一種抗除草劑莎稗磷的特異性抗體的製作方法

2023-06-07 22:42:31

專利名稱：一種抗除草劑莎稗磷的特異性抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及選擇一種具有-COOH的、又最大可能包含莎稗磷原有結構的化合物作為莎稗磷半抗原，並將半抗原製成抗原、進而產生抗體；以及此類半抗原、抗原的合成與抗體製備方法。本發明屬於生物技術領域。
背景技術：
除草劑是近20年來逐漸發展起來的一種農藥類型，隨著化學工業的發展，除草劑的品種也逐漸增多。在我國研製和投產的除草劑也已達數十種。有些除草劑具有致畸作用，除草劑的安全性已經引起人們的關注，應注意除草劑對環境的汙染和人畜毒性作用問題。使用除草劑能在糧食等中殘留，通過食物鏈而使人畜發生慢性危害作用。日本肯定列表制度《食品中農業化學品殘留限量食品卷/藥品卷》中莎稗磷在大米(糙米)中的檢測限為0.05mg/kg ;《食品中農用化學品殘留檢測方法增補本I》中莎稗磷的氣質測定低限為
0.025mg/kg ;《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準》(2008-09-04發布2009-03-16實施)中運用氣相色譜-質譜法對大米、糙米、大麥、小麥和玉米5中食品中110種農藥殘留進行測定其中莎稗磷的測定低限為0.0lmg/kg。然而，莎稗磷由於其分子量為367.84,小於IOOOdolton (道爾頓)，一般傳統上米用氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLC)或氣相色譜質譜法聯用等物化方法對其殘留進行檢測。雖然這些傳統的理化分析方法靈敏度較高，而且較為準確，但由於它們普遍操作繁瑣複雜、成本較高、分析速度慢，所以難於滿足實際分析的需要，因此迫切需要發展一種簡單、快速、靈敏的分析技術。而免疫分析技術正是一種快速、靈敏、操作簡單、費用低的檢測技術。其基本原理認為:抗原抗體的免疫反應涉及分子間的立體結構，電荷、氫鍵及範德華引力作用等諸多因素，具有極高特異性和靈敏性，遵循質量作用定律，不僅可體內進行，也可體外進行，這些特點使其能被利用建立免疫分析方法，可達到傳統理化分析技術無法達到的選擇性和靈敏度。所以，免疫分析為莎稗磷殘留研究提供了一條新的分析檢測途徑。

發明內容
本發明設計合成了小分子目標分析物半抗原，並與載體蛋白質偶聯，製備有效人工抗原，免疫動物製備對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應，從而定性定量的檢測樣本中超微量小分子目標物，可用於樣本測定。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和全抗原及抗體的製備。本發明為達到以上目的所設計的技術方案是合成分子結構式如下圖所示的莎稗磷半抗原，然後將半抗原與載體蛋白聯接合成人工抗原，免疫動物，獲得抗體。
權利要求
1.除草劑莎稗磷的人工抗原和抗體其特徵在於使用分子式為
2.權利要求1所述的除草劑莎稗磷人工抗原的製備方法，其特徵在於是用下述步驟製得: (1)N-氯乙醯基-N-異丙基-4-氯苯胺(CCPA)的合成 稱取5.859g N-異丙基對氯苯胺、28ml無水甲苯、3.57g三乙胺置於圓底燒瓶中，在室溫攪拌下，利用恆壓滴液漏鬥向其中逐滴滴加3.92g氯乙醯氯，控制滴加的速度使溫度保持在65°C以下，滴加完畢後，保持溫度在110°C回流5-6h，冷卻，過濾，用苯洗滌生成的三乙胺鹽酸鹽，濾液水洗至中性，無水硫酸鈉乾燥，過濾，得到一深色溶液，將深色溶液過矽膠柱純化，收集目標組分並旋蒸掉其中的大部分有機溶劑，室溫冷卻，析出的白色結晶即為N-氯乙醯基-N-異丙基-4-氯苯胺； (2)半抗原的合成 稱取2.25g氫氧化鈉溶解於18ml水中，向其中加入132.65mg巰基乙酸,攪拌15min後，向其中投入354.24mg的CCPA,回流2h,冷卻,用濃鹽酸酸化至pH =1.過濾,水洗,得到半抗原的白色固體； (3)稱取4.568mg半抗原於一棕色小瓶中，加入350 μ I 二甲基亞碸(DMSO)，超聲2h，半抗原溶解後再分別稱取8.711mg N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、6.242mg N，N_ 二環已基碳二亞胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，攪拌反應24h，離心出去沉澱，得到活化酯液； (4)人工抗原的合成 將上述活化酯液逐滴緩慢地加入到由20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解於4ml pH = 7.4的PBS緩衝液中所配置的溶液中，4°C反應過夜，反應產物於4°C、pH 7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)中透析三天，然後精確量取蛋白質偶聯物溶液的體積，測定濃度，分裝，_20°C保存；
3.權利要求1所述的莎稗磷酶標抗原的製備方法，其特徵在於是用下述步驟製得: 稱取1.02784mg半抗原於一棕色小瓶中，加入150 μ I 二甲基亞碸(DMSO)，超聲2h，半抗原溶解，再分別稱取1.96mg N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、1.4045mg N, N-二環已基碳二亞胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，攪拌反應24h，離心出去沉澱，得到活化酯液；然後準確稱取5mg的辣根過氧化物酶(HRP)溶解於2ml的NaHCO3溶液中，將上述的活化酯溶液於冰浴中緩慢加入到HRP溶液中，4°C條件下攪拌過夜。後用pH7.4磷酸鹽緩衝液透析3天，加入硫柳萊，4 C冰箱保存；
4.權利要求1所述的除草劑莎稗磷抗體的製備方法，其特徵在於是用下述步驟製得: 免疫動物選用雄性紐西蘭大白兔，免疫方法採用皮下和肌肉注射法，初免後進行四次加強免疫，加強免疫分別於初次免疫後2周、4周,6周和8周後免疫四次，免疫後9天由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測，具體做法是: 初次免疫:取Img按照權利要求2所述方法合成的人工抗原溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配製的溶液中，進行動物免疫； 加強免疫:用0.5mg上述人工抗原溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配製的溶液，進行動物免疫； 抗體純化:定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，採集血液，並離心獲 得抗血清，使用G-S^harose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，獲得抗莎稗磷的特異性抗體。
全文摘要
除草劑莎稗磷的半抗原、人工抗原和抗體的製備涉及具有除草劑莎稗磷基本結構的半抗原、人工抗原和抗體的製備。本發明以簡便的方法製備了特異性良好的除草劑莎稗磷的抗體。該抗體是以N-氯乙醯基-N-異丙基-4-氯苯胺與巰基乙酸合成半抗原，然後分別與牛血清白蛋白(BSA)和辣根過氧化酶(HRP)連接合成人工抗原和酶標抗原。人工抗原再經動物免疫，取血，分出抗血清，純化製得抗體。該抗體穩定，具有良好的特異性和靈敏度，且合成方法簡單，可用於環境、農產品和食品中除草劑莎稗磷殘留的快速免疫檢測，具有良好的應用前景。
文檔編號C07K16/44GK103073634SQ20111032628
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者王俊平, 王碩, 生威 申請人:天津科技大學