一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器及其製備方法
2023-06-09 10:02:31 4
一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器，該納米傳感器既具有對溶氧量敏感的螢光壽命，又能特異性靶向細胞內的線粒體。細胞吞噬氧氣納米傳感器後，細胞質內及線粒體內的溶氧量的變化均可通過納米傳感器的螢光壽命的變化進行檢測。本發明具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器擁有如下特性：（一）PLL殼層使得傳感器擁有很好的生物體相容性，同時封裝也使得探針對外部的幹擾具有抗性；（二）線粒體靶向性良好；（三）螢光壽命的氧氣靈敏度高；（四）可實現對細胞內不同位置的溶氧量的檢測。
【專利說明】一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物溶氧量螢光檢測的【技術領域】，具體涉及一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器及其製備方法。
【背景技術】
[0002]線粒體是細胞內重要的細胞器，在維持生理功能的穩態方面起重要作用。線粒體功能的失調和一系列的病理疾病直接有關，如肥胖症、糖尿病、腫瘤、和心血管疾病等，因此，對細胞線粒體功能的檢測具有十分重要的意義。眾所周知，線粒體是細胞內有氧呼吸產生能量的主要場所，細胞內大部分的氧被線粒體利用。如能對線粒體內的溶氧量水平進行實時監測，則可以間接反映出線粒體的活性以及其代謝功能。
[0003]近年來利用氧氣探針分子摻雜的螢光納米傳感器來檢測細胞內溶氧量已為科研人員認可。螢光氧氣探針一般採用過渡金屬配合物，其金屬配體電荷轉移的螢光性質對氧含量非常敏感。一般而言，隨著氧含量水平的升高，其螢光強度和壽命均降低。將氧氣探針分子包覆於對氧氣具有通透性的納米粒子內製備成納米傳感器，並通過細胞內吞作用進入細胞質中，則可以實現對細胞內溶氧量的檢測。但目前特異性對線粒體內溶氧量的螢光檢測仍是一項具有挑戰性的工作。要使納米載體靶向線粒體，需要在納米載體上修飾能特異識別並且進入線粒體的功能結構。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的第一個技術問題是提供一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器，該納米傳感器既具有對溶氧量敏感的螢光壽命，又能特異性靶向細胞內的線粒體。細胞吞噬氧氣納米傳感器後，細胞質內及線粒體內的溶氧量的變化均可通過納米傳感器的螢光壽命的變化進行檢測。
[0005]為解決第一個技術問題，本發明採用下述技術方案:
[0006]一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器，所述螢光氧氣納米傳感器為具有線粒體靶向性的核殼結構的螢光氧氣納米顆粒；所述螢光氧氣納米顆粒是以十二烷基三甲氧基矽烷-聚苯乙烯和二氧化矽為核(DTS-PS)，以多聚賴氨酸(PLL)為殼的核殼結構，其中，鉬(II )MES0-四(五氟苯)卟吩(PtTFPP)分子分散於核層中作為氧氣探針，殼層表面偶聯三苯基膦(TPP)。
[0007]優選地,所述突光納米氧氣傳感顆粒粒徑為100_150nm。
[0008]本發明還提供一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器的製備方法，包括以下製備步驟:
[0009]I)將鉬(II ) MESO-四(五氟苯)卟吩分子PtTFPP，聚苯乙烯PS和十二烷基三甲氧基矽烷DTS按照1-3%:47-49%: 50%的質量比溶解於四氫呋喃；
[0010]2)將上述溶液在超聲震蕩條件下注入到pH值為9的含有0.01-0.02mg/ml的多聚賴氨酸PLL的去離子水中，得到懸浮液；
[0011]3)將上述懸浮液靜置2小時後，將其在二次蒸餾水中透析24小時，然後加入相當於多聚賴氨酸PLL摩爾濃度30倍的三苯基膦TPP及1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽EDC，震蕩兩小時，再透析24小時即得具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器。
[0012]本發明的有益效果:
[0013]本發明中PtTFPP的應用是基於它具有較長的發光壽命、大的stokes位移和易於被氧氣猝滅等特點。當受光激發後，電子從單線態基態躍遷到單線態MLCT激發態，並以非輻射的形式躍遷到三線態MLCT激發態，電子再回到基態時就會產生發光現象。氧分子與處於激發態的發光分子通過碰撞發生能量傳遞，進而使發光分子的發光猝滅，氧分子變為單線態氧。PLL的應用提高了螢光氧氣納米傳感器的生物兼容性，並為進一步偶聯線粒體靶向序列TPP提供靶點一伯胺基團。通過偶聯TPP，使螢光氧氣納米顆粒成功靶向細胞內線粒體。納米粒子中，PS和DTS分別作為基質和封裝劑。在超聲注入過程中，由於水相對於四氫呋喃的比例的突然增加，疏水性化合物聚合以形成顆粒。同時，DTS水解和縮聚導致二氧化矽基顆粒的封裝。隨後，由於PLL的氨基和矽烷醇基團之間的靜電引力，PLL分子吸附到顆粒表面上，而形成核殼結構的納米粒子。氧氣探針PtTFPP隨機分布在疏水性的DTS-PS核心部位，被帶負電荷的二氧化矽層封裝，表面進一步吸附PLL分子，從而使聚合物雜化納米粒子表面修飾伯胺基團，然後基於胺基偶聯化學連接親脂性陽離子物質(TPP)，依賴線粒體膜高電位能的推動，將與之結合的納米載體轉運至線粒體基質。氧氣探針的螢光壽命有較強的氧氣敏感性，PLL對納米顆粒包覆使其具有較好的生物相容性，偶聯TPP使納米粒子具有線粒體靶向性。上述特性使得這種核殼結構納米顆粒在生物氧氣傳感方面具有極大的應用價值。
[0014]本發明具有線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器擁有如下特性:(一)PLL殼層使得傳感器擁有很好的生物體相容性，同時封裝也使得探針對外部的幹擾具有抗性；(二)線粒體靶向性良好；(三)螢光壽命的氧氣靈敏度高；(四)可實現對細胞內不同位置的溶氧量的檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明
[0016]圖1為具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米顆粒的截面示意圖。
[0017]圖2為具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米顆粒的掃描電鏡照片。
[0018]圖3為螢光氧氣納米傳感器壽命與溶氧量的關係的標定曲線示意圖。
[0019]圖4為MTT比色法檢測螢光納米氧氣傳感顆對HepG2細胞的毒性的示意圖。
[0020]圖5為對比分析偶聯TPP納米顆粒、未偶聯TPP納米顆粒及未包覆PLL的納米顆粒對細胞新陳代謝刺激的反應示意圖。曲線指線粒體靶向納米傳感器的發光壽命變化趨勢，一紅色對應細胞內氧氣納米傳感器的發光壽命變化趨勢,—對應細胞外氧氣納米傳感器的發光壽命變化趨勢。
【具體實施方式】[0021]為更好地理解本發明，下面將通過具體的實施例進一步說明本發明的方案，本發明的保護範圍應包括權利要求的全部內容，但不限於此。
[0022]實施例1
[0023](I)將PtTFPP，PS和DTS按照2:48:50的質量比溶解於四氫呋喃中，並且使它們在溶液中的總濃度為0.2 %。然後，使用微量調節注射器，取上述溶液500 μ L，在超聲震蕩條件下迅速注入到pH值為9 (用氨水調整pH值)的去離子水中，由此產生的懸浮液經超聲震蕩2小時後，隨後在二次水中透析24小時，即得到用於細胞外部氧含量測量的納米顆粒。
[0024](2)同等濃度PtTFPP，PS和DTS的混合溶液在超聲震蕩條件下迅速注入到pH值為9的PLL濃度為0.02mg/ml的去離子水中，由此產生的懸浮液經超聲震蕩2小時後，隨後在二次水中透析24小時(除去有機溶劑和多餘的PLL)，即得到PLL包覆的核殼結構納米顆粒，用於檢測細胞內的氧含量。
[0025](3)在上述包覆PLL的納米顆粒中，加入相當於PLL摩爾濃度30倍的TPP和EDC溶液後，震蕩兩小時，實現TPP與納米顆粒的偶聯，即得到線粒體靶向的納米粒子，用於檢測細胞內線粒體的氧含量。
[0026]細胞的吞噬效率的探究
[0027]用線粒體示蹤劑(Mitotracker)對吞曬了偶聯TPP的納米粒子的腫瘤細胞的線粒體進行染色，HepG2細胞無血清培養至匯合率大約50%時，加入螢光納米顆粒，使其濃度達到10mg/ml，與細胞孵育24小時，隨後使用PBS衝洗3遍，通過共聚焦顯微鏡觀察細胞的納米顆粒吞噬效率。利用共聚焦螢光顯微鏡對示蹤劑和納米顆粒雙通道成像。通過二者成像位置的複合證實本發明中的氧氣納米傳感器對細胞內的線粒體具有靶向性。
[0028]細胞內氧氣探針壽命與溶氧量的關係
[0029]細胞內突光氧氣納米顆粒的壽命的表徵，是通過Victor4(Perkin_Elmer LifeSciences)多標記分析儀的時間分辨突光檢測功能計算得到。340nm光激發，642nm處檢測螢光強度，間隔一定時間周期性測量每個微孔，延遲時間分別為30us和70us，gate time為lOOuso標定細胞外、細胞內、線粒體內探針壽命與溶氧量的校準曲線的方法是,將細胞培養於24孔板中，分別加入三種螢光探針，共培養24小時後，替換無酚紅培養基，使用PBS衝洗三遍，加入4uM的Rotenone抑制細胞呼吸，隨後分別通入0，0.86，1.72，2.58，4.3和8.6ppm的氧氣，測試其壽命變化，進而標定壽命與氧氣含量的關係。
[0030]本發明中的核殼結構納米顆粒的衰減時間對氧氣極為敏感。圖3給出了氧氣敏感納米顆粒的發光壽命隨氧氣濃度的變化曲線，可以觀察到，壽命隨著氧氣濃度的上升而迅速縮短，氧氣濃度的變化趨勢可以通過單指數函數進行擬合。
[0031]毒性檢測
[0032]螢光氧氣納米傳感器對細胞毒性的測試是通過MTT比色法進行的，首先，以每孔5000個細胞接種到96孔板，每孔體積0.2mL,培養箱中培養24小時。然後更換培養基，加入不同濃度梯度的螢光氧氣傳感納米顆粒。培養24小時後，每孔加0.02mL的MTT溶液(5mg/mL，使用PBS配致)。在培養箱中孵育4小時後，終止培養，清除孔內的廢液。在孔板的每孔中加入0.15mL的DMS0，遮光振蕩約10分鐘，使結晶物得到充分的溶解。然後利用酶聯免疫檢測儀測定其在波長為490nm的光吸收值，從而可以間接反映細胞的成活數量。在一定細胞數範圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。[0033]細胞新陳代謝功能分析
[0034]細胞新陳代謝功能分析是通過螢光氧氣納米傳感顆粒的壽命變化來表徵的，通過氧氣傳感器探針壽命標定細胞外、細胞內及線粒體內氧含量與細胞新陳代謝的關係。加入線粒體解耦聯劑FCCP，使線粒體膜通透性增加，減少細胞內ATP的生成，增加產熱，促進細胞呼吸，降低細胞內氧含量。基於螢光氧氣納米傳感器對線粒體內、細胞內及細胞外溶氧量進行螢光壽命檢測，氧氣納米傳感器的螢光壽命即溶氧量水平與細胞新陳代謝的關係見圖
5。基於線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器，通過時間分辨螢光檢測，探究線粒體內、細胞內及細胞外氧含量對細胞新陳代謝變化的反應，在96孔板中，培養濃度為3*104的H印g2細胞，與探針共培養24小時後，加入FCCP，使用礦物油密封，觀察納米粒子壽命隨時間的變化情況。加入FCCP後，細胞外，細胞內，及線粒體內探針壽命都逐漸增加，因為加入FCCP後，線粒體呼吸作用得到促進，使氧氣濃度降低，壽命變長。但是相比較而言，細胞外氧氣含量變化較少，線粒體內變化率最明顯，因為FCCP首先作用於線粒體，線粒體呼吸加強，使線粒體附近氧氣含量迅速減少，進而使細胞內氧含量減少，最終使細胞外培養基中的氧氣逐漸被消耗。
[0035]實施例2
[0036]重複實施例1，其不同之處僅在於鉬(II )MES0_四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基矽烷質量比為按照1:49:50，多聚賴氨酸的去離子水濃度為0.0lmg/ml ο
[0037]實施例3
[0038]重複實施例1，其不同之處僅在於鉬(II )MES0_四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基矽烷質量比為按照3:47:50。
[0039]實施例4
[0040]重複實施例1，其不同之處僅在於步驟3)是將懸浮液靜置I小時後，將其在二次蒸餾水中透析20小時，然後加入相當於多聚賴氨酸PLL摩爾濃度20倍的三苯基膦及1- (3- 二甲氨基丙基)-3_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽，震蕩I小時，再透析40小時得到具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器。
[0041]實施例5
[0042]重複實施例1，其不同之處僅在於步驟3)是將懸浮液靜置3小時後，將其在二次蒸餾水中透析40小時，然後加入相當於多聚賴氨酸PLL摩爾濃度40倍的三苯基膦及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽，震蕩2小時，再透析20小時得到具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器。
[0043]顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發明的實施方式的限定，對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這裡無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬於本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之列。
【權利要求】
1.一種具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器，其特徵在於，所述螢光氧氣納米傳感器為具有線粒體靶向性的核殼結構的螢光氧氣納米顆粒；所述螢光氧氣納米顆粒是以十二烷基三甲氧基矽烷-聚苯乙烯和二氧化矽為核，以多聚賴氨酸為殼的核殼結構，其中，鉬(II )MESO-四(五氟苯)卟吩分子分散於核層中作為氧氣探針，殼層表面吸附三苯基勝基團。
2.根據權利要求1所述的具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器，其特徵在於:所述突光納米氧氣傳感顆粒粒徑為100-150nm。
3.如權利要求1-2所述的具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器的製備方法，其特徵在於，包括以下製備步驟: 1)將鉬(II)MESO-四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基矽烷按照1-3:47-49:50的質量比溶解於四氫呋喃； 2)將上述溶液在超聲震蕩條件下注入到pH值為9的含有濃度為0.01-0.02mg/ml的多聚賴氨酸的去離子水中，得到懸浮液； 3)將上述懸浮液靜置1-3小時後，將其在二次蒸餾水中透析20-40小時，然後加入相當於多聚賴氨酸PLL摩爾濃度20-40倍的三苯基膦及1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽，震蕩1-2小時，再透析20-40小時即得具有細胞線粒體靶向性的螢光氧氣納米傳感器。
【文檔編號】G01N21/64GK103575717SQ201310571954
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月13日 優先權日:2013年11月13日
【發明者】彭洪尚, 王小卉 申請人:北京交通大學