定的摩爾百分比組成，採用薄膜分散法製備，本發明所製備的脂質體性質穩定，具有緩釋和靶向作用，本發明以S180腹水瘤小鼠為模型評價了格爾德黴素脂質體的抗腫瘤活性，結果表明格爾德黴素脂質體在更低的劑量情況下比格爾德黴素具有更優異的抗腫瘤效果，本發明以肝腫瘤細胞HepG2為模型評價了格爾德黴素脂質體抗肝腫瘤效果，結果顯示格爾德黴素脂質體抑制肝腫瘤細胞生長，而且顯示出比格爾德黴素更好的抗肝腫瘤效果。
文檔編號A61K31/395GK102552150SQ201210053990
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者崔國輝, 崔純瑩, 董稅田 申請人:首都醫科大學